荧光分光光度计及其应用_李淑玲
荧光分光光度计及其应用
李淑玲
地矿部岩矿测试技术研究所 北京 100037
摘要 评述了近年来荧光分光光度计的发展,介绍了国内荧光分光光度计的研制及生产情况,综述了荧光分析技术的应用。
关键词 荧光分光光度计 发展 应用 综述
近年来,我国在荧光分光光度分析技术领域的研究取得了许多新的进展。如荧光总发光光谱技术、荧光探针、光纤荧光传感器、激光诱导时间分辨发光技术、荧光薄层扫描技术、动力学荧光法等。因此,对荧光分光光度计的要求不断提高。目前国内生产荧光分光光度计的厂家较少,国外厂商提供的都是中高档的荧光分光光度计。研制和生产性能可靠的国产荧光分光光度计具有重要意义。
1 基本原理
当激发光照射某些物质时,处在基态的分子吸收激发光后跃迁为激发态,这些激发态分子在因转动、振动等损失一部分激发能量后,以无辐射跃迁下降到低振动能级,再从低振动能级下降到基态,在此过程中激发态分子将以光的形式释放出它们所吸收的能量,这种光称之为荧光,所得到的光谱称为荧光光谱。荧光光谱能够反映荧光物质的特性。荧光分光光度计是基于物质的这种性质而对其进行定性及定量分析的一种分析仪器。
荧光定量分析的数学处理比分子吸收光谱复杂。一般来讲,荧光强度I f等于分子所吸收辐射的光强度I a与量子效率的积[1],即I f= f·I a= f I0(1-10-εbc)。如果荧光物质的浓度足够低,则I f=2.3f I0εbc=kc。这就是荧光定量分析的理论公式,式中ε、b、c分别是摩尔吸光系数、液池厚度及被测物质的浓度。
2 荧光分光光度计的基本结构
荧光辐射是从样品发生的,其在所有方向发射都相同,原则上可以从任何角度进行观测。但从仪器设计和应用的观点来看,90°角度是最方便且是目前使用较为广泛的方式。
荧光分光光度计的基本结构是:
光源※单色器或滤光片※样品池※单色器或滤光片※检测器。
目前荧光分光光度计的常用光源为氙灯,单色器多用光栅,检测器主要用光电倍增管,普通荧光分光光度计的激发和发射波长一般在200～900nm。
3 荧光分光光度计的分类
3.1 滤光片式荧光计
3.1.1 单光束滤光片荧光计
单光束滤光片荧光计的工作原理是第1滤光片允许紫外线(激发光)通过,第2滤光
李淑玲 女,副研究员,近年从事激光喇曼光谱分析技术应用研究。中国分析测试协会九五分析仪器发展调查项目资助。
片可以透射荧光辐射,但它吸收了任何能向光电池散射的光,对于这类仪器来讲,光电管及灯的稳定性要求比较高,否则会引起较大测量误差。
3.1.2 双光束滤光片荧光计
贝克曼比例荧光计属于此种类型仪器,它是采用一种特殊设计的汞蒸气灯,具有斩光器作用,使样品和标准各接收60Hz的相同辐射脉冲并为短的暗间隔所分开,从而保持一个恒定的参比水平。这类仪器消除了由于线路电压波动所引起的变化,具有较高的稳定性。
3.2 荧光分光光度计
3.2.1 单光束荧光分光光度计
在荧光光谱定量分析中,滤光片式荧光计由于有较高的辐射照到样品上而具有较高的灵敏度,但因它易引起光谱干扰而逐渐被荧光分光光度计所取代。
最早,单光束荧光分光光度计作为紫外可见分光光度计的一个附件仪器,从光源到探测器只有一束测量光。在测量时,参比和样品交替进行,因而较易引起测量误差。3.2.2 双单色器单光束荧光分光光度计
这类荧光分光光度计是90°角照射样品,结合两个光栅单色器的单光束仪器。它是由氙灯发出激发光,经过激发单色器分出的单色光照射到样品上,然后使发射单色器接收荧光到检测器。
3.2.3 双单色器双光束荧光分光光度计
这类仪器将从光源来的辐射在穿过第一个单色器照射到液池之前分成两路,这可用斩波器或光束分离器来完成。分光后一部分辐射通过液池及第二个单色器照在检测器上,而另一束辐射从液池及第二单色器的侧旁经过照在检测器上。如果以斩波器来分光,则可使用一个单独检测器轮流测定来自两光束的辐射;如果使用光束分离器,则需要第二个检测器来测量参比光束的强度。在这两种情况下,荧光光谱都由测得的来自样品的发射强度与作为波长函数的参比光束强度的比值组成。PE公司LS_5型及日立公司FRS_100型荧光分光光度计分别属于上述两种情况。
还有一类双光束荧光分光光度计是将从光源辐射的光分为两束,一束通过液池而另一束用作参比。第二束往往要通过一个参比溶液或在测定前作强度衰减,在许多仪器中采用了零点测定法,即利用衰减器将参比光束在检测器上的响应值调节到与样品的发射在检测器上的响应值相同,然后读得衰减器上此时所调定的值,可利用同一检测器交替测量这两光束,或以不同的检测器同时测定。
第三类双光束荧光分光光度计是以美国Turner公司生产的210型荧光分光光度计为代表。它具有激发光光源和参比灯的两道光束,交替地照射于测量辐射器上,参比灯在固定波长的强度是可变的,由光平衡系统调节参比灯的能量使其与激发光的能量相同,从参比灯发出的另外一束光通过衰减器到达光电倍增管检测器。衰减器是由一个与发射单色器联结的传动轮所驱动,这使得光电倍增管的光谱感应与发射单色器的光谱特性的组合得到补偿,因此交替照射于光电倍增管上的是一束经过校正的能量恒定的光束和一束由试样发射的荧光,在整个扫描的波长范围内记录两道光束在每一波长的比率所得到的曲线就是绝对荧光光谱。
