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小麦成熟胚组织培养及遗传转化研究进展_陶丽莉

麦类作物学报　2008,28(4):713-718

Journal of Triticeae Crops

小麦成熟胚组织培养及遗传转化研究进展

陶丽莉1,殷桂香2,1,叶兴国1

(1.中国农业科学院作物科学研究所/农业部作物遗传育种重点实验室/国家基因资源与遗传改良重大科学工程,北京100081;

2.长江大学农学院,湖北荆州434025)

摘　要:小麦成熟胚转化体系的建立对促进小麦基因工程研究和功能基因组研究具有重要意义。小麦成熟胚具有取材方便、不受季节限制等优点,已成功应用于小麦组织培养及遗传转化研究,可望取代幼胚成为小麦遗传转化的方便受体。本文就目前小麦成熟胚组织培养及遗传转化研究进行了综述,目的是为进一步建立和完善小麦成熟胚再生体系和转化体系提供参考。目前国内外采用较多的小麦成熟胚培养方式主要有完整成熟胚培养、胚乳支撑成熟胚培养、成熟胚刮碎培养和成熟胚切割培养等。对培养基中激素种类、浓度配比的优化也进行了较多研究,并取得了一定结果。利用基因枪轰击法和农杆菌介导法转化小麦成熟胚均成功获得了转基因植株,证明小麦成熟胚及其愈伤组织作为受体进行遗传转化研究具有可行性。

关键词:小麦;成熟胚;组织培养;遗传转化

中图分类号:S512.1;S336 文献标识码:A 文章编号:100921041(2008)0420713207

Progress Outline of Wheat Tissue Culture and G enetic T ransformation

by Using Wheat Mature Embryos As Explants

TAO Li2li1,YIN G ui2xiang2,1,YE Xing2guo1

(1.National Key Facilities for Crop Gene Resources and Genetic Improvement,Key Laboratory for Crop Genetics and Breeding

of Agricultural Ministry,Crop Sciences Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing100081,China;

2.Agronomy College of Yangtze University,Jingzhou,Hubei434025,China)

Abstract:Wheat mat ure embryo has been regarded as a high potential explant s for plant regeneration and genetic t ransformation because of some distinguish advantages such as easy collection all t he year round,consistent p hysiological stat us and econo mic experiment p rocess.In t he last ten years a great success has been achieved on t he tissue cult ure and t ransformation of wheat by using mat ure embryos worldwide.To get good regeneration system,t he mat ure embryo s are tested to be cult ured by several ways including whole embryo cult ure,endosperm2supported embryo cult ure,t hin embryo fragment s cult ure,and cutting embryo cult ure t reat ment s.The effect s of concent rations and combinations of va2 rious growt h regulators on callus induction and plant regeneration have also been st udied,and some a2 vailable result s obtained.U sing t he mat ure embryo s as target tissues,transgenic plant s have been re2 ported mediated wit h Agrobacterium technique and biolistic particle approach,proving t he bright pos2 sibility of t he explant s employed in wheat t ransformatio n.We summarized here t he progress of wheat mat ure embryo cult ure and t ransformation to p rovide reference for t he optimization of t he bot h sys2 tems.Efficient systems of t he wheat mat ure embryo cult ure and t ransformation will remarkably p ro2 mote wheat genetic engineering improvement and f unctional genomics st udy.

K ey w ords:Wheat;Mat ure embryo s;Tissue cult ure;Transformation

3收稿日期:2008202205 修回日期:2008205220

基金项目:国家“863”项目(2007AA10Z129)。

作者简介:陶丽莉(1982-),女,硕士研究生,主要从事小麦组织培养和遗传转化研究。E2Mail:taolili19820401@https://www.sodocs.net/doc/655822124.html,

通讯作者:叶兴国(1963-),男,研究员,主要从事小麦生物技术育种研究。E2mail:yexg@https://www.sodocs.net/doc/655822124.html,

小麦是世界上最重要的粮食作物之一,小麦品种的遗传改良工作一直受到科学家的广泛关注。传统常规育种方法存在着周期长、改良进程缓慢等缺点,利用转基因手段将特定的外源基因导入小麦中,从而定向改良小麦品种,为小麦遗传育种提供了一条新途径。随着生物技术的发展,转基因小麦的研究取得了一定进展。虽然已建立了各种转化小麦的方法,但目前仍存在一些问题。限制其发展的一个最主要因素是缺乏便捷、高效和稳定的组织培养体系,植株再生频率低。所以,建立高效的再生体系已成为小麦遗传转化的关键所在[1～3],外植体选择是其重要环节。

到目前为止,小麦组织培养成功的外植体包括幼胚、幼穗、花药、成熟胚、幼叶、子叶中层、种子、悬浮细胞、子房、茎尖、根尖分生组织和原生质体等[2～4]。其中,幼胚被认为是最理想的外植体材料,愈伤组织诱导率和植株再生率都比较高,获得转基因小麦植株的报道基本以幼胚为受体。而小麦幼胚取材受时间、空间和季节的限制,合适的取材时期难以把握,所取材料生理状态、发育阶段的一致性也不能很好保障,在一定程度上制约了转基因小麦的有效开展与应用。小麦成熟胚取材方便,不受季节、植株发育阶段等因素限制,能保证不同个体间生理状态的一致性,是开展小麦遗传转化最为方便实用的受体[2～4]。但是,小麦成熟胚植株再生率目前还非常低,探索并优化小麦成熟胚组织培养条件,建立高频率的植株再生体系,对小麦转基因工作的开展将有巨大的推动作用。本文就目前小麦成熟胚培养及遗传转化的研究进展作一概述,旨在为广大科研工作者提供有价值的参考。

1　小麦成熟胚组织培养研究进展为了建立小麦成熟胚组织培养体系,人们对成熟胚培养方式和培养基中激素种类、浓度、配比等进行了研究。1.1　小麦成熟胚培养方式及特点

在成熟胚处理方面,最初采用完整胚直接接种,再生效果很差,再生植株频率很低,多数基因型不能得到再生植株。后来逐步发展了胚乳支撑接种、成熟胚刮碎接种、成熟胚切割接种等,再生植株频率得到了一定提高。

1.1.1　完整成熟胚培养效果研究　Chin等[5]从萌动48 h的种子上剥离成熟胚培养,即将成熟胚从吸涨的成熟种子中取出,盾片向上接种在愈伤组织诱导培养基上。成熟胚形成愈伤组织比较缓慢,初期形成的愈伤组织结构松软、半透明、水分含量比较高,经过几次继代培养后才能产生具有一定分化能力的颗粒状愈伤组织。王海波等[6]将干种子浸泡10h,然后取成熟胚接种,发现培养效果不及直接用干种子接种。Bi等[7]先切去种子胚芽和胚根,再将胚剥离后培养,对31个小麦品种的培养发现成熟胚培养具有很强的基因型依赖性,不同的基因型在愈伤组织诱导、胚性愈伤组织分化、植株再生和培养效率方面存在显著差异。Yu等[8]用此方法研究了部分小麦品种成熟胚再生效果,得到了较高的植株再生率,并对培养基组分进行了优化,表明MS培养基添加

2.0mg?L–12,42D(2,42 dichlorophenoxyacetic acid)诱导愈伤组织效果最好,继代培养基中添加2.0mg?L–12,42D、0.5mg?L–1BA和0.1mg?L–1NAA(Naphthaleneacetic acid)能够显著促进胚性愈伤的发生,分化培养基中加入AgNO3(10mg?L–1)能有效促进植株再生,CuSO4能促进根的形成。另有研究表明,在诱导和分化培养基中加入低浓度TDZ (Thidiazuron,N2苯基2N’21,2,32噻二唑252脲)有一定正向效果[9]。Ding等[10]用完整成熟胚接种,比较了2,42D和Picloram(42amino23,5,62trichloropicolinic acid)在胚状体形成和再生过程中的作用,发现1.0mg?L–1Piclo2 ram处理中胚性愈伤组织诱导率和植株再生率均为最高,植株再生率达30.6%。

