沙门氏菌检测
沙门氏菌检测
1 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
1.1 冰箱：2℃～5℃。
1.2 恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。
1.3 均质器。
1.4 振荡器。
1.5 电子天平：感量0.1g。
1.6 无菌锥形瓶:容量500ml，250ml。
1.7 无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。
1.8 无菌培养皿：直径90mm。
1.9 无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。
1.10 无菌毛细管。
1.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
1.12 全自动微生物生化鉴定系统。
2 培养基和试剂
2.1 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录中1。
2.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录中2。
2.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录中3。
2.4 亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录中4。
2.5 HE琼脂：见附录中5。
2.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录中6。
2.7 沙门氏菌属显色培养基。
2.8 三糖铁（TSI）琼脂：见附录中7。
2.9 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录中8。
2.10 尿素琼脂（pH7.2）：见附录中9。
2.11 氰化钾（KCN）培养基：见附录中10。
2.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录中11。
2.13 糖发酵管：见附录中12。
2.14 邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录中13。
2.15 半固体琼脂：见附录中14。
2.16 丙二酸钠培养基：见附录中15。
2.17 沙门氏菌O和H诊断血清。
2.18 生化鉴定试剂盒。
3 操作方法
3.1 试验前准备
3.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量，避免操作中出入操作间。
3.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。
3.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。
3.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。
3.2 前增菌
称取25g（ml）样品放入盛有225ml BPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min 均质1min～2min，或置于盛有225ml BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1mol/ml无菌NaOH
或HCl调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500ml锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8 h～18h。如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃～5℃不超过18h解冻。
3.3 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1ml，转种于10ml TTB内，于42℃±1℃培养18 h～24h。同时，另取1ml，转种于10ml SC内，于36℃±1℃培养18h～24h。
3.4 分离
分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落。各个平板上的菌落特征见表1。
表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
3.5 生化试验
3.5.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。
表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果
3.5.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。
表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
3.5.2.1 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3 项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。
表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
3.5.2.2 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
3.5.2.3 反应序号A3：补做ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性。甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
3.5.2.4 必要时按表5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。
表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别
3.5.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据3.5.1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
3.6 血清学鉴定
3.6.1 抗原的准备
一般采用1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2％～3％）培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管1 次～2次，自远端取菌培养后再检查。
3.6.2 多价菌体抗原（O）鉴定
在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。
3.6.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定同3.6.2。
3.7 结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（ml）样品中检出或未检出沙门氏菌。
附录培养基和试剂
1 缓冲蛋白胨水（BPW）
1.1 成分
蛋白胨10.0g
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钠（含12 个结晶水）9.0g
磷酸二氢钾 1.5g
蒸馏水1000ml
pH 7.2±0.2
1.2 制法
将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121 ℃，15min。
