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采用DPPH法测定26种植物的抗氧化活性

采用DPPH法测定26种植物的抗氧化活性
采用DPPH法测定26种植物的抗氧化活性

抗氧化酶活性等测定方法

叶绿体得提取 一、试剂配置 1、PBS提取液:每L水依次加入MES(195.2×0。05=9、76g)、山梨糖醇(0。33×182。2=60。126g)、NaCl(0、010×58.5=0、585g)、MgCl(0.002×95=0、19g)、EDTA(292、25×0.002=0、5845g)、KH2PO4(200×0.0005=0、1g);使用时加入ASA—Na(198。1×0、002=0、3962g); 2、悬浮液:将PBS提取液中得MES换为238。3×0.05=11、915g得HEPES(238、3×0。05=11。915g); 3、80%Percol:80ml原液+20ml水;40%Percol:40ml原液+60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml), 悬浮液100ml(3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml); 80%Percol 200ml;40%Percol 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ml提取PBS(50mM MES PH6、1,含0、33M山梨糖醇,10mM NaCl,2mMMgCl2,2mM EDTA,0.5 mMKH2PO4,2mM ASA—Na,ASA—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,4层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液2000g 3min,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3min左右完成; 4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(50mM HEPES pH7。6,含0、33mM山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素2mg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、2000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Percol试剂进行梯度离心(将3ml含有80%Percol(原液按100%算)铺在10ml离心管下层,再把3ml 40%Percol铺在离心管中层,然后将1ml叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)1500g2-3min(用

抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法

抗氧化酶 S O D P O D C A T活性测 定方法 集团文件版本号:(M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988)

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法 酶液制备:取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液 (pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、12000g下离心20min,上清液即为酶液。 一、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法) 1、试剂的配制 (1)0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH7.8): A母液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na 2HPO 4 ·12H 2 O(分子量 358.14)71.7g; B母液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH 2PO 4 ·2H 2 O(分子量 156.01)31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS(pH7.8)的配制:分别取A母液(Na 2HPO 4 ) 228.75ml,B母液(NaH 2PO 4 ) 21.25ml,用蒸馏水定容至1000ml。 参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社,2000:267~268。 (2)130mM甲硫氨酸溶液:取1.9399g Met用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至100ml。 (3)100μM EDTA-Na 2溶液:取0.03721gEDTA-Na 2 用磷酸缓冲液定 容至1000ml。 (4)20μM核黄素溶液:取0.0753g核黄素用蒸馏水液定容至1000ml,避光保存。 (5)750uM 氮蓝四唑(NBT)溶液:取0.06133g NBT用PBS定容至100ml,避光保存。 2、酶活性测定 (1)取10ml试管(要求透明度好)

抗氧化活性测定方法的比较

抗氧化活性测定方法的比较 人体衰老和多种疾病均与自由基有关,寻找天然抗氧化剂具有重要意义。黄酮、多糖、多肽、酚类等生物活性成分均具有抗氧化活性,抗氧化活性的筛选方法可分为体外和体内2种测试体系。 体外:抗氧化活性可以用在特定条件下,样品对检测体系中自由基的清除能力、抗油脂过氧化能力及样品的还原能力、总抗氧化能力等来衡量和表征。常用的方法有羟基自由基(·OH)清除能力法、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH法)、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS 法)、超氧阴离子自由基法(O2-·)、邻苯三酚自氧化法、β-胡萝卜素漂白法、硫代巴比妥酸法、铁离子还原能力测定(FRAP法)、总酚测定法、ORAC法等方法。体内:主要有DNA氧化损伤法、蛋白质氧化损伤法、线粒体氧化损伤法。 其中DPPH法和ABTS法操作较简单便捷,不需要特殊的检测设备,只在需固定时间下记下其紫外分光光度测量值后计算其自由基清除率,缺点是不同物质具有组成和结构的差异,与DPPH·、ABTS+·的反应速率不同,反应到达平衡的时间不同,将反应时间固定在某一值时,可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断,且DPPH自由基会和其他自由基发生反应。邻苯三酚自氧化法缺点是检测波长、缓冲液的组成及pH值、邻苯三酚浓度等关键测定条件存在