1.1.2　成熟胚切割培养效果研究　在灭菌后过夜浸泡的小麦籽粒上将成熟胚均匀纵向切成两部分,并将其从籽粒上剥离,切面向上接种于诱导培养基上进行培养。利用此方法接种的成熟胚诱导愈伤组织比较缓慢,且胚尖部位容易出现实生芽,需要及时去掉。初期形成的愈伤组织质地疏松、略带水浸状、无胚性,继续培养后部分愈伤组织逐步生长出白色、结构紧密、干燥、颗粒状胚性愈伤组织,具有较强的分化能力。Wan等[11]将Bobwhite成熟胚纵切后先在MS附加5.0mg?L–12,42D和

2.2mg?L–1Piclo2 ram培养基上培养,然后在2,42D浓度降低到0.5mg?L–1、Picloram浓度不变的培养基上继代培养,最后在MSO培养基上分化植株,丛生芽诱导率高达90%以上,初步建立了Bobwhite成熟胚的再生体系。Zale等[12]的研究表明,该方法能较好诱导胚性愈伤组织和再生植株,而且对模式品种Bobwhite和农艺性状较好的品种都适用。Tang等[13]则将小麦成熟胚横切为两段,用含有胚芽的一段诱导愈伤组织,也得到了比较理想的再生效果。1.1.3　胚乳支撑成熟胚培养效果研究　;zgen等[2,3]利用胚乳提供营养的方式培养小麦成熟胚获得了再生植株,为小麦成熟胚离体培养开辟了新途径,即用解剖刀将吸涨种子的胚与胚乳轻轻分开但不剥离,在籽粒上进行成熟胚培养,11d左右形成乳白色的愈伤组织,然后小愈伤组织与胚乳分离后单独培养,逐步出现淡黄色颗粒状愈伤组织。胚乳支撑培养研究结果表明,成熟胚愈伤诱导和再生与基因型密切相关。该方法需要对种子进行严格灭菌,否则污染现象比较严重。Mohammad等[14]直接培养浸泡后的种子,发现MS培养基添加2.0mg?L-12,42D和0.5 mg?L-1BA P能产生质地疏松、颗粒状的愈伤组织,在含2.0mg?L-1BA P和1.0mg?L-1IAA(Indoleacetic acid)或1.0mg?L–1BA P和0.5mg?L-1,42D的MS培养基上可分化植株。王海波等[6]将干种子切去胚根、茸毛后直接培养或种子浸泡10h后培养,发现萌动种子比干

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种子出愈快,愈伤组织质量好,切去胚根和茸毛后的干种子也能产生一定量的愈伤组织,表明胚乳有利于提高愈伤组织活力。

纵横切法是在胚乳支撑法和切割法基础上改进的一种新方法,即在灭菌的种子上将胚纵切一刀、横切两刀,将种子接种在培养基上进行培养。此方法可有效抑制芽的直接萌发,形成愈伤组织的速度较胚乳支撑法快,愈伤组织质量明显提高,分化能力比较强。Mikhail等[15]应用该方法研究了生长素类型及生长素处理时间对愈伤组织形成和植株再生的影响,发现Dicamba(3,62dichloro2o2anisic acid)效果最佳,Dicamba处理时间由7d延长到21d,胚性愈伤组织诱导率和植株再生率都明显提高。Birsin等[16]对胚乳支撑法和整粒切胚诱愈法进行了对比研究,发现胚乳支撑法的植株再生效率较高。

1.1.4　成熟胚刮碎培养效果研究　将成熟种子灭菌消毒后浸泡一定时间,在种子上将成熟胚刮成碎屑接种在培养基上诱导愈伤组织。刮碎的成熟胚组织能很好地抑制胚的直接萌发,出愈率高,产生的愈伤组织比较致密,表面有球状突起,呈淡黄色颗粒状,再生能力强。Delporte等[4]把小麦成熟胚从种子上刮碎后进行组织培养,胚性愈伤组织诱导率高达47%,并且获得了比较理想的再生效果。林德书等[17]将晋麦2148的成熟胚刮碎后接种在MS附加11.2g?L–1葡萄糖、2mg?L–12,42D的培养基上诱导愈伤组织,3周后将愈伤组织转移到MS附加11.2g?L-1葡萄糖、0.2mg?L-1IAA的培养基上继续培养4～8周,然后转移到1/2MS附加30g?L-1蔗糖的培养基上分化植株,再生率为21.5%,初步建立了晋麦2148成熟胚的再生体系。

1.2　培养基中激素种类和浓度配比的优化

在小麦成熟胚培养过程中,培养基和基因型是最关键的影响因素。植物激素作为培养基中必不可少的组分,对于调节组织和细胞培养中胚状体的发生具有举足轻重的作用。生长素和细胞分裂素浓度及比例控制着细胞的分裂和器官的分化。国内外学者对小麦成熟胚组织培养中诱导培养基和分化培养基中添加的激素种类及其浓度配比进行了较多研究[2,3,11,18]。

2,42D是小麦成熟胚培养中应用最广泛的生长调节剂,培养基中添加2～8mg?L–12,42D都能诱导愈伤组织,但具体浓度与成熟胚的培养方式密切相关。刮碎法和整粒切胚诱愈法2,42D浓度一般为2mg?L–1[7],胚乳支撑法则以8mg?L–1为宜[2,3]。高浓度2,42D能有效抑制胚发芽,但对愈伤组织的分化不利[7,11,19,20]。细胞分裂素KT在某种程度上能够拮抗高浓度2,42D对愈伤组织分化的抑制作用,但附加KT对愈伤组织有一定的毒害作用。研究还发现,在成熟胚愈伤组织诱导的起始阶段2,42 D起着非常重要的作用,之后需降低2,42D浓度或不添加2,42D才会更有利于胚性愈伤组织的产生[2,4]。在生根培养基中,添加低浓度2,42D或不添加任何生长素的效果比添加IAA和BA P的效果要好[11,18]。王海波等探讨了不同水平的2,42D对愈伤组织质量的影响,发现单纯增加或降低2,42D浓度并不能很好地改善愈伤组织的生长状态,应根据愈伤组织的状态确定继代培养基中2,42D的用量,原来质量很差的愈伤组织经过继代培养可以得到改良,高水平2,42D配合0.2mg?L–1KT或62BA有利于维持愈伤组织的致密结构和促进芽分化[6]。

除2,42D外,Dicamba、Picloram和22MCPP(22(22 methyl242chlorophenoxy)propionic acid)、2,4,52T(2, 4,52trichlor ophenoxyacetic acid)等也在小麦成熟胚培养得到了实践。通过比较不同生长素在小麦成熟胚愈伤组织诱导和植株再生过程中的效果,发现使用Dicamba得到的胚性愈伤率最高,在含有Dicamba的诱导培养基中加入IAA、IBA(Indolebutyric acid)和NAA对胚性愈伤的形成有促进作用,其中0.5mg?L–1IAA与Dicamba结合能明显促进体细胞胚发生,并能显著提高植株再生率[12,15,21]。与2,42D相比,Dicamba(18umol?L-1)诱导产生的愈伤组织分化能力好,同时还能大大缩减植株再生所需的时间,这与幼胚培养中用Dicamba取代2,42D的结果相同[1]。一般而言,Picloram能显著加快小麦成熟胚形成愈伤组织,但胚性愈伤组织诱导率和植株再生率较低,而Ding等[10]利用低浓度(1.0mg?L–1)培养小麦成熟胚获得了较好的培养效果。Bi等[7]对不同小麦品种成熟胚进行了离体培养研究,发现ABA的浓度虽然对愈伤组织诱导率没有影响,但随着其浓度的增加,愈伤组织质量和分化率有所降低。李宏潮等[22]认为ABA仅对根的分化有促进作用。于晓红等[23]发现加入ABA可以有效抑制成熟胚发芽,并有助于胚性愈伤组织的形成以及愈伤组织再生能力的保持,添加TDZ可明显提高芽分化频率,1/2MS 附加低浓度NAA的培养基可有效促进生根。G aneshan 等[24]的研究表明,小麦成熟胚在添加TDZ或TDZ+BAP 组合的培养基上再生效果较好。

