细胞培养基本方法

1.操作台基本要求：

2.随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20℃或-80℃冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。

3.细胞污染：

（1）细菌污染

（2）酵母污染

（3）霉菌污染

初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。

（4）病毒污染

一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。

（5）支原体污染

唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE、PCR、免疫染色、放射自显影

4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出

5．适合贴壁的细胞和悬浮的细胞

6.基础培养基，减血清培养基，无血清培养基

7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4；

成纤维细胞系适合轻度偏碱（pH7.4-7.7）

Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36℃至37℃最佳

昆虫细胞在27℃为最佳

禽类细胞在38.5℃最佳

冷血动物（15℃-26℃）

9.动物细胞形态划分：

●成纤维细胞，贴附生长

●上皮样细胞呈多角形，贴附

●淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附

●特殊形态：

?I型有长突触

?Ⅱ型没有轴突

10.细胞增长模式

11.何时传代？

●哺乳动物：生长的PH值通常表示乳酸储积，且有毒性，当PH迅速降低（）

0.1-0.2PH单位），同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。

●昆虫细胞PH值会上升但不超过6.4

12．贴壁细胞的解离

13.贴壁细胞的传代

14.贴壁昆虫细胞传代：

15.悬浮细胞传代流程

16.细胞冻存：

17.冷冻细胞解冻方案：

18.利用血球计数器进行细胞计数：

19.台盼蓝拒染法：

细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。

动物细胞培养基本操作

实验一动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。 细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等 为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。 本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。 三、实验材料、用品

细胞培养基本方法.docx

1?操作台基本要求: S ii. ??*SΛl-≤手的工作A通冈禹基也布局α *!!崗左芋￡丄fTAβ^WLJt禺整丄fl-??' 上豹品矿播班苗 2?随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20C 或-80C冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： (1)细菌污染 A S 佛3相差&Λ凰示旳螯主长的丄S ??tfΛ?t i li??- 1EfeS??T可见Iii垦壬庭司的区14存査■ ??S?????^ffi?1但是?

(2)酵母污染 阴站.M栢差圉煙昱示J?壁增齐的23」迄無蛍醉母污果?陌集的H*??ffl胞呈髓兀电貶也??!???生屮转Ke e JH* I (3)霉困污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 (4)病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 (5)支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE PCR免疫染色、放射自显 影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5 ?适合贴壁的细胞和悬浮的细胞

6.基础培无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4; 成纤维细胞系适合轻度偏碱 （pH747?7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长 8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36C至37C最佳 昆虫细胞在27C为最佳禽类细胞在38.5C最佳冷血动物（15C -26C） 9.动物细胞形态划分： 成纤维细胞，贴附生长上皮样细胞呈多角形，贴附淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附特殊形态： I型有长突触 U型没有轴突 10.细胞增长模式

常规细胞培养方法

常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法

1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液

细胞培养基础知识详解-细胞的复苏、传代和冻存

细胞培养基础知识详解 细胞的复苏、传代和冻存实验操作指导 整理：江耀伦李美娣 1 细胞复苏 细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 1.1实验前准备 （1）将水浴锅预热至37℃ （2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的生物安全柜内部台面。 （3）在生物安全柜中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 1.2 细胞复苏培养 （1）根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。 （2）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 （3）约1-2 min后冻存管内液体完全溶解，取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。 （4）用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入生物安全柜内。吸弃上清液，向离心管内加入1 mL培养液，吹打制成细胞悬液。 （5）将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内，将培养瓶/培养皿放入37℃，5％ CO2的培养箱内过夜后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。 1.3 初学者易犯错误 （1）水浴锅未预热或者未预热到37℃。 （2）水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。 （3）离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 （4）一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 1.4 细胞传代 1.4.1 传代前准备 （1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶

子放入37℃水浴锅内预热。 （2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的生物安全柜内台面和双手。 （3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 1.4.2 细胞传代 （1）取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入生物安全柜内。 （2）从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 （3）将培养瓶放入生物安全柜后打开瓶口，同时用酒精棉擦拭瓶口消毒。 （4）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 （5）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 （6）弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液终止反应。小心吹打成细胞悬液。 （7）将细胞悬液吸入10 mL离心管中。平衡后将离心管放入离心机中，以1000 rpm/min离心5 min。 （8）弃去上清液，加入适当体积的培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 （9）将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 （10）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/mL。最后要做好标记。 （11）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养，传代细胞2-4 h后开始贴附在瓶壁上。 1.4.3 注意事项 （1）严格的无菌操作 （2）适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，

细胞培养操作步骤

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个， 常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作 者的双手。 2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶 口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消 毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器 上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出 实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 6.将培养瓶放于28℃,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱 底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 二、培养液的更换

细胞培养基本操作技能

细胞培养基本操作技能 无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 实验用品 1. 种类︰ 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透 明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml 2. 清洗︰ 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌︰ 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于