着较大差异。β-胡萝卜素漂白法的缺点是β-胡萝卜素本身有抗氧化活性,对样品活性的测定结果有影响。FRAP法主要用于食品业,优点是简单易操作、可以重复,缺点是无法测定硫醇化合物的还原能力。ORAC法是国际上通用的评价食品氧化的标准方法,缺点是仪器成分较复杂,检测成本较高。 目前普遍使用的体外抗氧化活性指标一般都采用分光光度法,使用分光光度计测量各种颜色成分含量的变化。分光光度法操作较简单、便捷,不需要特殊的检测设备,只在需固定时间下记下其紫外-可见分光光度测量值后计算其活性大小,具有成本低、效率高、样品量少等优点。分光光度法缺点是会受到样本自身颜色和浑浊度的影响和限制,颜色深的样品测得的数据误差大,甚至得到错误的结果;不同物质组成和结构存在差异,与各种自由基的反应速率不同,反应到达平衡的时间不同,将反应时间固定在某一值时,可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断。外界环境因素对实验结果也存在一定程度的影响,有些抗氧化活性实验在冬天低温时不易成功,测得的数据往往没有规律。 我觉得在测定样品的抗氧化活性时,各种方法都有自己的优缺点,要根据需测物质来决定用什么方法,比如DPPH 法的自由基选择性强,不和只有一个羟基的芳香酸、无羟基的类黄酮反应,这类物质需用其他方法测定。若对检测结果

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法 一、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法) 1、试剂的配制 (1)L磷酸缓冲液(PBS,: A母液:L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O(分子量)71.7g; B母液:L磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4·2H2O(分子量)31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 L PBS()的配制:分别取A母液(Na2HPO4) ,B母液(NaH2PO4) ,用蒸馏水定容至1000ml。参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社,2000:267~268。 (2)甲硫氨酸溶液:取 Met用磷酸缓冲液()定容至1000ml。 (3)30μM EDTA-Na2溶液:取用磷酸缓冲液定容至100ml。 (4)60μM核黄素溶液:取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。 (5)氮蓝四唑(NBT)溶液:取 NBT用PBS定容至100ml,避光保存。 酶液制备:取(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液()在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、12000g下离心20min,上清液即为酶液。 2、酶活性测定 (1)反应混合液配制(以60个样为准):分别取Met溶液162ml,EDTA-Na2溶液,磷酸缓冲液,NBT溶液6ml,核黄素溶液6ml,混合后摇匀; (2)分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中 (3)将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min; 同时做两支对照管,其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS(不加酶液)照光后测定作为最大光还原管,另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。 (4)以不照光的对照管(只有缓冲液并置于暗处)调零后,避光测OD560(出现颜色即可测定)。 (5)酶活性计算:SOD活性单位以抑制NBT光化还原50%所需酶量(测的样品值要在

抗氧化剂抗氧化活性的测定方法

1.抗氧化剂是指在低浓度下能有效延缓或阻止底物氧化的物质。被氧化的底物包括蛋白质、脂质、糖和DNA。 2.初始型抗氧化剂(AH)可通过与脂质自由基L.、过氧自由基LOO.或烷氧自由基LO.反应抑制脂质氧化链反应。 L.+ AH--- LH + A. LOO.+ AH--- LOOH + A. LO.+ AH--- LOH + A. 抗氧化剂自由基A.也能与过氧自由基、烷氧自由基反应从而终止脂质氧化反应。 LOO.+ A.---LOOA LO.+ A.---LOA 次级型抗氧化剂可通过各种机理延缓脂质氧化,如螯合过渡金属、给初始型抗氧化剂补充氢、清除氧以及使活性物质失活等。 抗氧化剂的活性分为在生物体外(如食品中)的活性和在生物体内的活性。本文综述了体外测定抗氧化剂抗氧化活性的方法,不包括在生物体中测定生物活性的方法。 3.评价或表征抗氧化活性的方法为了说明在特定条件下被测物抑制底物氧化的效力或清除自由基的能力 实际测定时至少要说明在测试条件下被测物是抗氧化剂还是促氧化剂;在指定浓度下比较不同测试材料(如被测物与标准抗氧化剂或添加有被测物的测试体系与空白体系)对底物的作用。 评价或表征抗氧化活性的方法有: (1)在指定的时间测量氧化产物或官能团的浓度或吸光度值;( 2)测量反应的速率;