2　小麦成熟胚遗传转化研究进展近三十年来,随着转基因技术的不断完善,小麦遗传转化研究也取得了长足进步。1992年Vasil等[25]以小麦幼胚为外植体,采用基因枪介导法将bar基因导入了长期培养的胚性愈伤组织,首次获得了小麦转基因植株。1997年Cheng等[26]利用农杆菌介导法转化小麦获得成功。随后,花粉管通道法、电激法、PEG法等转化方法相继用于小麦,将各种有益基因转入了小麦,获得了具有抗病、抗逆以及改善品质的转基因小麦,为改良小麦抗性和品质等性状奠定了基础[27]。但目前小麦转基因研究仍存在很多问题,如组织培养再生率低、基因型依赖性强、转化频率低和受体单一等,限制了转基因小麦的快速发展和应用。

迄今为止,转基因小麦研究还主要以幼胚为转化受体,受体的单一性成了制约小麦转基因研究的瓶颈。成熟胚由于不受生长季节的限制,取材方便等优点,有望取代

第4期陶丽莉等:小麦成熟胚组织培养及遗传转化研究进展

幼胚成为小麦遗传转化的方便受体。因而,将小麦成熟胚组织培养技术与遗传转化技术结合对小麦进行遗传改良,一直是大家关注的研究热点。但由于小麦成熟胚培养再生效率低,这方面的成功报道还比较少。目前,尝试小麦成熟胚的转化方法主要有基因枪介导法和农杆菌介导法。

2.1　基因枪介导的小麦成熟胚转化

自基因枪法成功转化小麦以来,一直是小麦遗传转化的主要方法。基因枪法的广泛应用主要是由于受体取材广泛,可以是胚性悬浮细胞、幼胚、成熟胚、幼穗等产生的愈伤组织,也可以是花药、盾片等。另外,基因枪转化技术可以减弱基因型特异性限制,避免农杆菌导致的小麦细胞死亡现象,并可在细胞、组织水平进行操作[27,28]。

随着小麦成熟胚培养技术的发展,应用基因枪法转化小麦成熟胚的研究吸引了科研工作者的兴趣。Wan等[15]将Bobwhite成熟胚纵切后接种在MS附加5.0mg?L–1 2,42D和2.2mg?L–1Picloram培养基上预培养,基因枪轰击包含GFP和N PTII基因的质粒DNA,在MS附加0. 5mg?L–12,42D、2.2mg?L–1Picloram和25.0mg?L–1G418的培养基上筛选2周,转移到MS含同样浓度G418的培养基上分化植株,轰击后2周在15%的组织中或芽中观察到了GFP基因表达,抗性再生植株经South2 ern blot检测征实转化效率为3%。Patnaik等[27]用整粒切胚法诱导成熟胚愈伤组织,然后用基因枪轰击胚性愈伤组织,成功地将抗除草剂BAR基因转入六倍体和四倍体小麦,获得了转基因植株,PCR、Southern blot杂交分析表明转基因后代能够正常分离并稳定遗传。Tang等[17]将成熟胚横切为两部分,利用含胚芽的部分诱导愈伤组织,然后用基因枪介导法进行转化,转化效率达2.3%。Del2 porte等[28]利用基因枪轰击刮碎法诱导产生的愈伤组织,组织化学染色结果显示GUS基因在轰击组织中可以稳定表达,发现预培养6d的愈伤组织最有利于外源基因的转化。林德书等[14]将成熟胚刮碎后诱导愈伤组织,利用基因枪介导法将GUS基因转入了晋麦2148成熟胚愈伤组织,X2G luc染色表明GUS基因已经在小麦成熟胚愈伤组织中表达,瞬间表达率达29%左右。

2.2　农杆菌介导的小麦成熟胚转化

1997年Cheng等[26]利用农杆菌介导法首次获得了小麦转基因植株,建立了农杆菌转化小麦幼胚的技术体系。随后,夏光敏[29]、叶兴国[30]等也分别利用农杆菌介导法转化小麦幼胚获得了转基因植株。与基因枪介导法法相比,农杆菌介导法具有操作简便、成本低、可以转移较大片段DNA、转基因多为单拷贝整合、基因沉默现象较少、后代遗传较为稳定等特点,在小麦转基因研究中一直受到普遍重视[10]。但在农杆菌介导的小麦转化方面,目前多以幼胚及其来源的胚性愈伤组织作为转化受体,极大限制了工作效率。近几年也出现了少数利用农杆菌介导法转化小麦成熟胚的报道,Khurana等[19]以四倍体小麦成熟胚愈伤组织为外植体,利用农杆菌LBA4404(pBI101∷A ct1)转化获得了转基因植株,组织化学染色结果证实外源基因成功整合到受体基因组中。Patnaik等[31]以成熟胚和成熟胚愈伤组织为受体,分别利用携带pBI101:: A ct1、p35SGUSIN T双元表达载体的LBA4404农杆菌进行侵染,PCR以及Southern blot结果均显示外源基因已成功整合并遗传。王艳丽等[32]选用西农222、豫麦66、扬麦6号和Bobwhite等小麦基因型,完整成熟胚和纵切后的成熟胚直接用于农杆菌(菌系为C58C1)侵染,刮碎成熟胚在改良MS、N6等培养基上培养7～10d后用于农杆菌侵染,室温下感染15min后在无菌滤纸上共培养2d,组织化学染色检测部分受体组织中GUS基因(含内含子)瞬时表达,其余受体组织进一步恢复、筛选和再生,证明豫麦66成熟胚对农杆菌感染最为敏感,在三种处理方式的愈伤组织中都观察到了GUS基因表达,表达率分别为3. 3%、64.9%和94.4%,均分别高于其它基因型;成熟胚纵切更利于农杆菌感染,但豫麦66以成熟胚切碎后在含AS 的N6培养基上预培养7d为最高;T0代经PCR和npt II EL ISA检测,获得了20株阳性植株,其中有3株EL ISA 检测呈现阳性,表明外源基因已经整合到了小麦基因组中并已正常表转化完整成熟胚或其愈伤组织,组织化学染色、PCR扩增以及Southern blot杂交结果表明,外源基因已成功整合并遗传,共培养培养基中加入200μmol?L–1乙酰丁香酮可有效提高转化效率,共培养时间2d效果最佳。Ding等[10]利用含pBI121载体的LBA4404农杆菌侵染小麦完整成熟胚,以GUS基因表达和分子检测结果为依据,对转化过程的影响因素进行了研究,认为干燥条件下共培养更有利于农杆菌的侵染。陈立国等[33]以含有pA TC载体的LBA4404农杆菌对小麦成熟胚愈伤组织进行转化,发现菌液浓度OD600为0.8、侵染时间为60min时转化效率最高。

3　存在的问题

相对于其他单子叶植物,小麦基因工程育种研究远远滞后。限制小麦转基因研究发展的首要因素是缺乏有效的受体及其再生体系。小麦幼胚虽然再生性能比较强,但取材在时间和空间上受到很大限制,适宜转化的生理状态对培养条件的要求比较严格,转化周期比较长[16]。相比幼胚,成熟胚取材方便,生理状态一致,不受生长季节限制,是组织培养和遗传转化理想的外植体,如水稻成熟胚再生频率很高,显著促进了水稻转基因研究和功能基因组研究的发展。另外,以小麦成熟胚作为遗传转化的受体,不但节省时间、空间和能源,提高工作效率,而且更经济、方便、实用。然而,小麦成熟胚的离体再生还比较困难,再生频率还比较低。如何诱导成熟胚产生高质量的愈伤组织及高频率再生植株是小麦成熟胚转化的关键。综合多方面的结果,完整成熟胚直接培养容易长芽,但难以产生高质量的胚性愈伤组织,需要对成熟胚进行必要的切割处理。另外,小麦成熟胚培养需要较高的生长素浓度,低浓