3.2.4 激发和发射均为双单色器的荧光仪
Spex公司的Fluorolog_2系列仪器的激发和发射均为双单色器,这种仪器减少了杂散光的干扰,对于生物样品等光散射比较强的样品测定十分有利。这类仪器灵敏度非常高,稳定性十分好。
4 荧光分光光度计的发展
由于荧光分光光度计灵敏度高、特异性
强,因此应用范围较为广泛。但由于它对样品有一定要求,所以目前还不属于实验室的常规仪器,一般用于科研工作,目前使用的荧光分光光度计以国外中高档仪器为主。
4.1 国外荧光分光光度计
目前进入中国市场的外国厂商主要有日立公司、岛津公司以及美国的PE公司等。这些公司的仪器性能指标如表1所示。
表1 国外最新荧光分光光度计性能指标比较
参数项日立F_4500PE LS_50B
岛津RF_5301PC
光源150W氙灯8.3W/50Hz氙灯
8.9W/60Hz氙灯
150W氙灯
扫描范围λex、λem
200～900nm
λe x
200～800nm
λem
200～900nm
λex、λem
220～900nm
分辨率1.0nm2.5nm1.5nm
波长精度±2nm±1.0nm±1.5nm
最少取样量0.6m L2mL2m L
从表1可以看到使用脉冲作为光源是PE公司LS_50B的特点,该光源的使用可降低氙灯的功率,节约能源,延长使用寿命。而波长扫描速度的改观在日立公司仪器中具有明显的优势。另外日立公司推出的F_4500型荧光分光光度计采用水平光束测量,样品量只需0.6mL,这对痕量分析大有益处。虽然荧光分光光度计近年来在光学系统和检测系统方面没有明显改观,但是随着计算机软件的飞速发展,荧光分光光度计的应用软件系统不断完善,各大公司均提供了许多用户欢迎的应用软件,使仪器的操作及数据处理自动化程度提高。
4.2 国内荧光分光光度计的应用与研制
70年代末期以来,国内高等院校及科研单位逐渐引进了中高档荧光分光光度计。笔者统计了1996年《分析化学》杂志刊载荧光分析方面的文章表明,国外仪器使用率高达85%以上。常用的仪器型号为日立540、日立RF_3010、岛津RF_5000,日立及岛津公司的荧光分光光度计在国内市场中占有绝对优势。
中国科学院系统研究单位在70年代引进国外荧光仪器3台,80年代引进13台, 1990～1995年引进6台。由此情况可见国内引进仪器形势。国外高档仪器的引进,对我国荧光分析技术的发展起到明显的推动作用。
国内荧光分光光度计的研制起步较晚,多为自行装配,而商品化的仪器不多,已形成商品化的仪器有:天津光学仪器厂生产的WFD系列产品,厦门分析仪器厂生产的GFY系列以及与厦门大学合作研制的YF 型系列产品。另外上海第三分析仪器厂先后生产几种型号荧光分光光度计,如970MC型荧光分光光度计,目前国内厦门大学化学系对荧光仪的研制和开发做了大量工作;国内有一些单位研究激光荧光光谱仪,如核工业部化工冶金研究所研制的时间分辨激光荧光光谱仪,灵敏度比普通荧光光度计高十几倍;中国科学院安徽光学精密机械研究所研制的时间分辨荧光生化(免疫)分析仪,采用镧系元素标液生化分析,其灵敏度、特异性、稳定性均可与同位素标液方法相媲美。南开大学开发一种便携式荧光光谱仪采用光纤采样输入,CCD阵列接收,笔记本微机数据处理技术,特别适合于在线和野外工作。光纤荧光传感器的应用给荧光分析仪器注入活力,而电荷转移检测器的引入大大改善了荧光分析仪器的性能。
5 荧光分光光度计的应用
5.1 无机分析
荧光分析法由于灵敏度高、动态线性范围宽等优点,在一些领域中应用广泛。在无
机元素分析中,主要是通过待测元素与有机试剂(或荧光试剂)生成配合物或发生荧光猝灭效应来测定元素的含量。目前可以通过荧光分析测定70多种金属离子和阴离子,如Ag、Al、As、Au、Be、Bi、Ca、Cu、Ge、Ga、Hf、Hg、In、Ir、Li、Mg、M n、Nb、Ni、Os、Pb、Pt、Ru、Sb、Sc、Si、Sn、Sr、Ta、Tl、Th、Ti、V、Y、W、Zn、Ce、Dy、Eu、Gd、La、Lu、Sm、Cd、Cr (Ⅵ)、Se、Te、Re等。
增效试剂在无机物荧光分析中的应用仍是一个十分活跃的研究领域。稀土元素的荧光体系、催化动力学荧光分析、新荧光试剂及荧光探针试剂的合成均是目前研究的热点,而将分离手段与荧光光度法相结合,将有效地提高分析方法的适应性,如氢化物与荧光法、色层法与荧光法相结合,这将是微量技术与痕量分析相结合提高分析方法的灵敏度、改善选择性和拓宽荧光分析法应用领域的最佳途径。
5.2 有机物分析
近年来有机物荧光分析研究在我国发展迅速,年文献量不断增加。主要应用领域有中西药和临床、食品营养和添加剂等试样。激光诱导荧光法诊断恶性肿瘤,显微荧光法研究药物与细胞的相互作用,DNA编序及含量的荧光法测定均是目前受到关注的热点问题。
5.3 荧光分析技术研究
