口服芹菜素固体脂质纳米粒制剂学及药动学研究_胡海洋

作者简介：胡海洋，男，讲师 研究方向：靶向制剂的研究

*

通讯作者：陈大为，男，教授

研究方向：新剂型的研究

Tel ：（024）23986308

E-mail ：chendawei@https://www.sodocs.net/doc/6a3747255.html,

口服芹菜素固体脂质纳米粒制剂学及药动学研究

胡海洋，刘任，刘丹，赵秀丽，陈大为*（沈阳药科大学药学院，沈阳 110016）

摘要：目的 本研究对所制得的芹菜素固体脂质纳米粒的制剂学性质和药动学进行研究。方法 使用激光粒度仪，Zeta 电位值测定仪，透射电镜，X-射线衍射，体外溶出实验考察芹菜素固体脂质纳米粒的制剂学性质；以自制芹菜素混悬液为对照组，考察了大鼠口服芹菜素固体脂质纳米粒的药动学过程。结果 透射电镜观察纳米粒的形态发现该纳米粒为类球形粒子；平均粒径为135 nm ；Zeta 电位为-18.90 mV ；测定药物在释放介质中的释放符合一级释放方程。X-射线衍射证明，芹菜素在固体脂质纳米粒中以无定形形式存在。口服药动学结果表明，芹菜素固体脂质纳米粒组的平均AUC 0-t 为 17.337 mg·h·L -1，而对照组为 5.3 mg·h·L -1。纳米粒组的ρmax 为 3.07 mg·L -1，明显高于对照组的 1.544 mg·L -1。纳米粒组的消除速率常数K e 较低，为0.232 h -1，低于对照组。结论 芹菜素固体脂质纳米粒的相对生物利用度为327%。芹菜素固体脂质纳米粒可有效提高芹菜素的生物利用度。

关键词：芹菜素；固体脂质纳米粒；体外释放；差示扫描量热；X-射线衍射；药动学

中图分类号：R969；R944 文献标识码：A 文章编号：1001-2494(2009)06-0448-04

Studies on Pharmacy Characters and Pharmacokinetics of Oral Apigenin Loaded Solid Lipid Nanoparticle HU Hai-yang ，LIU Ren ，LIU Dan ，ZHAO Xiu-li ，CHEN Da-wei *（School of Pharmacy ，Shenyang Pharmaceutical

University ，Shenyang 110016，China ）

ABSTRACT ：OBJECTIVE To investigate the pharmacy characters and pharmacokinetic processes of the prepared apigenin loaded solid lipid nanoparticles (AP-SLN). METHODS The pharmacy characters of AP-SLN were investigated with the mean size ，ζ potential ，transmission electron microscopy ，and in vitro drug release. The pharmacokinetic processes of oral AP-SLN of the rats were also studied ，while apigenin suspension was used as control group. RESULTS The appearance of AP-SLN was examined by transmission electron microscopy as sphere-like with the mean size of 135 nm ，the potential of -18.90 mV ，respectively. The in vitro release profiles were expressed by first-order release equation. Using X-ray ，it was comfirmed that apigenin was encapsulated in solid lipid nanoparticles as amorphous. The average AUC 0-t of SLN group was 17.337 mg·h·L -1，while the AUC 0-t of control group was 5.3 mg·h·L -1. The ρmax of SLN group was 3.07 mg·L -1，obviously higher than 1.544 mg·L -1 of control group. The elimination rate constant ，Ke ，of SLN group was 0.232 h -1，lower than that of the control group. The relative bioavailability of the AP-SLN was 327%. CONCLUSION The results of oral administration pharmacokinetics indicated that SLN significantly enhanced the oral bioavailability of AP.