2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液
2.1 基础液
蛋白胨10.0g
牛肉膏 5.0g
氯化钠 3.0g
碳酸钙45.0g
蒸馏水1000ml
pH 7.0±0.2
除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节pH，高压灭菌121℃，20 min。
2.2 硫代硫酸钠溶液
硫代硫酸钠（含5个结晶水）50.0g
蒸馏水加至100ml
高压灭菌121℃，20 min。
2.3 碘溶液
碘片20.0g
碘化钾25.0 g
蒸馏水加至100 ml
将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。
2.4 0.5％煌绿水溶液
煌绿0.5g
蒸馏水100ml
溶解后，存放暗处，不少于1d，使其自然灭菌。
2.5 牛胆盐溶液
牛胆盐10.0g
蒸馏水100ml
加热煮沸至完全溶解，高压灭菌121 ℃，20min。
2.6 制法
基础液900ml
硫代硫酸钠溶液100ml
碘溶液20.0ml
煌绿水溶液 2.0ml
牛胆盐溶液50.0ml
临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。
3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液
3.1 成分
蛋白胨 5.0g
乳糖 4.0g
磷酸氢二钠10.0g
亚硒酸氢钠 4.0g
L-胱氨酸0.01g
蒸馏水1000ml
pH 7.0±0.2
3.2 制法
除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55℃以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/L L-胱氨酸溶液10ml（称取0.1g L-胱氨酸，加1mol/L氢氧化钠溶液15ml，使溶解，再加无菌蒸馏水至100ml 即成，如为DL-胱氨酸，用量应加倍）。摇匀，调节pH。
4 亚硫酸铋（BS）琼脂
4.1 成分
蛋白胨10.0g
牛肉膏 5.0g
葡萄糖 5.0g
硫酸亚铁0.3g
磷酸氢二钠 4.0g
煌绿0.025g或5.0g/L水溶液5.0ml
柠檬酸铋铵 2.0g
亚硫酸钠 6.0g
琼脂18.0g～20g
蒸馏水1000ml
pH 7.5±0.2
4.2 制法
将前三种成分加入300 ml 蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20ml和30ml蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20ml和30ml蒸馏水中，琼脂加入600ml蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至80 ℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50℃～55℃。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。
注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过48h会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。
5 HE琼脂（Hektoen Enteric Agar）
5.1 成分
蛋白胨12.0g
牛肉膏 3.0g
乳糖12.0g
蔗糖12.0g
水杨素 2 .0g
胆盐20.0g
氯化钠 5.0g
琼脂18.0g～20.0g 蒸馏水 1 000ml
0.4％溴麝香草酚蓝溶液16.0ml
Andrade 指示剂20.0ml
甲液20.0ml
乙液20.0ml
pH 7.5±0.2
5.2 制法
将前面七种成分溶解于400 ml 蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600 ml 蒸馏水内。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50℃～55℃倾注平皿。
注:①本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。
②甲液的配制
硫代硫酸钠34.0g
柠檬酸铁铵 4.0g
蒸馏水100ml
③乙液的配制
去氧胆酸钠10.0g
蒸馏水100ml
④Andrade指示剂
酸性复红0.5g
1mol/L氢氧化钠溶液16.0ml
蒸馏水100ml
将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1ml～2ml。
6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂
6.1 成分
酵母膏 3.0g
L-赖氨酸 5.0g
木糖 3.75g
乳糖7.5g
蔗糖7.5g
去氧胆酸钠 2.5g
柠檬酸铁铵0.8g
硫代硫酸钠 6.8g
氯化钠 5.0g
琼脂15.0g
酚红0.08g
蒸馏水 1 000ml
pH 7.4±0.2
6.2 制法
除酚红和琼脂外，将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600ml蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至50℃～55℃倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。
7 三糖铁（TSI）琼脂
7.1 成分
蛋白胨20.0g
牛肉膏 5.0g
乳糖10.0g
蔗糖10.0g
葡萄糖 1.0g
硫酸亚铁铵（含6 个结晶水）0.2g
酚红0.025g或5.0 g/L溶液5.0ml
氯化钠 5.0g
硫代硫酸钠0.2g
琼脂12.0g
蒸馏水1000ml
pH 7.4±0.2
7.2 制法
除酚红和琼脂外，将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600ml蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管约2ml～4ml，高压灭菌121℃10 min 或115℃15min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。
8 蛋白胨水、靛基质试剂
8.1 蛋白胨水
蛋白胨（或胰蛋白胨）20.0g
氯化钠 5.0g
蒸馏水1000ml
pH 7.4±0.2
将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH，分装小试管,121℃高压灭菌15min。
8.2 靛基质试剂
8.2.1 柯凡克试剂：将5g对二甲氨基甲醛溶解于75ml戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25ml。
8.2.2 欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95ml95％乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20ml。
8.3 试验方法
挑取小量培养物接种,在36℃±1℃培养1d～2d，必要时可培养4d～5d。加入柯凡克试剂约0.5ml，轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5ml，沿管壁流下，覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
注：蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。
9 尿素琼脂（pH 7.2）
9.1 成分
蛋白胨 1.0g
氯化钠 5.0g