( 3)测量诱导期(延滞期)或氧化达到一定程度所需的时间;( 4)测量速度的积分(即动力学曲线下的面积) ; ( 5)测量被测物产生与标准抗氧化剂相当作用的浓度。4.参数 4.1诱导期( induction period) 诱导期tIND(也叫延滞期, lag period)常定义为化学反应的速度。诱导期是一个相当不确定的值,受检测方法、使用仪器的灵敏性以及一些其他因素的影响。对于脂质氧化,诱导期通常是指链增长阶段动力学曲线的切线和时间轴的交点。 4.2抑制率( percentag e of inhibition)和IC50 抑制率和IC50 (抗氧化剂提供50%抑制作用时的浓度,也可用EC50表示的)常用来表征抗氧化能力。它们不仅与被测抗氧化剂的反应性能和氧化的底物有关,而且受其他因素的影响,如脂质氧化链反应的长度和抑制速率等。此外,用IC50表征抗氧化剂 的活性与比较活性的时间点有关。只有在其他参数相同的情况下,在某一研究中测得的抑制率和IC50才可以与另一研究中测得的值进行直接比较。TEC50是指抗氧化剂提供50%抑制作用所需的时间,也常用来表征抗氧化活性 5.对测定方法的要求 测定抗氧化剂抗氧化活性的方法应满足如下要 求: ( 1)能说明测试体系中发生的反应,并能用明确的动力学图解描述;( 2)测试要有再现性; ( 3)测试效率要足够高; ( 4)方法要相对简单; ( 5)能连续检测; ( 6)应使用与体内或食品有关的活性自由基;

抗氧化活性测定方法

抗氧化方法 一、Determination of Superoxide Anion Scavenging Ability(超氧阴离子清除能 力) 1、determined by a CL method in the pyrogallol-luminol system on a BPCL Ultra-weak luminescence analyzer。(焦性没食子酸-发光胺,荧光检 测) 2、步骤:10μL sample (不同浓度) + 50 μL焦棓酸(6.25*10-4 mol/L) + 0.94 mL of a mixture containing luminol (0.05 mol/L) and carbonate buffer (pH 10.2) (发光胺用pH 10.2碳酸盐缓冲液配成0.05 mol/L) 3、Hi-V, 800; Kv, -1; the spectral range of CL(波长范围)180-800 nm; 温 度:30 ° C.总时间:300S,每2S读数一次。 4、对照:不加样品(样品用水代替)。空白不加焦棓酸(用来调零)。 二、Determination of Scavenging Ability on Hydroxide Radicals(羟基自由基清除能力) 1、CuSO4-Phen-Vc-H2O2 CL system(1 mL体系) 2、50 μL of sample solution (样品液)+ 50 μL of a 1.0 mmol/L CuSO4 solution (CuSO4 溶液)+ 50 μL of a 1 mmol/L 1,10-phenanthroline solution(邻二氮菲溶液)+ 700 μL of a 0.05mol/L borate buffer (pH 9.0) (硼酸缓冲液)+ 100 μL of a 1 mmol/L ascorbate solution + 50 μL of a 0.15% H2O2 solution 3、总时间400S,间隔3S。Hi-V, 800; Kv, -1; the spectral range of CL(波长范围)180-800 nm; 温度:30 ° C. 4、阳性对照:不加样品(样品用水代替)。空白不加H2O2(用来调零)。 三、Determination of Scavenging Effect on Hydrogen Peroxide(过氧化氢清除 能力) 1、luminol-H2O2 system

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidase ,APX)活性测定试剂盒 使用说明

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidase ,APX)活性测定试剂盒使用说明 微量法100T/96S 产品简介: APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一,也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶,分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体,以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化H 2O 2氧化AsA,是植物AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到AsA 的含量,在胁迫和解胁迫条件下,APX 与AsA 具有一定的负相关性。 APX 催化H 2O 2氧化AsA,通过测定AsA 的氧化速率,可计算得APX 活性。 试验中所需的仪器和试剂: 低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。 产品内容: 试剂一:液体×2瓶,4℃保存。 试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加3mL 蒸馏水充分溶解。 试剂三:液体×1支,4℃保存。 操作步骤: 一、粗酶液提取: 称取约0.1g 样品,加1mL 试剂一,冰上充分研磨,13000g 4℃离心20min,取上清液。 二、测定操作表: 1.分光光度计预热30min 以上,调节波长到265nm,用蒸馏水调零。 2.试剂一在25℃中预热30min 以上。 3.空白管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL 蒸馏水、140μL 预热的试

剂一、20μL试剂二和20μL试剂三,迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。 4.测定管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、140μL预热的试剂 一、20μL试剂二和20μL试剂三,迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。 APX活力计算: a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 (1)按蛋白浓度计算 活性单位定义:每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr (2)按样本鲜重计算 活性单位定义:每克样品每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/g鲜重)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Wε:AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104L/mol/cm;d:比色皿光径(cm),1cm;V反总:反应体系总体积(L),200μL=2×10-4L;106:1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒;W:样品质量;V样:加入反应体系中上清液体积(mL),20μL=0.02mL;V样总:提取液体积,1mL;T:催化反应时间(min),2min。 b.使用96孔板测定的计算公式如下 (1)按蛋白浓度计算 活性单位定义:每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.1848×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr (2)按样本鲜重计算 活性单位定义:每克样品每分钟氧化1μmol AsA为1U。