KEY WORDS ：apigenin ；solid lipid nanoparticles ；in vitro release ；Differential scanning calorimetry ；X-ray ；pharmacokinetics

芹菜素（apigenin ，AP ）[1-3]（5，7，4′-三羟基黄酮）属于黄酮类，广泛存在于伞形科植物旱芹叶、卷柏科卷柏全草、柏科圆柏叶中。芹菜素具有多种药理活性：具体表现在抗肿瘤、抗炎症、降血压、抗动脉硬化和血栓症、抗焦虑、抗菌抗病毒以及抗氧化作用等方面。近年来，芹菜素的抗肿瘤作用得到人们的日益关注，其中抗乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌的作用最为显著。但是由于芹菜素的理化性质，水溶性较差，口服吸收差，生物利用度较低，在一定程度上限制了它的应用。

本实验采用固体脂质纳米粒这一给药系统作为载体，将芹菜素制备成纳米粒混悬液再口服以达

到改善其口服吸收的目的，提高生物利用度。1 仪器与试药

LC -10AD 型高效液相色谱仪，HW 色谱工作站，FA1104 电子天平，Nicomp380 Z3000 粒度测定仪（苏州微流纳米生物技术有限公司），透射电镜

（日立公司），型离心机(上海安亭科学仪器厂)，恒温水浴锅HH -S 型(江苏省红旗医疗仪器厂)。芹菜素（纯度98%，南京青泽医药科技开发有限公司，070321），Pluronic F -68（德国BASF ），大豆卵磷脂（注射用，上海太伟药业有限公司，040716），单硬脂酸甘油酯（天津市博迪化工有限公司）。

2 方法

2.1 芹菜素固体脂质纳米粒（AP-SLN）的制备

称取处方量Pluronic F68溶解于蒸馏水中，构

成水相；称取处方量的单硬脂酸甘油酯，加热到（75±2）℃使熔融，处方量磷脂溶于芹菜素醇中，

在搅拌状态下分散到熔融的单硬脂酸甘油酯中，构

成油相，通氮气挥去乙醇。将水相加热到相同的温度，注入油相中，恒温搅拌，制成初乳。趁热将初

乳超声，室温水冷却，过0.22 μm微孔滤膜即得。

2.2 芹菜素囊泡粒径分布

取“2.1”项下制备的纳米粒稀释至一定浓度，

采用LS 230激光粒度仪测定粒径及粒度分布。

2.3 芹菜素固体脂质纳米粒Zeta电位的测定

取“2.1”项下制备的纳米粒，稀释至一定浓度，

放入比色池中，测定Zeta电位值。

2.4 芹菜素固体脂质纳米粒显微形态

取“2.1”项下制备的纳米粒适量，用3％磷钨

酸染色，透射电镜下观察其粒子形态。

2.5 芹菜素纳米粒体外释放的测定

分别取3 mL的AP-SLN及等含量的AP对照溶

液置透析袋中，释放介质为磷酸盐缓冲液（pH 7.4）+20%乙醇，释放介质体积为50 mL，在37 ℃

下50 r·min-1低速搅拌，平行操作3份。每隔一定时

间将透析介质全部取出，更换相应的新鲜介质，继

续操作，取出的介质用0.45 μm微孔滤膜过滤，取

续滤液HPLC测定AP浓度，计算累积释放率。

2.6 差示扫描量热法对冻干后纳米粒状态的考察（DSC）

取单硬脂酸甘油酯，物理混合物及冻干后的纳

米粒粉末样品进行差示扫描量热，升温速率为10 ·min

℃-1，升温范围为30~100 ℃。

2.7X-射线衍射对冻干后纳米粒考察

为了考察纳米粒中药物的分散状态，对药物粉末，物理混合物及冻干后的纳米粒粉末样品进行了

X-射线衍射分析。

2.8 色谱条件建立

Shimadzu 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流

动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈(体积比为45∶55)，

流速1.0 mL·min-1，检测波长312 nm，进样量为20

μL，内标为水飞蓟宾（SB）。

2.9 血浆样品处理

精密吸取血浆样品0.2 mL，置于1.5 mL具塞

尖底塑料试管中，依次加入400 mg·L-1内标溶液10

μL，甲醇0.6 mL，旋涡混合3 min，离心（4 000 r·min-1）10 min。取上清液用N2吹干，甲醇0.1 mL 溶解，过滤离心后进样，进行HPLC分析，记录色谱图。将待测物与内标物的峰面积比代入标准曲线，计算各时间点样品中药物的浓度。