近年来,荧光分析技术在我国有了长足的发展。激光诱导和时间分辨荧光法在提高分析灵敏度和改善选择性方面具有独到之处;三维荧光光谱可以同时利用不同发光物质间荧光波长和荧光寿命的差别,增加分析方法的信息量。林竹光等将AppleⅡ微机与日立659_103荧光光度计联接,设计了一套多功能软件,除了可以得到常规荧光光谱、导数荧光光谱以外,还可以得到三维荧光光谱及等高图。还有人把阿达玛变换多通道成像技术与荧光显微镜结合起来,可以得到阿达玛变换三维荧光图象。这些荧光技术的研究,将对我国荧光分光光度计的研制和开发起引导作用。
从表2统计的369篇有关荧光分析应用文献[2]可见,我国在荧光分析领域中目前仍以无机分析为主,而荧光分析技术的研究也占有相当高的比例,这说明我国分析工作者对荧光分光光度计的开发、改造以及研制极为关注,这将大大推动我国荧光分光光度计的发展。
表2 荧光分析技术与应用领域论文统计
项 目无机分析有机分析荧光分析技术
文章篇数16238169
占比例(%)441046
6 荧光分光光度计与其它仪器联用
荧光分析法因具有灵敏度高,线性动态范围宽等优点,愈来愈引起人们的重视,尤其是近年来激光、计算机、电子学等新技术的飞速发展,加速了荧光分光光度计与其它技术的结合而形成多种多样的新型荧光分析仪。
荧光分光光度计的联用技术与紫外可见分光光度计的联用技术有许多相似之处。首先它可以作为一种仪器的检测器,其次可以作为一个独立的主体与其它附件相连接,形成一种新的测试系统,最后它还可以与其它分析技术相结合构成一种新型的分析仪器。
6.1 荧光检测与HPLC联用
液相色谱检测器种类很多,灵敏度较高、选择性较好的荧光检测器在进行微量分析中经常使用。如许多芳香族化合物如蒽、菲、芴等在特定条件下发出特征荧光,利用HPLC
王怀公.荧光分析的研究与应用现状.中国化学会第二届发光分析学术会议论文集(上册).厦门:1988.A04.
的荧光检测器可以同时测定上述物质。Tanabe等[3]设计一种供HPLC用的多波长荧光检测系统,有4个干涉滤光片和光电倍增管通道;Gluckm an等[4]研制的荧光检测器,流通池为150μL,可用于毛细管HPLC 和超临界色谱,其最小检测量为0.2pg。
6.2 荧光检测与离子色谱联用
M ho等人[5]研制一套供离子色谱用的双光束激光激发间接荧光检测器,它用具有荧光的淋洗离子维持恒定背景信号,当待测离子淋出时,信息观测信号减少。这种荧光检测器可以检测纳克级阴离子,方法灵敏度非常高。
6.3 光导纤维与荧光分光光度计的联用
光导纤维目前已被广泛应用于许多领域,章竹君等人已成功地将光导纤维制成荧光光纤化学传感器。有些厂家已有商品仪器形成,如江苏分析仪器厂生产的8510型多功能光纤光度计。这类仪器由荧光分光光度计引入两支光纤导管,一支光纤则将荧光信号传输到荧光分光光度计中进行测量,从而形成了一种高灵敏度、遥测痕量分析技术。光纤便携式荧光光谱仪的制成,特别适合在线和野外工作。光纤多频率相调制荧光计以及液芯光纤荧光计是目前开发的新型光纤荧光仪。
6.4 激光光源引入荧光分光光度计
激光光源引入荧光计在我国开发较早,也是目前应用比较成熟的仪器之一,如测铀仪就是其中的代表[6]。时间分辨激光荧光分光光度计的研制成功,大大改善了荧光仪器的性能,这类仪器已广泛应用于环境监测、稀土分析、冶金、化工以及生化等领域, LMA_1型激光微量物质分析仪是我国首次研制成功的时间分辨激光荧光仪,并已形成商品仪器。
6.5 显微荧光分光光度计
显微荧光分光光度计既有荧光分光系统,又有显微放大系统,其最大特点是能进行微区分析,可以得到许多微观参数,且不破坏样品,如检测有机包裹体中的荧光物质等。另外还有人[7]曾研制过由光学显微镜、全息光栅光谱仪和多道检测器组成的激光显微荧光光度计,它可快速测定直径1μm样品的荧光光谱,这有利于生物组织样品的荧光光谱研究。
6.6 荧光光度计与分子吸收技术相结合
厦门大学赵一兵等人[8]研制一种测定非荧光吸光物质的荧光分光光度计。他们在激发光路中放置吸光物质(待测物质),在液池放置标准荧光物质,扫描荧光光谱。从理论推导可得公式ΔF=F0εbc,待测物质浓度c与标准荧光物质的荧光强度衰减ΔF呈正比,经实际体系测定证实了此结论的正确性。
7 国内荧光分光光度计的开发和需求
目前,我国荧光分光光度计的用户多为科研单位和大专院校,且主要是使用进口的中高档产品。我国自行生产的荧光分光光度计在产品质量上和进口仪器相比仍有较大差距,主要表现在仪器的稳定性和可靠性,包括光学机械加工、制造工艺和电子系统的可靠性。但是研制专用小型荧光分光光度计和实现某些零部件国产优质化是我国研制荧光仪器的特点,如激光和光纤在荧光分光光度计的成熟应用;荧光分光光度计应用软件的开发和利用等均具有较大优势。在我国目前基础工业状况下应提倡工厂与研究单位及大专院校合作,研制和开发具有中国特色的荧光分光光度计势在必行。虽然我国目前荧光分光光度计的年需求量不算太大,但也有一定市场。生产质量可靠的优质荧光分光光度计是广大分析工作者的迫切愿望。
8 参考文献
1 陈国珍主编.荧光分析法.北京:科学出版社,
1975.44.