超氧化物歧化酶活性的测定

植物组织中超氧化物歧化酶和平测定方法 【实验目的】 1. 了解还原法测定抗氧化酶活性测定的原理方法。 2. 熟悉植物叶片中ROS 去除机制。 【实验原理】 超氧化物歧化酶(SOD )普遍存在于动植物与微生物体内。SOD 是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD :Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 。SOD 能够清除超氧阴离子自由基 (O 2—),它与CAT 、POD 等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害,从而减少自由基对机体的毒害。 超氧阴离子自由基(O 2—)是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基,生成H 2O 2和O 2。生成的H 2O 2可被过氧化氢酶分解为O 2和H 2O : 2 O 2—+ 2H + H 2O 2+O 2 2 H 2O 2 O 2+H 2O 超氧自由基非常不稳定,寿命极短,一般用间接方法测定SOD 活性。本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑(NBT )在光下的还原作用来确定酶活性的大小。有氧化物质存在时,核黄素可在光照条件下还原。被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2—。当加入NBT 后,在光照条件下O 2—又可将NBT 还原为蓝色的甲腙,后者在560nm 处有最大光吸收。 当加入SOD 时,SOD 可通过清除O 2—,而抑制NBT 的光还原反应,使蓝色甲腙生成速度减慢。于是,进行光还原反应后,反应液蓝色越深,说明酶的活性越低,反之酶的活性越高。抑制NBT 光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系,据此可以计算出酶活性的大小。常常将抑制50%的NBT 光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位(U )。 【器材与试剂】 1. 实验仪器与用具 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、微量移液枪、刻度移液管、离心管、光照箱(光照度为4000lx )、容量瓶(10ml )、试管 2. 实验试剂 50mmol/L 磷酸缓冲液(pH7.8); 130mmol/L 甲硫氨酸(MET )溶液; 750μmol/L 氮蓝四唑(NBT )溶液; 100μmol/L EDTA- Na 2溶液; CAT SOD

抗氧化物活性测定方法总结

抗氧化物活性测定方法(倾向于考虑DPPH法和ORAC法) 1.FRAP法:铁离子还原抗氧化能力测定法[1] FRAP(ferric ion reducing antioxidant power)方法,在低pH值的溶液中, Fe3+-TPTz(Fe3+-三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成有色的Fe2+-TPTZ。反应的结果常以Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力表示。 该法快速简便、易于操作、重复性好,但FRAP反应属于电子转移(SET)反应,因此FRAP方法不能够测定氢转移反应(HAT)起作用的物质。而且该法实际测定的是待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力,因此没有抗氧化能力的生物学相关性。 2.TEAC法(trolox equivalent antioxidant capacity) ABTS(2,2'-amino-di(2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt,2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐)与过氧化物酶和氢过氧化物在一起形成ABTS+阳离子自由基。在抗氧化剂存在时,这种自由基混合物的光吸收值下降,下降程度取决于抗氧化剂的抗氧化能力,测得的结果以TEAC表示,即被测抗氧化剂清除ABTS·+的能力(吸光度大小的变化)与标准抗氧化剂trolox(VE的水溶性类似物)清除ABTS·+的能力的比值。 TEAC法十分简单,适用于大量样品的分析检测。但是,ABTS·+并非生理自由基,缺乏生理相关性,而且与FRAP方法相似,ABTS·+与不同抗氧化剂问的氧化反应时间不同,因此,只能定性不能定量评价样品的抗氧化能力。 3.DPPH法[2,3](2,2-diphenyt-l-picrylhydrazyl radical scavenging capacity) DPPH·(二苯代苦味肼基自由基)法是较常用的方法之一。DPPH·是一种稳定的以氮为中心的自由基,其醇溶液呈深紫色,在517nm 处有一吸收峰。当反应系统中存在自由基清除剂时,它可以和DPPH·的单电子配对而使517nm 处的吸收峰渐渐消退。而且,这种颜色变浅的程度与配对电子数成化学计量关系。因此,根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的活性。通过计算DPPH自由基剩余一半时所需抗氧化剂的浓度(EC50)以及时间(TEC50)反应抗氧化物的活性。 DPPH法快速、简单,仅需要一台紫外分光光度计就可以测定,但DPPH方法存在的不足是,当被测物与DPPH紫外吸收有重叠时,将会影响测定结果,比如类胡萝卜素。此外,由于空间位阻决定反应的倾向,小分子化合物由于更易接近自由基而拥有相对较高的抗氧化能力。此外该方法线性范围也相对较窄,而且所有还原剂都能够对DPPH起作用,因此结果并不能完全代表抗氧化能力。