?麦　类　作　物　学　报第28卷

度生长素不足以抑制实生苗的生长和诱导胚性愈伤组织。其次,利用GUS基因作为报告基因建立或优化农杆菌转化小麦成熟胚体系时,GUS基因中间需要插入内含子,以确保GUS基因只在小麦细胞中表达,而不在细菌中表达,避免组织化学染色结果的假阳性。

限制转基因小麦研究的另一个主要因素是缺乏再生能力强、农艺性状优良的受体基因型。目前开展小麦转基因研究利用的材料大多是模式品种Bobwhite,根据笔者课题组开展小麦幼胚培养和成熟胚培养的资料,Bobwhite 并不是最好的基因型,况且Bobwhite农艺性状较差,以Bobwhite为受体获得转基因材料后也很难直接商业化应用。因而选择具有良好组培特性的主栽品种,筛选对转化敏感的基因型,仍是小麦基因工程育种的重要环节[17]。利用小麦幼胚为受体进行农杆菌转化中存在的主要问题是小麦幼胚经农杆菌侵染后停止生长,褐化死亡现象严重,不能进一步产生胚性愈伤组织和获得抗性再生植株,从而严重制约了小麦幼胚在农杆菌介导的小麦遗传转化中的应用[34]。

4　研究前景

小麦成熟胚经农杆菌侵染后褐化坏死现象不严重,作为农杆菌转化的受体具有非常广阔的应用前景。因此,需要继续探讨影响小麦成熟胚愈伤组织诱导和再生频率的因素、进一步优化成熟胚培养体系和转化体系。

笔者课题组利用相同基因型对小麦成熟胚4种培养方式(完整胚直接接种、胚乳支撑接种、成熟胚刮碎接种、成熟胚切割接种)进行了比较,表明成熟胚刮碎接种再生效果最好,其次为成熟胚切割接种,完整胚直接接种和胚乳支撑接种再生频率很低。在利用小麦成熟胚刮碎培养技术的基础上,对培养基进行了改进,同时开展了农杆菌转化研究,发现培养基中加入山梨醇、甘露醇、Dicamba、AgNO3等成分可明显提高成熟胚碎末组织再生率、保持农杆菌侵染后愈伤组织的活力和抑制农杆菌引起的细胞死亡现象。利用改进后的培养基,济麦20、郑9023、石4185、Bobwhite、邯6172和轮选987成熟胚刮碎组织的再生率32%～84%。利用农杆菌转化法将npt II等基因转入了小麦成熟胚愈伤组织,获得了转基因植株,并对转基因植株进行了PCR、EL ISA和Southern blot等检测,转化效率0.6%左右,需要进一步提高转化效率。

小麦成熟胚再生体系和转化体系的不断完善,对于促进小麦基因工程育种和小麦功能基因组研究具有重要意义。

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817?麦　类　作　物　学　报第28卷

烟草遗传转化实验

烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]

实验八植物细胞悬浮培养实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。实验器材：超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。实验材料：烟草叶片愈伤组织。实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml 三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。烟草遗传转化实验实验目的

小麦组织培养的研究进展

小麦组织培养的研究进展摘要：小麦组织培养体系的建立与完善是应用植物基因工程改良小麦品质的重要基础和保证。在小麦组织培养中，几乎各种器官、组织均曾被用作外植体进行离体培养，比如小麦根、幼叶、种子、顶端分生组织、花药、原生质体、幼穗、成熟胚以及幼胚等。其中重点的对小麦幼胚和成熟胚等外植体通过不同组培体系最终获得再生植株的研究进展进行了综述，以期为小麦组织发生学、胚胎学、细胞工程及遗传操作等方面提供参考。关键词：小麦；外植体；组织培养；研究进展小麦是世界上分布范围和栽培面积最广，在中国种植面积仅次于水稻，是中国人民的主要粮食作物之一（奚亚军等，2002）。随着社会经济的发展及生活水平的提高，对其抗但在生产过程中，不断受到生物、非生物等因素的胁迫，严重影响其产量及品质。实践证明，利用植物基因工程（覃建兵等，2001）改良小麦品质是一行之有效的途径。虽然转化方法较多且日趋成熟，但限制其发展的一个重要因素是小麦的植株再生频率低，而且建立稳定的小麦再生体系也比较困难。所以，在小麦组织培养过程中，建立高频率的植株再生体系是小麦转化成功的重要基础和保证。本文重点对幼胚和成熟胚等小麦外植体的选择、处理方法、培养基的选择激素影响等方面作了扼要论述。 1 外植体来源的选择外植体的来源即材料的来源，是细胞培养成功的关键之一。虽然植物体的所有细胞都含有相同的基因和具有全能性，但是由于细胞的分化结果在不同的组织、器官中基因的表达有所不同。 1.1幼胚小麦幼胚转化体系的建立对促进小麦基因工程研究和功能基因组研究具有重要的意义。以幼胚为外植体进行小麦组织培养的方法被大多数学者认为是最有效的培养方式。有研究对小麦未成熟胚离体培养得到的再生植株，认为未成熟胚培养诱导和筛选无性系变异，可作为小麦品质改良的一种手段（胡尚连等，1998）。还有对3个品种(系)的研究，确立了小麦幼胚最佳取材时期的种子形态指标,为取材节省了大量时间，并大大减缓了接种压力（刘少翔等，2003）。王常云等人对15个小麦品种进行离体培养，结果诱导率达到了100%，得出品种间分化率有明显的差异（王常云等，1999）。小麦幼胚愈伤组织诱导率很高，通过对愈伤组织的直接或间接筛选，可以发生定向变异，主要体现在农艺性状（如株高等），抗性和品质方面，故小麦幼胚培养主要体现在新品种的选育上（于相丽，2009）。

玉米遗传转化体系的优化及HrpZ基因转化玉米的研究

玉米遗传转化体系的优化及HrpZ基因转化玉米的研究 HrpZ基因是一种来源于植物病原菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae) 的蛋白激发因子,它能引起非寄主植物的过敏性反应(hypersensitive response, HR),表现为受侵染组织的快速、局部的萎缩和死亡,这就限制了病原菌进一步扩散的可能性。HR反应后,植物体内出现了一系列的防反应,如强化结构屏障作用,合成裂解酶或者产生植物抗毒素,具体表现在能够防止病菌二次或继发性侵染。这种非局部化、长期的诱导保护作其抗菌谱很广,极类似于“系统获得性抗性”(systematic acquired resistnace SAR)。玉米(Zea may L.)是世界上重要的粮食、饲料作物,也是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料。产量居农作物之首,也是重要的遗传模式植物。长期以来,玉米优良基因型高效再生体系的建立一直是人们研究的热点。我国是世界上仅次于美国的第二大玉米生产国,玉米生产在国民经济中占有非常重要的地位。然而,生产上玉米病害一直是影响玉米产量的重要限制因素, 传统的常规育种由于抗源的缺乏和不同物种间的遗传隔离,使抗病育种工作受到了极大的限制。利用基因工程技术进行玉米遗传改良,增强玉米抗病虫和耐逆境能力,提高产量,改善品质,是玉米遗传育种的一个新方向。因此,玉米的基础研究和遗传改良具有重大的理论和现实意义。为进一步筛选和建立优良玉米自交系的再生和遗传转化体系,本文分别以玉米幼胚,成熟胚,茎尖,根尖及幼叶为外植体进行愈伤诱导,较系统地研究了常规优良自交系的愈伤组织形成及分化再生的影响因素、农杆菌介导遗传转化体系,并对转化株进行了PCR检测,获得了如下主要结果：1.选用了生产上广泛应用的