2 刘长松,魏雁生,晋卫军.发光分析.分析试验室.1995,14(4):86.
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6 董灵英.时间分辨激光荧光光谱分析.岩矿测试.1992,11(1_2):58.
7 许金钩.荧光分析法近年来的某些进展.岩矿测试.1992,11(1_2):52.
8 赵一兵.非荧光吸光物质的荧光法研究.云南大学学报.1994,16(增刊):12.
〈收稿日期:1997_03_08〉
Fluorospectrophotometer and Its Application
Li Shuling
(Institute of Rock and M ineral A naly sis,Ministry of Geology and Mineral Resources,Beijing,100037)
Recent development of fluorospectrophotometer is review ed in this paper.The w ork in re-search and manufacture of new domestic products are introduced.The applications of the tech-nique in recent years are also review ed.
Key words: fluorospectropho tometer,development,application,review
LS55操作说明书荧光-磷光-发光分光光度计中文培训手册
ＬＳ－４５／５５荧光／磷光／发光 分光光度计 使用说明书 美国Perkin Elmer公司 ２００３ 年４月
一、理论基础 荧光、磷光、化学发光及生物发光均属于分子发光。现将其原理简介如下： 室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象被称为“发光”。 每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转动能层。图中基态用Ｓ０表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重态分别用Ｓ１、Ｓ２表示，０、１、２、３…表示基态和激发态的振动能层（见图１），第一、二电子的激发三重态分别用Ｔ１和Ｔ２表示（见图２）。 图１荧光的能级图 １、荧光的产生 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活化过程的一种形式是以１０－９～１０－６秒左右的短时间内发射一个光子返回基态，这一过程称为荧光发射（见图１）。２、磷光的产生 从单重态回到三重态的分子系间跨越越迁发生后，接着发生快速的振动驰豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在１０－４～１０２秒左右的时间内跃迁回基态而发生磷光（见图２）。 由此可见，荧光与磷光的的根本区别是：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层的跃迁产生的，而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。
图２磷光的能级图 ３、化学发光及生物发光的产生 某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出了一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。化学发光也发生于生命体系，这种发光被称为生物发光。 二、仪器简介 １、仪器原理 图３ＬＳ４５／５５荧光／磷光／发光分光光度计的原理图
荧光分光光度计
荧光分光光度计 荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190~650nm，发射波长扫描范围是200~800nm。可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。 荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便、工作曲线线形范围宽等优点，可以广泛应用于生命科学、医学、药学和药理学、有机和无机化学等领域。 基本结构与原理 由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 基本结构和原理如图所示，光源与检测器成直角方式安排。 荧光分光光度计的工作原理： 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光 的形式放出，从而产生荧光． 不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。 荧光分光光度计基本结构和原理图 1. 光源： 为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。 2．激发单色器： 置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
荧光分光光度计- 原理概要
分子荧光分析法 发光光谱：物质分子或原子吸收辐射被激发后，电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光、磷光。 根据物质接受的辐射能量的大小及与辐射作用的质点不同，荧光分析法可分为以下几种： 1. X射线荧光分析法 用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X 射线范围内的荧光。 2. 原子荧光分析法： 待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。 荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。 荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。 3. 分子荧光分析法： 有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。