抗氧化酶测定实验方法

植物组织中丙二醛(MDA)含量的测定 一、原理 植物器官衰老或在逆境下遭受伤害,往往发生膜脂过氧化作用,丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物,其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置释放出后,可以与蛋白质、核酸反应,从而丧失功能,还可使纤维素分子间的桥键松驰,或抑制蛋白质的合成。因此,MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。 丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标,在酸性和高温度条件下,可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3,5,5—三甲基恶唑-2,4。二酮),其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰,其中最主要的是可溶性糖,糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm,但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加,因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值,所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子,通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1,根据植物样品量和提取液的体积,加入Fe3+的终浓度为0.5umol·L-1。 二、方法直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。不同浓度的蔗糖(0—25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在 450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关,配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后,测定上述三个波长的吸光度值,求其直线方程,可求算糖分在532nm处的吸光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为: Y532=-0.00198十0.088D450 (44—1) D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。三、材料、仪器设备及试剂1、[仪器设备]紫外可见分光光度计1台;离心机1台;电子天平1台;10ml离心管4支;研钵2套;试管4支;刻度吸管:10ml1支,2ml1支;剪刀1把。

抗氧化活性测定方法的比较 ()

抗氧化活性测定方法的比较人体衰老和多种疾病均与自由基有关,寻找天然抗氧化剂具有重要意义。黄酮、多糖、多肽、酚类等生物活性成分均具有抗氧化活性,抗氧化活性的筛选方法可分为体外和体内2种测试体系。 体外:抗氧化活性可以用在特定条件下,样品对检测体系中自由基的清除能力、抗油脂过氧化能力及样品的还原能力、总抗氧化能力等来衡量和表征。常用的方法有羟基自由基(·OH)清除能力法、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH法)、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS法)、超氧阴离子自由基法(O2-·)、邻苯三酚自氧化法、β-胡萝卜素漂白法、硫代巴比妥酸法、铁离子还原能力测定(FRAP法)、总酚测定法、ORAC法等方法。体内:主要有DNA氧化损伤法、蛋白质氧化损伤法、线粒体氧化损伤法。 其中DPPH法和ABTS法操作较简单便捷,不需要特殊的检测设备,只在需固定时间下记下其紫外分光光度测量值后计算其自由基清除率,缺点是不同物质具有组成和结构的差异,与 DPPH·、ABTS+·的反应速率不同,反应到达平衡的时间不同,将反应时间固定在某一值时,可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断,且DPPH自由基会和其他自由基发生反应。邻苯三酚自氧化法缺点是检测波长、缓冲液的组成及pH值、邻苯三酚浓度等关键测定条件存在着较大差异。β-胡萝卜素漂白法的缺点是β-胡萝卜素本身有抗氧化活性,对样品活性的测定结果有影响。FRAP法主要

用于食品业,优点是简单易操作、可以重复,缺点是无法测定硫醇化合物的还原能力。ORAC法是国际上通用的评价食品氧化的标准方法,缺点是仪器成分较复杂,检测成本较高。 目前普遍使用的体外抗氧化活性指标一般都采用分光光度法,使用分光光度计测量各种颜色成分含量的变化。分光光度法操作较简单、便捷,不需要特殊的检测设备,只在需固定时间下记下其紫外-可见分光光度测量值后计算其活性大小,具有成本低、效率高、样品量少等优点。分光光度法缺点是会受到样本自身颜色和浑浊度的影响和限制,颜色深的样品测得的数据误差大,甚至得到错误的结果;不同物质组成和结构存在差异,与各种自由基的反应速率不同,反应到达平衡的时间不同,将反应时间固定在某一值时,可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断。外界环境因素对实验结果也存在一定程度的影响,有些抗氧化活性实验在冬天低温时不易成功,测得的数据往往没有规律。 我觉得在测定样品的抗氧化活性时,各种方法都有自己的优缺点,要根据需测物质来决定用什么方法,比如DPPH法的自由基选择性强,不和只有一个羟基的芳香酸、无羟基的类黄酮反应,这类物质需用其他方法测定。若对检测结果要求高的可用ORAC法,若是做两个活性物质的抗氧化活性的对比可用多种方法测定后综合比较。在实际应用中,要根据样品的物理、化学特征灵活采用多种方法综合评价其抗氧化活性,使实验结果更加客观和真实。