植物遗传转化大实验

植物遗传转化大实验一、实验目的与原理简介农杆菌介导的遗传转化系统是外源DNA进入植物细胞的最成功和应用最广泛的方法，农杆菌可浸染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，甚至裸子植物。转化植物细胞的农杆菌主要有两类，即根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。已有研究表明，影响农杆菌介导植物基因转化的因素很多，农杆菌菌株、植物基因型和外植体、培养方法、不同的选择标记等因素都影响农杆菌介导的遗传转化。目前报道已有许多植物通过农杆菌的遗传转化获得了转基因植株或毛状根。二、发根农杆菌介导的遗传转化步骤 1．无菌组织的培养取组培苗幼嫩叶片，在超净工作台中切成0.5x0.5cm的方块，并在叶片上刻痕，接种于愈伤诱导培养基中，暗培养3周后作为受体。在农杆菌浸染前，将愈伤组织在无菌条件下切割成小块在愈伤诱导培养基上分别预培养，增加受体细胞的活性进而提高转化率。 2．农杆菌的培养在转化平板上挑取c58c1单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基（含相应抗生素）中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃振荡培养过夜；室温下4000rpm, 10min，弃上清夜，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600=0.5左右。 3．共培养剪取无菌苗的叶片和茎段，放入发根农杆菌MS悬液中浸泡5min，倒出悬液，用无菌吸水纸吸干表面余菌，转到共培养培养基MS上，光照培养2天。 4．毛状根的诱导和培养将共培养的外植体转入到1/2 MS + Cef 500mg/L培养基上光照培养。随时检测外植体的染菌情况，如出现细菌生长过多，须马上转移到新筛选培养基中培养。20天左右即可长出毛状根，剪取毛状根，接种于1/2 MS + Cb 250mg/L培养基上暗培养数周，选择生长快、分枝好的毛状根转入脱菌筛选培养基中继代筛选。三、毛状根的分子鉴定 1、毛状根基因组DNA提取。（采用CTAB法小量提取）。 2、转化基因PCR鉴定。四、实验说明能否成功地获得转基因植物，取决于起始材料对农杆菌的感受性、对转化细胞形成的新生组织的选择能力以及中选组织的再生能力。遗传转化时应该注意以下几点： 1、对农杆菌进行必要的诱导处理，注意培养条件、菌液浓度、侵染和共培养的时间等，在提高瞬时表达的同时要防止细菌的过度生长； 2、对再生植株的细胞起源需有明确的了解，在培养方法、培养基的设计上要有利于转化细胞的生长、分裂及植株再生；

马铃薯遗传转化方法

农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系 Steve Millam 摘要：马铃薯是一种全球性的重要农作物，其块茎作为营养丰富的食物，产量很高。马铃薯之所以成为大量研究的焦点，是因为它既作为一种主要粮食作物，又能作为所关注的化合物的潜在重要来源。转基因技术的发展和应用已经用于马铃薯上，并以此来引进基础且实用的新奇目标特征。本文描述了一个快速、高效和低成本的马铃薯遗传转化系统，与平常的转化相比，其转化效率可超过40%。基于核酸印迹法的平均值计算，证实了每个外植体切片在转基因上的独立性。将节间切片与农杆菌一起培养，然后在卡那霉素的筛选下，经历一个双阶段的愈伤组织诱导/出芽系统。用这种描述的方法可以获得很高的幼芽再生率，而且经过2次继代培养后，离体茎段从伤口末端生根，保证有95%的外植体被转化。这种转基因状态可以通过分子分析来证实。马铃薯的块茎生长也促使了大范围的进一步的研究。 1．介绍马铃薯是最早用于遗传转化的植物之一。Ooms等人在1986年用农杆菌浸染马铃薯Desiree品种的组织并使组织再生，这成为马铃薯转化的直接证据。转基因品种Desiree和Bintje所用的农杆菌由Stiekma等人提供。de Block报道了一种以叶圆片作为靶组织，且与基因型无关的转基因方法。Visser等人以茎段和叶片为外植体，提出了包括再生和转化在内的两步法，并作为目前众多已使用的实验方案的基础。各种马铃薯组织相对容易的根系再生也支持了这些已经报道的马铃薯遗传转化系统。目前许多正在使用的实验方案都报道了一个两步再生法，及先进行愈伤组织诱导，再进行根系再生。在愈伤组织诱导阶段通常会尽可能避免马铃薯体细胞突变。第一步通常是加入1-5mg/L的玉米素（zeatin）或者玉米素核苷（zeatin riboside），并结合低浓度的生长素（通常是的萘乙酸（NAA）或者吲哚乙酸（IAA））,以此促进外植体产生愈伤组织。第二步，将玉米素浓度降低20%，将生长素浓度降低10倍，同时加入赤霉素来刺激根系再生。每个外植体的再生速率都很高，经过4-6周可生出第一批根，培养10-12周后可每个外植体都会长出至少10条根。以卡那霉素（kanamycin）或者潮霉素（hygromycin）作为筛选标记可以很容易地用肉眼进行分析，然后切除可能与转化无关的根。那些含有抗生素抗性基因的苗将会很明显从茎的切口处长出根，而那些非转基因的苗将不会生根或者从不定位点生根。使用不同的栽培品种或者组织，其转化效率也不同。但是根据重复实验的记录显示，从最初的外植体到确定的转基因单株的比率在40%到100%之间。

植物组织培养的研究进展和发展趋势

植物组织培养的研究进展和发展趋势（甘肃农业大学生命科学技术学院植物生物技术，甘肃兰州730070）摘要:植物组织培养是根据植物细胞具有全能性的原理而发展起来的一门生物技术。本文简要概述了植物组织培养的概念及研究进展，较全面的综述了植物组织培养新技术以及在快繁脱毒、育种、种质资源保存、次生代谢物提取、基因转化等方面的研究现状，最后展望了植物组织培养的发展趋势。关键词：组织培养；研究进展；发展趋势 Research Progress in Plant Tissue Culture and trends (College of life science and technology of plant biotechnology of Gansu Agricultural University,gansulanzhou 730070) Abstract: Plant tissue culture plant cells are totipotent under the principle and developed a biotechnology. This article provides a brief overview of the concepts and plant tissue culture research, a more comprehensive overview of plant tissue culture propagation of new technologies as well as in detoxification, breeding, germplasm conservation, extraction of secondary metabolites, and other aspects of gene transfer research status , Finally, the future trends in plant tissue culture. Key words: organizational culture; research status; trends 引言植物组织培养是20世纪之初，以植物细胞全能性为理论基础发展起来的一门新兴技术，是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，在人工配制的环境里培养成完整的植株，也称离体培养或植物克隆。自1902年德国科学家Haberlandt提出植物细胞具有全能性理论, 到1934 年美国White 等用番茄根进行离体培养证实这一观点以来,植物离体培养技术在基础理论和应用研究，已广泛应用到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种以及生物化学等各个研究领域, 成为生物学科中的重要研究技术和手段之一[1]。近年来，随着科学技术的不断发展，植物组织培养新方法和新技术不断涌现，研究重点也由器官、细胞水平向分子、基因方向转移。21世纪，生物技术是最有生命力的一门学科，而植物组织培养作为一种基本的试验技术和基础的研究手段，被认为具有巨大的潜力，现就植物组织培养技术研究进展做一简单综述。 1在植物育种上的应用植物组织培养技术对培养有粮作物品种开辟了全新的途径。目前，国内外已