基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂， 称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1 其多重性：M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。（二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能
荧光分光光度计
荧光分光光度计 1、功能：荧光、磷光和生物/化学发光的测定都是标准功能，波长扫描，时间扫描，三维时间扫描，定量分析，磷光寿命测定,三波长测定，可扩展功能低温荧光测定，绝对量子产率测定。 *2、波长移动速度: 60,000nm/min 3、预扫描功能,优化未知样品的测量条件。 4、具有内置的切光器功能,可使样品在激发光束下的暴露时间缩短,从而保护容易发生光反应的样品 *5、灵敏度：800：1水的拉曼峰（RMS）；250：1（P-P）；（测试条件：水的拉曼峰，激发波长350nm，光谱带宽5nm，响应时间2s）；基线处最低信噪比优于15000:1（RMS)(激发波长350nm，光谱带宽10nm，响应时间4s) 6、狭缝方式:水平狭缝,最小样品量:0.6毫升(使用标准10mm方形样品池) 7、光度模式:单色光监控比率计算 *8、单色器:机刻凹面衍射光栅:900条/mm,；激发侧闪耀波长:300nm；发射侧闪耀波长:400nm 9、测量波长范围(EX和EM):200~750nm,零级光,配置备选检测器R928F扩展至200-900nm. *10、光谱带宽:激发侧和发射侧:1，2.5，5，10，20nm 11、分辨率:1.0nm 12、波长准确性:1nm *13、波长扫描速度:不低于60,000nm/min，2s内扫描可得到一张典型的全范围光谱;2min内扫描得到一张典型的三维光谱图; *14、响应时间:从0到98%;0.002，0.004，0.01，0.05，0.1，0.5，2，4s 15、光度计的显示范围:-9999~9999 *16、全波段的光谱校正，排除仪器的依赖性，确保高精度的数据 *17、动态范围宽：六个数量级 *18可选配77K低温附件，用于液氮温度下荧光、磷光测量，可选配细胞内离子测定附件进行钙镁等离子的测量。（提供彩页图片和货号证明） *19、可选配积分球附件进行绝对量子产率测定。（提供彩页图片和货号证明）20、工作温度/湿度: 15~35℃,45~8O%(不可有冷凝现象,35℃以上时湿度为70%以下 21、电源: 220, 230, 240Ⅴ AC 50/60Hz *22、配备温控支架及冷却循环水一套。 二、配置 1. 主机1台(含原装荧光比色皿1只和软件1套） 配套固体样品支架1套 2.电脑打印机1套 3.温控支架1套 冷却循环水1套
高等仪器分析实验荧光分光光度计的使用
高等仪器分析实验(荧光分光光度计的使用) 实验目的 1． 2．掌握荧光分光光度计的基本使用方法：扫描激发光谱，发射光谱，荧光强度，同步荧光光谱 3． 4．掌握荧光定量分析方法 实验原理 荧光分光光度计是常用的光学仪器，在定量分析，样品的光谱性质表征时经常用到。 荧光分光光度计的基本功能是完成激发光谱，发射光谱的扫描，进行相对荧光强度的测量。从激发光谱可以获得样品激发态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳激发波长。从发射光谱可以知道样品基态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳发射波长。荧光定量分析法的方法与紫外可见吸收光谱法类似，但需要注意荧光强度值是相对值，同一样品，同一仪器在不同仪器参数时获得的荧光强度是不同的。只有当测量时仪器参数完全相同时，不同样品荧光强度的相互比较才有意义。 与紫外可见吸收光谱类似，分子荧光光谱也是分子光谱，其谱峰较宽，特征性不是很强，谱峰重叠现象比较普遍。为了减小谱峰宽度，避免谱峰重叠，提高分析的选择性，在定量分析时常采用同步荧光的方法进行。同步荧光是同时扫描荧光分光光度计的激发和发射单色仪得到的谱图，通过选择合适的扫描参数，可以使样品谱峰变窄，并避免不同组份的谱峰重叠，得到比较好的分析效果。 同步荧光扫描有固定波长同步荧光法，固定能量同步荧光法，可变角同步荧光法，导数同步荧光法等，其中以固定波长同步荧光法最为常用。 扫描已知样品荧光激发和发射光谱时，可先根据参考波长来进行。扫描未知样品的荧光光谱，可以将发射波长先每隔一定波长（例如50nm）扫描一个激发光谱。对比不同位置的激发光谱，从最强的激发光谱中选择最大激发波长，设定该波长为激发波长，扫描发射光谱。再从新得到的发射光谱中找到最大发射波长，在最大发射波长处重新扫描激发光谱。 扫描样品激发光谱和发射光谱时，需要注意：扫描激发光谱时，激发单色器扫描范围的长波端一般应小于发射波长；扫描发射光谱时，发射单色器扫描范围的短波端应大于激发波长。否则在发射光谱（激发光谱）中与激发波长（发射波长）波长相同的位置会出现很强的散射谱峰，这不是样品的荧光引起的，应注意区分。 如果样品不是真正的溶液，或包含有不溶颗粒物，或是固体样品，如果扫描范围较宽时，通常在发射光谱（激发光谱）中激发波长（发射波长）整数倍波长的位置也会出现弱的散射谱峰，称为倍频峰，在分析光谱情况时也应注意区分。对散射倍频峰或样品荧光峰，可通过适当改变激发波长来进行区分，散射倍频峰的位置会随着激发峰位置的变化而变化，而荧光峰位置通常是不变的。如果倍频峰对样品的测量有干扰，可使用合适的滤光片消除倍频峰。合适的消倍频峰滤光片应可以使发射光透过，而阻挡激发光不能透过。 如果样品荧光较弱，使用高灵敏度档测定时，通常会观察到溶剂的拉曼峰，也应注意与样品荧光进行区分。拉曼峰的位置也与激发波长有关，同时会随着激发波长的变化而变化。其位置估算方
F-27000荧光分光光度计使用操作步骤