抗氧化活性实验方法

抗氧化活性实验方法(体外实验) 1、清除DPPH自由基能力的测定 称取一定量的DPPH,用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液。分别取2mL不同浓度(2,4,6,8mg/mL)的溶液,加入2mL DPPH溶液,混合均匀,室温放置30min后,5000r/min离心10min。取上清液于517nm处测吸光值。用Vc作为阳性对照。样品对DPPH 自由基的清除率用以下公式计算: DPPH () 12 1100% A A A - =-? 清除率 A0—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值; A1—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值; A2—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。 2、总还原能力的测定 在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和不同浓度(2,4,6,8mg/mL)的溶液1mL,加入2.5 mL 1%铁氰化钾,混合均匀后于50℃反应20min。取出后加入2.5mL 10%三氯乙酸终止反应,5000r/min离心10min。取上清液2.5mL,加入2.5mL 蒸馏水和0.5mL FeCl3,混匀后静置10min,在700nm处检测吸光值。Vc作为阳性对照。 3、对Fe2+离子螯合能力的测定 分别取1mL不同浓度(2,4,6,8mg/mL)的溶液和3.7mL蒸馏水,加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL,25℃水浴10min,于562nm处测吸光值。EDTA为阳性对照。样品对Fe2+的螯合率计算公式如下: Fe2+ () 12 1100% A A A - =-? 螯合率 A0—1mL蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值; A1—样品溶液反应后的吸光值; A2—0.1mL的蒸馏水代替反应体系中FeCl2溶液后的吸光值。 4、超氧自由基(O2-)清除率的测定 采用邻苯三酚自氧化法测定。取50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2)4.5mL,置25℃水浴中保温20min,分别加入1mL样品溶液和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液,混匀后于25℃水浴中反应5min,加入1mL 8mmol/L HCl终止反应,于299nm处测定吸光度(A x),空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。按下式计算O2-清除率:

抗氧化酶活性等测定方法

实用文档 文案大全叶绿体的提取 一、试剂配置 1、PBS提取液:每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl (0.010×58.5=0.585g)、MgCl(0.002×95=0.19g)、EDTA(292.25×0.002=0.5845g)、KH2PO4(200×0.0005=0.1g);使用时加入ASA-Na(198.1×0.002=0.3962g); 2、悬浮液:将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES(238.3×0.05=11.915g); 3、80%Percol:80ml原液+20ml水;40%Percol:40ml原液+60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml), 悬浮液100ml(3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml); 80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.(3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ml提取PBS(50mM MES PH6.1,含0.33M山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0.5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,4层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体 膜破碎) 3、滤液2000g 3min,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2-3min左右完成; 4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(50mM HEPES pH 7.6,含0.33 mM山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0.5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷, 或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶 绿体悬浮时要浓点,含叶绿素2mg.ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、2000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Percol试剂进行梯度离心(将3ml含有80%Percol(原液按100%算)铺在10ml离心管下层,再把 3ml 40%Percol铺在离心管中层,然后将1ml叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)1500g 2-3min(用水平离心头的离心机,离心机加速要缓慢上升,加速度调到1),下降也要缓慢下降,否则会破碎Percol的浓度梯度层的形成,取出会看到3层绿色带,最上层为破碎的叶绿体,沉在地层的为粗颗粒,40-80%的Percol 之间的界面有一层绿色层为完整的叶绿体; 9、小心吸出,转移到悬浮介质中,使叶绿体浓度达到1mg.ml-1;(计算:取叶绿体悬浮液0.1ml,加4.9 ml 80%的丙酮,摇匀后于1000g离心2min,上清液置于1cm的比色杯,在625nm上比色,按照公式计算:OD625nm×50/34.5=叶绿素mg/ml) 10、测定叶绿体的完整性,完整率达到85-95%; 参考:Takeda K, Otaubo T,Konda N. Participation of hydrogen peroxide in the inactivation of Calvin-cycle SH enzyme in so2-furmugated spinach leaves. Plant and cell Physiology,1982,23:1009-1018.