小麦遗传转化方法及其研究进展

小麦遗传转化方法及其研究进展资源与环境学院姓名：漆海龙学号：3115701060 摘要:在粮食作物中，小麦属于遗传转化最为困难的作物，加上转基因研究起步较晚，基因工程育种进程明显落后于其它作物。随着基因枪的问世、新的选择标记基因和高效启动子的运用，1991年以后小麦转基因研究开始增多。目前小麦遗传转化尽管有多种方法, 但转化效率仍然很低, 一个重要原因是遗传转化方法尚不成熟, 因此建立合适的转化方法是小麦遗传转化成功的关键. 本文综述了小麦基因枪转化、农杆菌介导的遗传转化和花粉管通道法等几种重要遗传转化方法研究的最新进展, 分析了各种方法的基本原理、优缺点及其影响因素. 关键词:小麦遗传转化, 基因枪法, 农杆菌介导法, 花粉管通道法正文：小麦是世界上最重要的粮食作物之一, 在中国是仅次于水稻的第二大作物，也是人类重要的植物蛋白质来源( 约占谷物蛋白质的38% ) . 其种植面积和产量约占谷物种植面积的30%. 小麦面粉约含70%~ 80% 的淀粉.通过遗传转化可以打破物种之间的遗传限制，利用转基因技术将外源基因导入小麦，可以实现新品种的定向改良，从而创造新的小麦品种。与国外小麦相比, 我国小麦的蛋白质总量不低, 但是在加工品质上有较大差距, 主要原因是我国小麦贮藏蛋白缺少优质蛋白质亚基。目前在小麦品质改良领域中主要有两个热点:一是通过特异地改变某些亚基的构成与比例, 增加小麦中蛋白质及必需氨基酸含量来改良其营养品质, 进而提高烘烤品质. 二是调节淀粉生物合成途径, 以培育直链淀粉含量少甚至没有蜡质的小麦品种,提高其加工品质. 近几年来,基因工程技术的发展和完善, 为小麦品种改良提供了一条新的途径. 小麦转基因研究大多采用授粉后13～14 d 的幼胚为受体材料，表达载体构建中普遍采用Ubi、E35S 等启动子和bar、nptⅡ、EPSPS 等筛选标记基因，筛选剂一般使用Bialaphos、Glufosinate、G418 和Glyphosate 等，成功利用的农杆菌菌系包括ABI、Agl1、c58C1、LBA4404 和CP4 等。总之，小麦转基因研究涉及报告基因或标记基因较多，目的基因较少，所用的受体基因型大多是Bobwhite。因此，拓宽小麦遗传转化的受体范围，完善农杆菌转化小麦的技术体系，将一些控制抗病、优质、抗逆和抗虫的外源基因导入小麦，是今后小麦转基因研究的重点。小麦遗传转化研究开始于20 世纪80 年代末期, 所谓的小麦遗传转化就是将目的基因导入小麦, 整合在染色体上, 并获得携带目的基因后代的过程. 与其他作物相比, 小麦转基因成功的例子较少, 转化率也只有百分之几, 限制其发展的一个重要因素是组织培养植株的再生频率低, 而且建立稳定的小麦再生体系比较困难. 另一个原因是小麦基因组比较大, 具有17 Gb, 而且生长在世界各地的用于制造面包、具有烘烤品质的小麦, 95%是六倍体, 其他的则是四倍体硬粒小麦.另外,小麦的遗传转化体系也不完善.到目前为止,小麦转基因最常用的方法仍集中为基因枪法( microprojectile bombardment ) 、农杆菌介导法(Agrobacterium mediated transformation)和花粉管通道法( polly tube pathway).虽然也有一些其他转化方法的报道, 比如: 聚乙二醇法( polyethyleneglycol mediated transformation of protoplasts ) 、电击法( electroporation) 、碳化硅纤维介导法( silicon carbide whiskers) 、激光微束穿刺法( Microinjection) 和低能离子束介导法( ion irradiation) 等, 但随着基因枪法、农杆菌介导法的不断改进, 这些转化方法已经被逐步淘汰. 现在基因枪法( microprojiectile bombardment )，农杆菌介导法( Agrobacterium mediated transformation) 和花粉管通道法( polly tube pathway ) 是小麦成功转化的基础方法, 以下主要介绍这三种方法介导的小麦遗传转化及影响因素.

植物细胞组织培养研究

植物细胞组织培养研究摘要：植物组织培养是指利用细胞全能性培养再生植株的技术，具有快速繁殖、克服杂交不亲和及保存种质资源等优点。本文先介绍了植物组织培养的原理与发展历程，综述了植物细胞组织培养的研究与应用，主要介绍了其在农业、育种、育苗、人工种子及生物反应器中的相关研究情况与简单介绍。关键词：植物细胞；组织培养；研究进展；应用 1 引言植物细胞与组织培养是细胞工程中一类重要的研究内容，其中植物组织培养是20世纪发展起来的技术，细胞培养技术也是是细胞工程的核心技术之一。二十世纪初(1902年)，德国植物学家G·Haberlandt最早开始植物组织培养的研究，随着生产和科学水平的提高，植物组织培养技术已相当成熟和精确[1]。研究的领域从植物生理学科逐渐扩展到细胞生物学、分子生物学、遗传学、园艺学、育种学等学科[1]。植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在无菌条件下接种在含有各种营养物质及植物激素的培养基上进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术[2]。狭义是指组培指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。运用组织培养方法可以在比较简单易观察的条件下研究细胞、组织或器官的繁殖、生长和分化，以及各种外界因素对它们的影响，从而为解决农业生产和药物生产中的某些问题开辟了广阔的前景，目前已有若干重要成果应用于生产实践中[3]。 2 植物细胞组织培养原理植物组织培养即植物无菌培养技术,又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，即每个植物细胞里都含有一整套遗传物质，只不过在特定条件下不会表达。将已处于分化终端或正在分化的植物组织脱分化，诱导形成愈伤组织，再在愈伤组织上形成新的丛生芽。具体可利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、

小麦组织培养研究进展

小麦组织培养研究进展李尚中1，赵晖2 1.甘肃省农科院旱地农业研究所，兰州（730070） 2.甘肃农业职业技术学院小麦育种研究所，兰州 (730020) E-mail ：lisz7751@https://www.sodocs.net/doc/655822124.html, 摘要：小麦组织培养是利用基因工程改良小麦品种的重要基础和保证。对不同小麦外植体(幼胚、幼穗、成熟胚、幼叶、根、小孢子、花药、原生质体等)组织培养研究现状进行了综述。关键词：小麦，外植体，组织培养 1. 前言小麦是世界上分布范围和栽培面积最广，总产量最多的粮食作物，在我国种植面积仅次于水稻，是我国人民的主要粮食作物之一[1]。随着生物技术的发展，运用基因工程进行小麦品种改良越来越受到国内外育种家的重视，并已成为世界各国作物遗传育种优先研究的课题之一。而外源基因通过基因工程技术向小麦的转移要求建立高效的离体培养系统，这种系统必须对广范围的基因型而言是快速、可靠和适用的。因此，小麦高效组织培养系统的建立仍是许多研究者关注的科学问题之一。 2. 小麦组织培养研究现状 2.1 幼胚组织培养自1978年Shimada [2]成功地通过小麦幼胚培养获得再生植株以来，幼胚被共认为是小麦组织培养最有效、最理想的外植体来源之一[3]。在小麦幼胚培养中，如何确定胚龄是一个令人困惑的问题，首先是如何确定胚龄的衡量标准问题，一些学者选用“一定长度”或“直径”的胚作为衡量胚龄的标准[4]。而另有学者则倾向于选用“受粉后发育时间”作为衡量胚龄的标准 [5]。其次，是最适胚龄的确定，因为不同品种、不同地区最佳胚龄不同[6]。王常云等[7]认为烟台地区冬小麦的有效胚龄为14-20天，最适胚龄为16天，具体到每个品种，最适胚龄只有一天，且取决于基因型。Ｓ.Ito 等[8]认为取授粉后10天的幼胚培养较为适宜。覃建兵等[9]研究表明最适于培养的未成熟胚大小为0.15-0.20cm 之间。梁竹青等P [4]通过三年的试验，选用直径为1.0-1.5mm 的未成熟胚作为胚培养的的“最适胚龄”,安海龙等[10]认为幼胚直径在0.5-0.8mm 为宜。关于幼胚的取材时机，虽然人们标准各异，但是还有个参照范围。在实际应用中以授粉后的时间间隔为标准进行取材较为方便。通过对麦基一号、MS 、white 、B 5、Miller 、N 6及C 17等多种培养基进行比较研究，结果发现MS 培养基为最佳的基本培养基。在MS 基本培养基中添加谷氨酰胺、天冬酰胺、椰子乳等物质，有利于愈伤组织的形成及植株分化，在继代培养中提高盐浓度（2MS ）或加适量的水解酪蛋白（300-500mg/ml ）均有利于胚性愈伤组织的生长及绿苗的形成，调节铵态氮和硝态氮的比例可以提高小麦植株分化频。目前，幼胚培养一般均用MS 作基本培养基，少数以MB （MS 无机盐，B [8][10，11][12][13]5有机物）做基本培养基，生根壮苗时用1/2MS 培养基。 [14]在诱导幼胚愈伤组织过程中，2，4-D 是用的最广泛的生长素类激素。研究者们普遍认为2，4-D 对小麦幼胚培养胚胎发生具有关键作用。2，4-D 的使用浓度在0.5-5mg/ml 不等。2mg/ml2，4-D 是诱导盾片愈伤组织的适宜浓度，并抑制胚的早期萌发[15]。低浓度的2，4-D