F-2700荧光分光光度计操作规程 1、开机： （1）开启计算机 （2）开启仪器主机电源按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP 和RUN指示灯依次亮起来，都显示绿色为正常。 （3）双击桌面图标（FL Solutions 4.1 for F-7000），主机自行初始化，扫描界面自动进入 （4）初始化结束后，须预热15-20分钟，出现操作主界面（界面右下角出现Ready） 2、点击扫描界面右侧“Method” 在“General”选项中的“Measurement”选择“wavelength scan”测量模式 在“Instrument”选项中设置仪器参数和扫描参数 选择扫描模式“Scan Mode”：Emission/Excitation（发射光谱/激发光谱） 选择数据模式“Data Mode”：Fluorescence (荧光测量) 设定波长扫描范围 扫描荧光激发光谱(Excitation)：需设定激发光的起始/终止波长（EX Start/End WL）和荧光发射波长（EM WL） 扫描荧光发射光谱(Emission)：需设定发射光的起始/终止波长（EM Start/End WL）和荧光激发波长（EX WL） 其他选项可选择默认值（也可根据具体实验要求自行设定） 参数设置好后，点击“确定” 3、设置文件存储路径（此步也可不进行参数设置，可以在按5中方法进行保存） （1）点击扫描界面右侧“Sample” （2）样品名可自行命名 （3）选中“Auto File”，可以自动保存原始文件和TXT格式文本文档数据（4）参数设置好后，点击“OK” 4、扫描测试 （1）打开盖子，放入待测样品后，盖上盖子（请勿用力） （2）点击扫描界面右侧“Measure”，窗口在线出现扫描谱图 5、数据处理与保存 （1）选中自动弹出的数据窗口 （2）右键--“Trace”，进行读数并寻峰等操作 （3）“File”--“Save as”对数据进行保存 6、关机顺序： （1）关闭运行软件FL Solution 2.1 for F-7000 （2）选中“Close the lamp，then close the monitor windows？”点击“Yes”窗口自动关闭同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP指示灯暗下来，而RUN指示灯仍显示绿色 （4）约十分钟后，关闭仪器主机电源，即按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）（目的是仅让风扇工作，使Xe灯室散热） （5）从样品池中取出所有比色皿，清洗干净以便下一次使用 （6）关闭计算机
紫外分光光度计及荧光积分球
前言： 在分光光度计中，一个是作为检测器用的光电倍增管，另一个是作为附件用的积分球，两者看似没有直接的联系，实际上，积分球的问世和使用正是弥补了光电倍增管在检测多样化样品时的自身缺陷。 而对于积分球检测器这种附件，许多仪器使用者了解甚少，甚至没有听说过。为此，本文针对这两者的关系做一简单介绍，以飨读者。 1．光电倍增管的使用： 光电倍增管英文名称是photomultiplier tube，简称PTM。在目前的一些双光束分光光度计中经常使用光电倍增管作为检测器。由于光电倍增管具有灵敏度高，噪声低及响应速度快的特点，所以被广泛地应用在许多光学仪器中作为检测器，这是众所周知的常识。 2．光电倍增管的结构： 光电倍增管有侧窗式和端窗式两种，在实际应用范围里又以侧窗式居多，因此、本文以R 928型侧窗式光电倍增管为例加以介绍。 R928型光电倍增管有11个电极，分别为：1个光阴极（Ｋ），9个倍增极，也称打拿极（D Y）和1个阳极（P）；外观图和内部图如图－1，图－2所示：
图－1、R928型光电倍增管外观图
图－2、R928型光电倍增管内部结构顶视图 3．光电倍增管的简单工作原理： 当入射的检测光信号（S/R）照射到光阴极（K）后，光阴极向真空中激发出光电子。这些光电子首先进入倍增系统的第一个打拿极DY1，然后通过进一步的二次电子发射，逐级通过其余的8个打拿极（DY2～DY9）而得到递增式的倍增放大；最后这些被多次放大后的电子被阳极（P）收集作为信号输出。图－3是R928电极排列及供电电路示意图：
图－3、R928电极排列及供电电路示意图 4．光电倍增管灵敏度特性的分析： 虽然光电倍增管有许多优点，但暇不掩玉，该器件自身也有两个致命的缺陷； ①灵敏度因强光照射（这也就是为何仪器在通电的情况下样品室盖子不能打开的原因）或因照射时间过长而降低，停止照射后又部分地恢复；鉴于光电倍增管的这种特性致使它随着使用时间的累加，灵敏度会逐渐下降（一般从长波长开始下降，俗称“红外紫移”）且噪声输出却逐渐加大，直至被弃用。我们把这种现象称为“疲乏效应”。 ②光阴极表面各点的灵敏度不是均匀的，而是根据入射光束的输出变动而定。 对于第一个缺陷由于有个时间的累积过程，故负面效应在短时间内不是很凸显；但是对于第二个缺陷，却直接影响着不同样品的在线分析结果。于是就引出了一个关于光电倍增管灵敏度特性这样一个概念的分析。 侧窗型光电倍增管由于光电面（光窗）的弧形结构及电极的几何形状等原因，致使光阴极表面各个位置上的灵敏度是不均匀的，但是造成这种不均匀的原因不是光阴极表面本身，而是入射光束（或光斑）作用在光阴极光电面上不同的位置（locality）所致。形象地说，就是入射光束照射在光阴极表面上不同的位置会直接影响着阳极灵敏度的高低（即阳极输出电流的大小），这种特性关系见图－4所示： 图－4、光电倍增管的灵敏度特性 我们从上面示意图可以看到，入射光束作用在光电倍增管光电面上的位置不同会改变其输出的灵敏度；水平位置对灵敏度的影响最为明显，垂直位置其次。如果入射光束照射在光电面的水平方向的边缘时，甚至使检测器失去了放大功能，这也就是为何仪器在更换光电倍增管后需要仔细地调整管子与入射光束的垂直角度和高低的原因。如果有机会你会发现，许多仪器上的光电倍增管的光电面（光窗）不是与入射光束形成垂直0°度角，而是有个小小的偏差角度，其原因就是为了寻找检测器最佳灵敏度位置的结果。 5．不同测试样品对灵敏度的影响：
荧光分光光度计
基本原理 由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光． 不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫 外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。 基本结构 1. 光源： 为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。 2．激发单色器： 置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。3．发射单色器： 置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。筛选出特定的发射光谱。 4．样品室： 通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。 5．检测器： 一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大并转为电信号