细胞培养标准流程

精品文档 细胞间基本规定 每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。 显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。 超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。 带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。 细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称 细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。 细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。 步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞2 脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10?S的完全培养基终止消化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培） （细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。 . 精品文档 2、细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后） 细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。

动物细胞培养常用方法

一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度

细胞培养基本操作

细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细 胞的过程。细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。 一、实验前准备 实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。 消毒双手和超净台。取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。 水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。 注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。 二、制备细胞悬液 吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。 离心：1000rpm，室温离心3min。 注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。 三、细胞培养 离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。 四、注意事项 1、解冻速度要快 在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻 存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。 2、一次复苏细胞不宜过多 细胞在解冻时，需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。并且一次复苏细胞过多，容易忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 3、培养瓶上注明细胞类型，日期，人名。

细胞培养基本条件培训讲学

细胞培养基本条件

细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。 5、合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。 细胞培养基种类与基本成分 细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基

两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。 1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质： 氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。 碳水化合物 碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。 无机盐 培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ～320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。

分子克隆及细胞培养基本实验方法

分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）

①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应

细胞培养中的注意事项

细胞培养中的注意事项 1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后，须立即放入37C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 %或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5%CO2培养细胞。 7 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 8 培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。 9附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？ 一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。 10 悬浮性细胞应如何继代处理？ 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。 11 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？ 欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。 12 细胞之接种密度为何？ 依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。 13 细胞冷冻培养基之成份为何？ 动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 -95%原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO稀释时会放出大量热能，故不可

H9c2细胞培养方法

大鼠心肌细胞H9C2 细胞描述： 大鼠心肌细胞H9C2是来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，表现很多骨骼肌细胞的特性。当H9c2细胞汇合时，细胞就会融合成多核的肌管并对乙酰胆碱刺激有反应，但该细胞缺少像心肌细胞一样的节律性搏动。此外，多项生化、电生理指标的检测也表明其具有骨骼肌的很多特点。由于来源于心脏，H9C2细胞作为心脏成肌细胞也用于心肌疾病的研究。 大鼠心肌细胞H9C2增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来解冻、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。 货号规格培养基运输保存 C0048 1×106个/管DMEM+10% FBS 干冰运输液氮保存 质量控制： 本细胞经过了检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）、支原体。 培养条件： 37℃，5% CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。 用途： 本产品只提供给进一步的科研使用，不可应用于治疗等其他方面。 细胞相关操作（注意：细胞操作都需严格按照无菌操作） 收到复苏好的贴壁细胞的处理方法： 1. 先从外包装盒拿出细胞瓶，在细胞瓶表面喷一层酒精，并小心去掉封口膜； 2. 在显微镜下观察细胞状态，并确定是否染菌，如有染菌，请立即拍照，并将细胞丢掉； 3. 将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养4-6小时； 4. 倒掉多余的培养基，留正常体积的培养基； 5. 重新将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养过夜； 6. 第二天传代。 收到冻存细胞的处理方法： 1.37°C水浴预热培养基； 2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀； 5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)； 6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。 细胞传代 1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代； 2.37°C水浴预热培养基； 3.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞； 4.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基终止消化； 5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散； 6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；

MDCK细胞培养基本技术方法 -2011本

MDCK细胞培养 一、目的MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。 二、适用范围适用于疾控中心所有技术人员。 三、程序 （一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-1所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。 （二）材料 1.生长成片的MDCK细胞 2.无菌的T25细胞培养瓶 3.D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺） 4.青、链霉素母液（10000U/mL青霉素G；10000μg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃ 5.HEPES缓冲液，1M母液 6.胎牛血清 7.EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mMEDTA-4Na），分装后保存于-20℃8.7.5%牛血清白蛋白组分V9.1mL、10mL无菌移液管10.70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。 （三）实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 1.D-MEM培养液的准备 500mLD-MEM液中加入：青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素），HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL 2.细胞生长液的准备 胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 3.首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 4.温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。

5.重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 6.加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。 7.加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。 8.取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞） 9.每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。 10.于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。

细胞培养基本操作

细胞培养基本操作 无菌操作基本技术 1.实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以75 % 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75 % 酒精擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以75 % 酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起气溶胶之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。 实验用品 1.细胞培养实验用品均为无菌，分玻璃容器和塑料无菌制品。 2.种类：培养瓶，培养皿，多孔培养板，巴氏管，离心管（15ml,50ml）,玻璃血清瓶等。 3.清洗和消毒 3.1．玻璃器皿： A.浸泡：新玻璃器皿，自来水初步清洗；使用后玻璃器皿立即浸入清水中，避免器皿内蛋白质干涸黏附于玻璃上导致难以清洗。浸泡使器皿完全浸入水中，使水进入器皿内而无气泡空隙遗留。 B.刷洗：浸泡后用毛刷加洗涤剂洗涤，刷洗后要将洗涤剂彻底冲洗干净，晾干。

细胞培养各种培养基简介

DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识 培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 一、基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM 含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。 二、血清 细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些 痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，也用于细胞系和原代培养。而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。然而，很多人也将胎牛血清