水稻遗传转化体系Protocol

水稻遗传转化体系Protocol Introduction 1．水稻的遗传转化研究历史与现状 20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源 3]。1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1 ~ 获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼 13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5 ~ 独立的转化植株)。 2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11] a. 转基因抗虫水稻对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。 b. 转基因抗病水稻见抗水稻病毒研究 c. 转基因抗旱水稻 d. 转基因营养高效利用水稻

植物遗传转化研究进展

植物遗传转化研究进展重庆师范大学生命科学学院生物科学（师范）专业 2009级指导教师摘要：植物遗传转化是一项农业生物技术，它通过某种途径或技术将外源基因导入受体细胞的全基因组中，并使之在受体细胞中得以充分表达。目前一些重要农作物转基因品种已经或即将投入到实际应用，随着研究的不断深入,本文对植物遗传转化的技术作出了新的展望。关键词：植物遗传转化；植物遗传转化方法；应用；进展 Abstract：Plant genetic transformation is a kind of agricultural biotechnology.It delivers to the whole-genome of receptor cells through a certain approach or technique to make the exogenous genes fully expressed in receptor cells. At present, genetically modified varieties of some important crops have been or are about to put into the practical use. with the deepening of the research,this paper makes a new outlook of the plant genetic transformation technology. Key words: Plant genetic transformation; the approaches of plant genetic transformation; application; progress 植物遗传转化是指以植物的器官、组织、细胞或原生质体作为受体，通过某种技术或途径转入外源基因，获得使外源基因稳定表达的可育植株。遗传转化也称为转基因技术。转基因植物的研究始于20世纪70年代。到了20世纪80年代，由于基因操作技术的提高和目的基因构建模式等内容的基本完成，植物转基因技术便应运而生。1983年获得了第一例转基因烟草，使植物基因工程发生了质的飞跃，植物转基因技术也已经得到了广泛的应用和发展，人们开始对外源基因导入植物细胞的方法进行大量的探索，建立了多种方法用于植物的基因转化。目前应用最普遍的植物基因的遗传转化方法主要有农杆菌介导法和DNA直接转入法[1,2]。

植物组织培养发展现状研究

植物组织培养的发展研究进展摘要：植物组织培养作为一种有效的技术手段，已经被广泛应用于生产实践的各个领域。本文综述了植物组织培养的应用现状，指出其在雨中和优种块繁等方面的科技支撑作用。同时概述了有关新技术的开发利用，及应用前景展望。植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。植物组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、胚胎、原生质体等，在人工配制的培养基上给予适宜的培养条件，进行繁殖的方法。由于是在试管内培养，且培养的是脱离植株母体的培养物，故也称离体培养或试管培养。目前，植物组织培养技术研究已经取得巨大的进展，在观赏植物，如菊花、牡丹、百合等方面有诸多应用。同时，许多观赏植物已经实现产业化生产，建立了一套相对完善的快繁体系，取得了明显的经济和社会效益。 1 植物组织培养的过程组织培养的技术过程大致分为六步：植物培养材料的采集，培养材料的消毒预处理，制备外植体，接种和培养，根的诱导，炼苗移植。以上个步骤均在无菌条件下进行。 2 植物组织培养的应用现状 2.1 在植物育种方面的应用 2.1.1单倍体育种单倍体植株往往不能结实，难以进行繁殖。在培养中用秋水仙素处理，可使染色体加倍成纯合二倍体。这种培养

技术在育种上的应用多为单倍体育种。单倍体育种具有高速、高效、基因型一次纯合等优点。因此，通过花药或花粉的培养的单倍体育种已成为一种新的育种手段。 2.1.2 胚培养采用人工的方法在无菌条件县从种子中将成熟胚和未成熟的胚分离出来，然后放在人工合成的培养基上培养，使它发育成正常的植株，从而有效的克服远缘杂交不亲和的障碍，获得杂种植物。目前，在这一方面获得成功的自交或远缘杂交不亲和性植物有怀地黄、矮牵牛、普通小麦、黑小麦等。 2.1.3 培养细胞突变体在组织培养过程中，细胞处于不断分生状态，易受培养条件和外界环境（如放射、化学物质）的影响而产生诱变，从中可以筛选出对人们有利的突变体，从而培育新品种。如抗寒性，耐盐碱性突变新品种的培育。 2.1.4 细胞融合通过植物原生质体的融合，可以克服有性杂交不亲和性而获得体细胞杂种，从而创造出新种群或育成优良品种。目前采用细胞融合方法已培育出多种植物新品种。 2.1.5 基因工程利用植物组织培养技术建立植物的遗传再生体系，是转基因育种的关键所在。在1990年，我国自行研制的抗烟草花叶病毒烟草在辽宁进行了商业化种植，成为世界上第一例商业化生产转基因植株。目前我国转基因植株研发的整体水平在发展中国家处于领先地位，在一些领域已经进入国际先进行列。 2.2 脱毒及快速繁殖植物脱毒与快繁是目前植物组织培养应用最多、最有效的一项技术。许多农作物都带有病毒，特别是无性繁

目的基因的遗传转化

实验十目的基因的遗传转化一、目的基因的表达载体构建 1. 实验目的本实验以强化植物基因工程平台技能训练为目的，涵盖PCR分离克隆全长目的基因、Gateway 技术构建目的基因的表达载体、农杆菌介导目的基因的转化、转基因植株的驯化和移栽等系列实验。此外，还就如何利用新型的反向遗传学技术RNAi（RNA interfere，RNA 干涉）进行基因功能研究进行试验指导。为从事相关领域的科学研究奠定基础。通过本实验，要求学生理解和掌握Gateway 技术构建目的基因的表达载体的基本原理和具体实验步骤。 2. 实验原理利用高保真聚合酶，采用PCR方法在克隆基因两侧引入attB重组位点，然后将含有attB 位点的PCR产物与含有attp位点和Gateway BP Clonase混合，之后转化E. coli。在两对att 位点之间的位点特异性重组过程中产生一个融合载体，融合载体随即分解成两个分子，重组位点在结构上重新分配，目标基因进入新的载体骨架，通过筛选阳性克隆，获得此重组产物，称为“entry克隆”。在得到的entry克隆中目标基因位于att重组位点之间。将此重组产物与选定的Gateway载体和Gateway LR Clonase酶混合，在entry克隆中的attL位点间的序列取代表达（目标）载体的attR位点之间的序列即目标基因进入表达载体，形成表达（目标）克隆（图）。 Gateway技术构建植物表达载体原理 3. 仪器设备微量取液器、制冰机、微型离心机、PCR仪、凝胶成像系统、毛细管自动测序仪、电子天平、高速冷冻离心机、振荡器、恒温金属浴、干燥箱、紫外分光光度计、电泳仪、-80 ℃冰箱、-20 ℃冰箱等。 4. 实验试剂克隆全长基因，pDONR TM221 载体（Invitrogen，12535-019），目标载体（购自Invitrogen，