荧光分光光度计 科技名词定义 中文名称：荧光分光光度计 英文名称：spectrofluorophotometer;fluorescence spectrophotometer;spectrofluorometer;spectroflurimeter 定义1：利用某些物质受激发出的荧光，其光强度与该物质的含量成一定函数关系的性质而制成的分光光度计。 应用学科：机械工程（一级学科）；光学仪器（二级学科）；物理光学仪器（三级学科） 定义2：分析物质荧光特性的仪器。具有两套单色光器，对物质荧光进行定性分析时，固定入射的激发光波长可获得发射光光谱，而固定所测发射光波长时就可扫描得激发光谱，从中可以得到最大的发射光波长和最大的激发光波长。固定激发光波长和强度测量发射光强度，可作定量分析。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义3：在荧光波长范围内,对溶液中物质进行浓度测定的仪器。 应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）
高等仪器分析实验-荧光分光光度计的使用
高等仪器分析实验（荧光分光光度计的使用） 实验目的 1．掌握荧光分光光度计的基本使用方法：扫描激发光谱，发射光谱，荧光强度，同步 荧光光谱 2．掌握荧光定量分析方法 实验原理 荧光分光光度计是常用的光学仪器，在定量分析，样品的光谱性质表征时经常用到。 荧光分光光度计的基本功能是完成激发光谱，发射光谱的扫描，进行相对荧光强度的 测量。从激发光谱可以获得样品激发态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳激发波长。从发射光谱可以知道样品基态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳发射波长。 荧光定量分析法的方法与紫外可见吸收光谱法类似，但需要注意荧光强度值是相对值，同一样品，同一仪器在不同仪器参数时获得的荧光强度是不同的。只有当测量时仪器参数完全相同时，不同样品荧光强度的相互比较才有意义。 与紫外可见吸收光谱类似，分子荧光光谱也是分子光谱，其谱峰较宽，特征性不是很 强，谱峰重叠现象比较普遍。为了减小谱峰宽度，避免谱峰重叠，提高分析的选择性，在定量分析时常采用同步荧光的方法进行。同步荧光是同时扫描荧光分光光度计的激发和发射单色仪得到的谱图，通过选择合适的扫描参数，可以使样品谱峰变窄，并避免不同组份的谱峰重叠，得到比较好的分析效果。 同步荧光扫描有固定波长同步荧光法，固定能量同步荧光法，可变角同步荧光法，导 数同步荧光法等，其中以固定波长同步荧光法最为常用。 扫描已知样品荧光激发和发射光谱时，可先根据参考波长来进行。扫描未知样品的荧 光光谱，可以将发射波长先每隔一定波长（例如50nm）扫描一个激发光谱。对比不同位
置的激发光谱，从最强的激发光谱中选择最大激发波长，设定该波长为激发波长，扫描发射光谱。再从新得到的发射光谱中找到最大发射波长，在最大发射波长处重新扫描激发光谱。 扫描样品激发光谱和发射光谱时，需要注意：扫描激发光谱时，激发单色器扫描范围的长波端一般应小于发射波长；扫描发射光谱时，发射单色器扫描范围的短波端应大于激发波长。否则在发射光谱（激发光谱）中与激发波长（发射波长）波长相同的位置会出现很强的散射谱峰，这不是样品的荧光引起的，应注意区分。 如果样品不是真正的溶液，或包含有不溶颗粒物，或是固体样品，如果扫描范围较宽时，通常在发射光谱（激发光谱）中激发波长（发射波长）整数倍波长的位置也会出现弱的散射谱峰，称为倍频峰，在分析光谱情况时也应注意区分。对散射倍频峰或样品荧光峰，可通过适当改变激发波长来进行区分，散射倍频峰的位置会随着激发峰位置的变化而变化，而荧光峰位置通常是不变的。如果倍频峰对样品的测量有干扰，可使用合适的滤光片消除倍频峰。合适的消倍频峰滤光片应可以使发射光透过，而阻挡激发光不能透过。 如果样品荧光较弱，使用高灵敏度档测定时，通常会观察到溶剂的拉曼峰，也应注意与样品荧光进行区分。拉曼峰的位置也与激发波长有关，同时会随着激发波长的变化而变化。其位置估算方 法：?laman=1/（1/? ex-?H2O /10 7）,其中波长单位为nm，?H2O 为溶剂的红外吸收波长，单位为波数，溶剂为水时，主要的红外吸收是O-H 伸缩振动，波长在3300波数。 狭缝的选择：激发和发射狭缝通常并不要求严格一致，为获得较好的灵敏度和准确反 应谱峰形状，测定激发光谱时，选用较大的发射狭缝和较小的激发狭缝是比较好的。而测 定发射光谱时则恰好相反。 灵敏度档的选择：灵敏度档与仪器中光电倍增管的放大倍数有关，对荧光比较弱的样 品，应选择灵敏度较高的档位，反之亦反。但注意不同档位之间的荧光强度值没有确定的 换算关系，不能相互比较。进行定量分析时，所有样品必须在同样的狭缝和灵敏度档位测 量。 仪器及试剂 970MC荧光分光光度计 缓冲溶液：10-2mol/L Na 2HPO4-NaOH 缓冲溶液，pH=11-12
LS-50荧光分光光度计操作手册
ＬＳ－４５／５５荧光／磷光／发光 分光光度计 使用说明书 美国Perkin Elmer公司 王国强黄建权编译 ２００２年４月
一、理论基础 荧光、磷光、化学发光及生物发光均属于分子发光。现将其原理简介如下： 室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象被称为“发光”。 每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转动能层。图中基态用Ｓ ０ 表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重 态分别用Ｓ １、Ｓ ２ 表示，０、１、２、３…表示基态和激发态的振动能层（见图１），第一、 二电子的激发三重态分别用Ｔ １和Ｔ ２ 表示（见图２）。 图１荧光的能级图 １、荧光的产生 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活化过程的一种形式是以１０－９～１０－６秒左右的短时间内发射一个光子返回基态，这一过程称为荧光发射（见图１）。２、磷光的产生 从单重态回到三重态的分子系间跨越越迁发生后，接着发生快速的振动驰豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在１０－４～１０２秒左右的时间内跃迁回基态而发生磷光（见图２）。 由此可见，荧光与磷光的的根本区别是：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层的跃迁产生的，而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。