总抗氧化能力检测试剂盒 (FRAP 法 )

总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法) 产品编号产品名称包装 S0116 总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法) 100次 产品简介: 总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法),即Total Antioxidant Capacity Assay Kit with FRAP method,简称T-AOC Assay Kit,是一种采用Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP)方法,可以对血浆、血清、唾液、尿液等各种体液,细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力进行检测的试剂盒。 活性氧(Reactive oxygen species, ROS)主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢。在细胞或组织的正常生理代谢过程中会产生活性氧,同时一些环境因子例如紫外照射、γ射线照射、吸烟、环境污染等也可以诱导活性氧的产生。活性氧产生后,可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤,诱发氧化应激(Oxidative stress),继而导致各种肿瘤、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、糖尿病、肝损伤、以及中枢神经系统疾病等。 机体中存在多种抗氧化物,包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等,可以清除体内产生的各种活性氧,以阻止活性氧诱导的氧化应激(oxidative stress)的产生。一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力。因此测定血浆、血清、尿液、唾液等各种体液,细胞或组织等裂解液中的总抗氧化能力具有非常重要的生物学意义。 植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物溶液的总抗氧化能力的检测可以用于检测各种溶液的抗氧化能力的强弱,可以用于筛选强抗氧化能力的药物。 FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ,随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。由于反应在酸性条件下进行,可以抑制内源性的一些干扰因素。并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10μM,因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的,样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。 Antioxidant Fe3+-TPTZ ——————> Fe2+-TPTZ (蓝色) 提供了抗氧化物Trolox作为对照。Trolox是一种维生素E的类似物,水溶性较好,抗氧化能力和维生素E相近。 本试剂盒方便快捷,加入待测样品后3-5分钟即可进行吸光度测定,通常10-20个样品可以在十多分钟内检测完毕。 本试剂盒可以检测100个样品。 包装清单: 产品编号产品名称包装 S0116-1 TPTZ稀释液 15ml S0116-2 TPTZ溶液 1.5ml S0116-3 检测缓冲液 1.5ml S0116-4 FeSO4·7H2O 200mg S0116-5 Trolox溶液 (10mM) 0.1ml —说明书1份 保存条件: -20℃保存,一年有效。其中S0116-2 TPTZ溶液,S0116-3 检测缓冲液和S0116-5 Trolox溶液 (10mM)需避光保存。 注意事项: 在酸性条件下呈蓝色或接近蓝色的试剂会对本试剂盒的检测产生干扰,需尽量避免。 如果样品中含有外加的较高浓度的铁盐或亚铁盐,会干扰测定。但血浆、血清、细胞或组织裂解液等样品中含有的微量的铁盐或亚铁盐不会干扰测定。 样品中不能添加DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的物质,也不宜添加Tween、Triton和NP-40等去垢剂。 测定时需可以测定A593的酶标仪一台(测585-605nm也可以)或可以测定微量样品的分光光度计一台。 TPTZ对人体有刺激性,请注意适当防护。 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

抗氧化活性测定方法的比较

抗氧化活性测定方法的比较人体衰老和多种疾病均与 自由基有关,寻找天然抗氧化剂具有重要意义。黄酮、多糖、多肽、酚类等生物活性成分均具有抗氧化活性,抗氧化活性的筛选方法可分为体外和体内2 种测试体系。体外:抗氧化活性可以用在特定条件下,样品对检测体系中自由基的清除能力、抗油脂过氧化能力及样品的还原能力、总抗氧化能力等来衡量和表征。常用的方法有羟基自由基(?0H清除能力法、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH法)、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS法)、超氧阴离子自由基法(02-?)、邻苯三酚自氧化法、B -胡萝卜素漂白法、硫代巴比妥酸法、铁离子还原能力测定(FRAP法)、总酚测定法、0RAC法等方法。体内:主要有DNA氧化损伤法、蛋白质氧化损伤法、线粒体氧化损伤法。 其中DPPH法和ABTS法操作较简单便捷,不需要特殊的检测设备,只在需固定时间下记下其紫外分光光度测量值后计算其自由基清除 率,缺点是不同物质具有组成和结构的差异,与DPPH、ABTS+-的反应速率不同,反应到达平衡的时间不同,将反应时间固定在 某一值时,可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断,且DPPH 自由基会和其他自由基发生反应。邻苯三酚自氧化法缺点是检测波长、缓冲液的组成及pH值、邻苯三酚浓度等关键测定条件存在着较大差异。B-胡萝卜素漂白法的缺点是B -胡萝卜素 本身有抗氧化活性,对样品活性的测定结果有影响。FRAP法主要用于食品业,优点是简单易操作、可以重复,缺点是无法测定硫醇化合物的还原能力。ORAC法是国际上通用的评价食品氧化的标准方法,缺点