农杆菌介导的植物遗传转化研究进展

生物技术进展 2011年第1卷第4期260 265 Current Biotechnology ISSN 2095-櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅殯殯殯殯 2341 进展评述 Reviews 收稿日期：2011-08-30；接受日期：2011-10-11基金项目：国家自然科学基因项目（31070139）资助。作者简介：姚冉，硕士研究生，研究方向为遗传学。*通讯作者：张志芳，研究员，博士，博士生导师，主要从事基因工程研究。E-mail ：zhangzf@mail．caas．net．cn 农杆菌介导的植物遗传转化研究进展姚冉1，2，石美丽1，潘沈元1，沈桂芳2，张志芳 2*1．徐州师范大学生命科学学院，江苏徐州2211162．中国农业科学院生物技术研究所，北京100081摘要：农杆菌介导的转基因方法是目前植物遗传转化的重要方法之一。本文从农杆菌转化原理、菌株比较及载体发展入手，系统讨论了植物转化受体对转化效率的影响，同时分别综述了农杆菌介导转化技术在双子叶和单子叶植物转化应用中的最新进展。关键词：农杆菌；遗传转化；进展 DOI ：10．3969/j．issn．2095-2341．2011．04．06 Progress on Agrobacterium tumefaciens -mediated Plant Transformation YAO Ran 1，2 ，SHI Mei-li 1，PAN Shen-yuan 1，SHEN Gui-fang 2，ZHANG Zhi-fang 2* 1．School of Life Science ，Xuzhou Normal University ，Jiangsu Xuzhou 221116，China 2．Biotechnology Research Institute ，Chinese Academy of Agricultural Sciences ，Beijing 100081，China Abstract ：In current ，Agrobacterium -mediated gene transferring is one of major methods used in genetic transformation of plants．This paper systematically reviewed the effect on plant transformation efficiency based on the introduction of the principle of this transformation ，comparison among different kinds of Agrobacterium strains and the development to transformation vectors．In addition ，the newly progresses on the Agrobacterium -mediated transformation of dicotyledonous and monocotyledons species transformation were also discussed ，respectively． Key words ：Agrobacterium tumefaciens ；genetic transformation ；progress 植物遗传转化（plant genetic transformation ）技术也称植物转基因技术，是应用DNA 重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门技术［1］。目前最常用的转基因方法是基因枪法和农杆菌法。基因枪法的基本原理是利用表面附着有外源DNA 的金属微粒在高压装置中加速后高速运动到受体细胞中，从而达到转化DNA 的目的。但是基因枪法与农杆菌介导法相比，存在着转化率低、外源DNA 整合机理不清楚、得到的转化体往往是嵌合体、遗传稳定性较差、转入外源基因的沉默现象突出等缺点。农杆菌属于革兰氏阴性土壤杆菌，分根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes ）。根癌农杆菌中含有Ti 质粒，能诱发冠瘿瘤。发根农杆菌中含有Ri 质粒，可以导致受伤部位产生毛发状根。Ti 质粒（包括Ri 质粒）上有一段转移DNA （transfer DNA ，又称T-DNA ），受伤的植物细胞中产生的化学复合物可使农杆菌吸附于植物上，使T-DNA 转移到植物细胞内并整合到染色体上。目前大量研究工作的目标是明确农杆菌将外源DNA 导入受体细胞的分子机制，从而改进农杆菌菌株、质粒和转化技术，以进一步提高转化效率。由于植物受体在转化过程中的作用尚不十分明确，所以农杆菌在转化过程中如何进入植物细

小麦成熟胚培养及耐盐突变体的筛选(1)

小麦成熟胚培养及耐盐突变体的筛选叶校成 [淮北师范大学生命科学学院2009级生物工程] 摘要：[目的]利用小麦成熟胚培养技术获得愈伤组织以实现其耐盐突变体的筛选，并且提高小麦成熟胚愈伤组织的诱导率。[方法]以煤生0308为材料，用正交试验的方法研究6-BA﹑KT﹑2,4-D3种营养物质对小麦愈伤的影响。[结果]表明2,4-D的浓度对愈伤的影响最大，6-BA对实验的影响最小，KT的影响介于二者之间。由正交分析结果可以得出最优培养基配方为：MS+2,4-D 0.5mg/L+KT 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖3%+琼脂0.8%。关键词：小麦愈伤组织成熟胚正交法耐盐突变体 Study on Culture of Mature Embryo from Wheat and Screening of Salt-tolerant Mutants Y e XiaoCheng [Biological Engineering Level 2009 of Huai Bei Normal University Life Science College] Abstract:[objective] The use of wheat embryo culture technology for mature callus to achieve their salt resistance mutants selection, and improving wheat mature embryo callus induction rate. [method] T o coal born 0308 for material, using the orthogonal experiment method, the study of 6-BA ﹑KT, 2, 4-D3 kind of nutrients to the influence of wheat injury. [result] The result shows that the concentration of 2, 4-d on the injury the most influence, 6-to minimal impact on the BA, the influence of KT between two composes. By orthogonal analysis results can be concluded that the optimal medium formula: MS + 2, 4-d 0.5 mg/L + KT 1.0 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + sugar 3% + 0.8% AGAR. Key words: wheat callus mature embryo orthogonal method to salt mutant 前言小麦是世界上最重要的粮食作物之一，小麦成熟胚具有取材方便、不受季节限制等优点,已成功应用于小麦组织培养及遗传转化研究,可望取代幼胚成为小麦遗传转化的方便受体。中国盐碱地分布面积广，严重影响小麦的产量，因此小麦耐盐突变体的筛选队农业生产十分重要。近年来，小麦组织培养一直受到广泛关注，以小麦幼胚，幼穗，叶片，根等外植体进行培养都成功获得了再生植株。为了提高小麦成熟胚的出愈率和植株再生率，人们做了不少研究，而小麦成熟胚具有良好再生能力，种子保存期长，易获得，可用于较长时间的研究。所以本次试验以小麦的成熟胚为外植体源，3种激素九种不同激素配比的培养基进行试验研究。

植物组织培养论文

院（系）名称生命科学学院专业名称生物技术学生姓名杨佳霖学号131344050 指导教师于相丽完成时间2015年12月24日

小麦组织培养的研究进展杨佳霖（生命科学学院生物技术专业学号：131344050）摘要：小麦是世界上种植面积和产量均居榜首的重要粮食作物。综合世界粮农组织(FAo)的统计报告?1，1999年，世界小麦种植面积达2．14亿hm2，是人类蛋白质的主要摄入来源。实践证明，利用植物基因工程改良小麦品质是一行之有效的途径[2．3]。虽然转化方法较多且日趋成熟，但限制其发展的一个重要因素是小麦的植株再生频率低，而且建立稳定的小麦再生体系也比较困难。所以，在小麦组织培养过程中，建立高频率的植株再生体系是小麦转化成功的重要基础和保证，笔者就不同来源和不同生理状态的小麦外植体通过不同组培体系而最终获得再生植株的进展作一简要概述。关键词：小麦；组织培养；研究 1外植体来源目前研究报道的小麦外植体源有幼胚、幼穗、成熟胚、幼叶、根、种子、花药、胚轴和胚芽鞘等。张根发曾经提出，脱分化能力与再分化过程具有一致性，认为外植体的类型对小麦体细胞组织再生能力影响很大。 1.1 幼胚与幼穗幼胚是目前公认最好的小麦外植体源，其愈伤组织的诱导和植株再生能力最高。但小麦幼胚的培养再生过程往往表现出明显的基因型差异，不同的小麦基因型可以在致密愈伤组织的诱导、分化及分化能力的保持等方面表现出较大差异。此外，选择适宜的幼胚取材时期对获得相对较好的培养效果是十分重要的。相比较而言，幼穗虽然比幼胚愈伤组织出现晚，生长慢，植株再生绿苗率低，但在众多外植体中，幼穗也不失为一种具有较高再生率的好材料。但不足之处是幼胚和幼穗作为外植体源受到季节的限制，在小麦生育期中适合取材的时间很短，且很难保证其生育期的一致性，另外，材料的播种亦受季节的限制。为了找到既适合于培养又易获得的外植体，人们进行了大量研究，发现小麦成熟胚可以有效克服幼胚与幼穗的上述不足。 1.2成熟胚