2.10 芹菜素纳米粒在大鼠体内的药动学研究

取大鼠12只，随机分为2组（对照组和制剂组），实验前禁食12 h，分别灌胃上述2种制剂，剂量为20 mg·kg-1，分别于给药前和给药后0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，12 h眼眶取血，4 000 r·min-1离心10 min，分离血浆按“2.9”项下的方法处理，并进HPLC检测，代入标准曲线，计算不同时间点的血药浓度。

3 结果

3.1 AP-SLN的制备及制剂学考察

经过单因素考察、正交实验后得到制备AP-SLN的最优处方，其包封率为（62.48±3.5）％，纳米粒粒度分布（图1）为单峰，平均粒径为（135±5.03）nm，Zeta电位为-18.90 mV。透射电镜下观察显示呈类球形（图2A，2B），粒度分布为80~200 nm，与粒度测定仪测定结果一致。包裹药物后纳米粒形态没有明显变化。结果表明，制备的纳米粒粒径较小，粒度分布较均匀。

图1芹菜素固体脂质纳米粒的粒径(AP-SLN)分布图

Fig.1The particle distribution of apigenin loaded solid lipid nanoparticles (AP-SLN)

图2 AP-SLN的透射电镜照片(×30 000)

A-空白；B-载药

Fig.2 The transmission electron microscope investigation of AP-SLN (×30 000)

A-blank；B-drug loaded

3.2AP-SLN体外释放

体外释放研究表明（图3），AP-SLN具有缓释效果，48 h的累计释放率为85.4%。在开始释放的前4 h，37.5%芹菜素从固体纳米粒中快速释放。释放曲线符合一级动力学（Y=-0.059 8t+ 4.393 5，r=0.990 3）。而透析袋对药物释放无影响。

3.3差示扫描量热法对冻干后纳米粒状态的考察

从A，B，C 3者的热分析相图4中可以得知，单硬脂酸甘油酯(glycerin monostearate，GMS)的熔点为66.44 ℃，物理混合物中为60.40 ℃，AP-SLN中该峰值为52.77 ℃，与GMS和混合物相比，AP-SLN的熔点明显下降。固体脂质相变温度降低可能是由于磷脂融入纳米粒结构中所导致的，脂质包裹了药物后其晶型也会发生变化，也会影响固体脂质的相变温度。

3.4X-射线衍射对冻干后纳米粒考察

本实验通过X-射线衍射考察纳米粒中药物的分散状态，从X-射线衍射图谱（图5A，5B，5C，5D）可见芹菜素药物粉末是结晶形式存在，物理混合物中药物结晶的特征峰依然明显，将药物及物理混合物与AP-SLN相比，药物的结晶峰减少，说明药物大部分是以无定形状态存在于纳米粒之中。而少部分药物以结晶态吸附在纳米粒表面。此可证明体外释放前4 h的突释是由于吸附在纳米粒表面的药物溶解所致。

3.5体内检测方法学考察

取大鼠空白血浆0.2 mL共5 份，分别精密加入芹菜素系列标准溶液10 μL，精密配制成浓度为0.25，0.5，1，2，5 mg·L-1的含药血浆。再分别加入内标溶液10 μL，混匀，按“2.10”项下方法操作，进样20 μL，记录色谱图。以芹菜素和内标物峰面积比A s/A i为纵坐标，以芹菜素质量浓度ρ（mg·L-1）为横坐标，得标准曲线方程为A i/A s=0.145 6ρ+0.026 1，r=0.998 4。结果表明，该标准曲线在0.25~5 mg·L-1内线性关系良好。最低检测限为0.05 mg·L-1，精密移取低、中、高3个浓度芹菜素标准溶液，按“2.10”项下方法操作测定提取回收率为（81.64±2.3）%。

3.6药动学实验结果

按照“2.10“项下方法，给药后不同时间点的血药浓度见表1，采用梯形法计算的药动参数见表2。由表2可知，SLN组的ρmax（3.07 mg·L-1）明显高于对照组（1.544 mg·L-1）。SLN组的消除速率常数K e较低，为0.232 h-1，低于对照组为0.54 h-1；SLN组的平均AUC0-t为17.337 mg·h·L-1，而对照组为5.3 mg·h·L-1。根据药动学拟合出的血药浓度-时间曲线下面积AUC0-t的数据及给药剂量，求算AP-SLN与相同给药剂量的芹菜素原料药的相对生物利用度为327%。结果表明，自制的AP-SLN与芹菜素原料药相比明显提高了生物利用度。

