HTRF技术原理和应用介绍

Cisbio-HTRF?技术原理与应用简介

HTRF?(均相时间分辨荧光,Homogeneous Time-Resolved Fluorescence )就是一种用来检测纯液相体系中待测物的技术。该技术基于荧光共振能量转移(FRET,Fluorescence Resonance Energy Transfer)与时间分辨荧光(TRF, Time-Resolved Fluorescence))两大技术,开通的一款高通量药物筛选利器。

荧光共振能量转移(FRET)

利用两种荧光基团的能量转移,这两种荧光基团分别称为能量供体(Donor)与能量受体(Acceptor)。Donor被外来光源激发(例如氙灯或激光),如果它与Acceptor比较接近,可以将能量共振转移到在Acceptor上,使其受到激发,发出特定波长的发射光。

将Donor与Acceptor分别与相互作用的两个生物分子结合,生物分子的结合可以将Donor与Acceptor拉到足够近的距离,产生能量转移,由于Acceptor的发射光来自能量转移,所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开,即不需要洗涤步骤。

时间分辨荧光(TRF)

TRF利用稀土元素中镧系元素的独特性质,它们与普通荧光的主要区别就是荧光的持续时间不同。普通荧光的半衰期为纳秒级。镧系元素的半衰期为毫秒级,有6个数量级的差别。所以,在检测室,TRF有一个时间延迟---50us,经过这个时间延迟,普通荧光的信号几乎为零,所以,TRF的背景非常低,反映样品实际情况。

HTRF?的能量受体(技术创新点)

HTRF?的能量供体就是铕(Eu)与钛(Tb)的穴状化合物。在这个穴状化合物里,Eu与Tb被永久地嵌合在一个笼子里,结构非常稳定,这个结构由J、M、Lehn’s教授发明的,并由此在1987年获得了诺贝尔奖。

HTRF?的能量受体

HTRF?的能量受体也有二种,XL665与d2、它们的光学性质相同,分子量不同,前者分子量为10KD,实际上就就是别藻蓝蛋白(APC)。我们将APC的亚基偶联在一起,使其不能解离,提高了稳定性,后者分子量为1KD,在某些实验中有独特的优势。

HTRF?的操作步骤

HTRF?操作步骤非常简单,只需要将实验所需试剂加进去,然后孵育,检测即可。

HTRF?实验数据分析

HTRF?采用了比值法来处理数据,可以去除溶液通透率、细胞大小、细胞数量不同引起的误差。

HTRF?应用范围

受体第二信使检测受体配体结合

胞内信号分子检测胞外激酶活性检测

胞内激酶活性检测基于抗体的夹心法与竞争法检测

抗体重链含量检测抗体轻链含量测定GST含量测定CD16结合检测

HIS含量测定CD32结合检测

CHO宿主蛋白含量测定CD64结合检测

PD1/PD-L1 CTLA4/B7-1

LAG3/MHC II CD47 / SIRP alpha

CTLA4/B7-2 Adenosin A2A

蛋白-蛋白/ 蛋白-多肽蛋白-DNA / 蛋白-RNA 蛋白甲基化/ 蛋白乙酰化

蛋白泛素化/ 蛋白水解

univlab@univ-bio、com

HTRF?技术优势:

1、操作简单,空板直接加样,加完即可检测,时间短(加样与孵育2h)！