是仪器成分较复杂,检测成本较高。 目前普遍使用的体外抗氧化活性指标一般都采用分光光度法,使用分光光度计测量各种颜色成分含量的变化。分光光度法操作较简单、便捷,不需要特殊的检测设备,只在需固定时间下记下其紫外- 可见分光光度测量值后计算其活性大小,具有成本低、效率高、样品量少等优点。分光光度法缺点是会受到样本自身颜色和浑浊度的影响和限制,颜色深的样品测得的数据误差大,甚至得到错误的结果;不同物质组成和结构存在差异,与各种自由基的反应速率不同,反应到达平衡的时间不同,将反应时间固定在某一值时,可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断。外界环境因素对实验结果也存在一定程度的影响,有些抗氧化活性实验在冬天低温时不易成功,测得的数据往往没有规律。 我觉得在测定样品的抗氧化活性时,各种方法都有自己的优缺点,要根据需测物质来决定用什么方法,比如DPPH法的自由基选择性强,不和只有一个羟基的芳香酸、无羟基的类黄酮反应,这类物质需用其他方法测定。若对检测结果要求高的可用ORAC法,若是做两个活性物质的抗氧化活性的对比可用多种方法测定后综合比较。在实际应用中,要根据样品的物理、化学特征灵活采用多种方法综合评价其抗氧化活性,使实验结果更加客观和真实。

抗氧化活性测定方法

一、抗氧化测定 1.DPPH: a)样品溶液浓度初测定,(0~4℃)储藏。 b)称4mg,加无水甲醇溶解于烧杯,转移至100mL容量瓶定容。 浓度为0.04mg/mL。避光(0~4℃)储藏。 i.5ml离心管(2mlDPPH·溶液+2ml无水甲醇)混合后充分振摇, 反映稳定,40min后测定。以无水甲醇为对照分光检测λ =517nm。平行测定2次。A1 ii.5ml离心管(2ml待测样+2mL无水甲醇)混合后充分振摇,反映稳定,40min后测定。以无水甲醇为对照分光检测λ =517nm。A2 iii.5ml离心管(2mlDPPH·溶液+2ml待测样)混合后充分振摇,反映稳定,40min后测定。以无水甲醇为对照分光检测λ =517nm。A3 清除率(Y)=[1-(A3-A2)/A1]?100%。 平行测定3次,取平均值。分别以试样质量浓度和清除率做显形回归方程并计算清除率为50%时,代测样品的浓度值,即半抑制浓度IC50。自由基清除能力,AE=1/IC50。根据AE大小判断待测样品清除自由基能力的大小,AE越大清除能力越强。 2.·OH a)PBS制配:磷酸二氢钠31.2g 1000ml蒸馏水定容,磷酸氢二钠71.6g 1000ml蒸馏水定容。移液管移液磷酸二氢钠190ml、磷酸氢二钠

810ml 于1000ml 烧杯,pH 计调7.4。 b) 邻二氮菲:148mg 蒸馏水定容100ml 。 c) 硫酸亚铁:208.5mg 蒸馏水定容100ml 。 d) 100ml30%双蒸馏水定容300ml 。封口。 i. 10ml 离心管(0.5ml 邻二氮菲溶液+1mlPBS 混匀后+0.5ml 硫酸亚 铁混匀后+0.5ml 22O H +双蒸馏水定容10ml )37℃水浴1h 后分光λ =536nm 。A1 ii. 10ml 离心管(0.5ml 邻二氮菲溶液+1mlPBS 混匀后+0.5ml 硫酸亚 铁混匀后+双蒸馏水定容10ml )37℃水浴1h 后分光λ=536nm.A2 iii. 10ml 离心管(0.5ml 邻二氮菲溶液+1mlPBS 混匀后+0.5ml 待测样 +0.5ml 硫酸亚铁混匀后+0.5ml 22O H +双蒸馏水定容10ml )37℃水 浴1h 后分光λ=536nm.A3 iv. 10ml 离心管(1mlPBS+双蒸馏水定容10ml )37℃水浴1h 后分光 λ=536nm.A 空。 清除率(Y )=(A3-A1)/(A2-A1)?100% 平行测定3次,取平均值。分别以试样质量浓度和清除率做显形回归方程并计算清除率为50%时,代测样品的浓度值,即半抑制浓度IC50。自由基清除能力,AE=1/IC50。根据AE 大小判断待测样品清除自由基能力的大小,AE 越大清除能力越强。 3.- 2O ·: a) 磷酸二氢钠31.2g 1000ml 蒸馏水定容,磷酸氢二钠71.6g 1000ml 蒸馏水定容。用滴管取磷酸二氢钠加入到磷酸氢二钠中,边加边

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