4讨论

用电镜照片来观察纳米粒的微观结构，不同的

图3 AP-SLN在pH 7.4 PBS+20%乙醇中释放曲线

Fig.3The release profile in pH 7.4 PBS+20% ethanol

图4冻干AP-SLN差示扫描量热图谱

A-单硬脂酸甘油酯；B-物理混合物；C-冻干AP-SLN

Fig.4The DSC of lyophilized AP-SLN

A-glycerin monostearate；B-physics mixture；C-Lyophilized AP-SLN

图.5 AP-SLNX-射线衍射图

A-芹菜素；B-物理混合物；C-海藻糖；D-AP-SLN

Fig.5The X-ray of lyophilized AP-SLN

A-apigenin；B-physics mixture；C-trehalose；D-lyophilized AP-SLN

表1 芹菜素（AP ）混悬液/SLN 灌胃给药后的血药浓度. n =6，±x s

Tab.1 The drug concentration of apigenin(AP) suspension/ SLN. n =6，±x s

t /h

AP suspension/mg·L -1 AP-SLN/mg·L -1

0.25 0.154±0.031 0.378±0.117

0.5 0.374±0.107 0.625±0.079

1 0.864±0.195 1.431±0.407

2 1.544±0.41

3 3.070±1.763

4 0.611±0.046 2.863±1.35

5

6 0.411±0.071 1.136±0.259 8 0.113±0.028 0.834±0.21

7 12

－

0.415±0.104

表2 AP 混悬液/SLN 药动学参数. n =6，±x s

Tab.2 The pharmacokinetic parameters of apigenin(AP) suspension/SLN. n =6，±x s

Parameters AP suspension AP-SLN

t 1/2/h 1.283±0.53 2.987±0.731)

K e /h -1 0.540±0.12 0.232±0.11 V 1/F /L·kg -1 7.802±1.34 5.166±1.89 CL /F /L·h·kg -1 4.215±1.12

1.199±0.45 AUC 0-t /mg·L·h -1 4.431±1.21

14.408±3.781) AUC 0-∞/mg·L·h -1 4.475±1.24 16.684±3.431)

K a /h -1 0.642±0.16 0.606±0.19 t 1/2Ka /h 1.080±0.31 1.143±0.41 注：AP-SLN 与芹菜素混悬液相比，P <0.05 Note ：1)

AP-SLN vs. AP suspension ，P <0.05

纳米粒微观形态也会有所不同，关于纳米粒的形态

结构的研究，始终是国内外研究的热点。本实验中所给出的电镜照片中纳米粒呈近似球形结构 [4-5]。

对于微粒分散体系，粒径及其分布的测定十分重要。因为其能够影响纳米粒的体内分布、靶向性

及稳定性，故粒径及其分布是评价纳米粒十分重要的质量参数。本实验采用了激光粒度仪（光散射原

理）对SLN 的粒径及其分布进行了测定，结果表明，AP-SLN 混悬液的平均粒径在135 nm 左右，粒度分

布范围比较窄，体系比较稳定。 芹菜素是一种很有前景的中药有效成分，但目前关于其相关制剂的研究很少。在水中不溶，口服吸收的生物利用度较低是未来开发芹菜素口服剂型的难题，采用固体脂质纳米粒给药后，生物利用度有了很大提高[6]，在减少给药剂量的情况下，可达到相同的治疗效果。本实验希望能为中药有效成分芹菜素的新型制剂的研究和开发提供一定实验基础。

纳米粒在小肠的吸收机制已经很明确了[7]，小于500 nm 的纳米粒可在胃肠道的派伊氏淋巴结集中积累，并以完整结构通过淋巴结集中的M 细胞，将药物释放到循环中；此外，由于纳米粒的小粒子效应，纳米粒对胃肠道壁具有较强的黏附作用，延长了在胃肠道的停留时间，从而增加了纳米粒的吸收机会。

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（收稿日期：2008-12-20）

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