图２磷光的能级图 ３、化学发光及生物发光的产生 某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出了一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。化学发光也发生于生命体系，这种发光被称为生物发光。 二、仪器简介 １、仪器原理 图３ＬＳ４５／５５荧光／磷光／发光分光光度计的原理图
荧光分光光度计使用
工作原理 荧光产生的原理 荧光的定义：某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的光。 荧光产生的原理：化学物质能从外界吸收并储存能量(如光能、化学能等)而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射(即发光)。 荧光化合物的两种特征光谱 1. 荧光激发光谱，就是通过测量荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱，它反映了不同波长激发光引起荧光的相对效率。 2. 荧光发射光谱，如使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所产生的荧光通过发射单色器后照射于检测器上，扫描发射单色器并检测各种波长下相应的荧光强度，然后通过记录仪记录荧光强度对发射波长的关系曲线，所得到的谱图称为荧光光谱。 物质的激发光谱和荧光发射光谱，可以用作该物质的定性分析。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用作定量分析。 荧光分析法的灵敏度一般较紫外分光光度法或比色法为高，浓度太大的溶液会有“自熄灭”作用，以及由于在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致发射光强度与浓度不成正比，故荧光分析法应在低浓度溶液中进行。 荧光发射的特点：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光;而一旦停止供能，发光(荧光)现象也随之在瞬间内消失。 溶液荧光光谱通常具有的特征： (1) 斯托克斯位移：在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光的波长总是大于激发光的波长。 (2) 荧光发射光谱的形状与激发波长无关。 (3) 荧光发射光谱的形成与吸收光谱的形状有镜像关系 荧光的猝灭：荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光(特别是紫外光)的直接照射和与其他化合物的接触。 荧光效率：荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。
荧光分光光度计操作规程
日本日立F-7000荧光分光光度计基本操作规程 1、开机顺序 （1）开启计算机。（按图中圆圈按钮） （2）开启仪器主机电源。按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）。（按下图中圆圈按钮） （3）观察主机正面面板右侧的Xe LAMP 和RUN指示灯依次亮起来，
都显示黄绿色。Xe LAMP灯先亮，RUN灯后亮。 2、打开运行软件。 （1）双击桌面图标（FL Solution 2.1 for F-7000）。主机自行初始化，扫描界面自动进入。 （2）初始化结束后，须预热15-20分钟(若要进行定量分析，须预热
30分钟以上，按界面提示选择操作方式。 3.点击右上角Method,进行方法设置。 若要预扫描，可选择3-D scan（如下图）.设置好方法后（见下图），再点击右上角Pre Scan（如上图），
在Instrument Monitor菜单(见下图)的Data mode中选择Fluorescence, 在EX Start WL中输入激发波长200，EX End WL中输入激发波长500,在EM Start WL中输入发射波长210(有利于保护检测器)，在EM End WL中输入700(nm)，为节约扫描时间，扫描速度Scan speed可设置为30000。点击update,可知扫描需要多少时间。EX slit和EM slit一般选择5.0（若荧光强度太弱，可提高该数值， 若强度太高，可降低该数值），PMT Voltage （电压）中可选择700
（若荧光强度太弱，可提高该数值，若强度太高，可降低该数值），PMT Voltage 0-1000v前面的方框打勾后，可在上面的PMT Voltage 中随意填写电压值。在Response 中选择Auto。 在Processing菜单中(见下图)的 Y Axis中的Max中填5000或
荧光分光光度计测试步骤
荧光分光光度计测试步骤 测试步骤： （一）样品准备 1.液体样品根据用户提供的技术指标，检查浓度范围是否合适，如果需要稀释，则要考虑所需溶剂类型和稀释倍数。 2?固体样品均匀粉末、片状或具有光滑平面的块状样品，均可直接测定。 （二）操作步骤 1.开机：接通电源，打开主机开关，点燃（打开）光源后，根据说明书要求启动计算机。 2.检测前准备：参照仪器说明书，在20天内至少进行一次激发校准和发射校准，检测前 仪器应预热。 3.工作条件的选择：环境温度应在20 C ±5C;相对湿度不大于70%;电源稳定，无磁场、 电场干扰。根据样品的特性及荧光强度，选择合适的仪器工作条件（如狭缝、PM增益、响应时间等）。 4.基本测定 （1）荧光激发光谱测定 设置仪器参数，扫描发射波长，找到max入em,以此为发射波长，记录发射强度作为激发波长的函数，便得到激发光谱。 （2）荧光发射光谱测定 设置仪器参数，扫描激发波长，找到max入ex,以此为激发波长，记录发射强度与发射波 长间的函数关系，便得到荧光发射光谱。 （3）差谱测定 设置仪器参数，选择合适的工作方式，测定背景溶液的发射光谱并储存起来，在一定的工作方式下，扫描样品溶液的发射波长，得到当时的光度值和储存的背景值之间的差示值，即差谱。
(4)峰面积积分 选择适当的工作方式，对样品溶液进行积分操作，即得到峰面积积分。 (5)荧光强度 选择合适的测量参数，设置入ex入em采用定点读数或扫描方式，即可测得所选波长处 的荧光强度。 (6)定量测定 配制一系列已知浓度的标准溶液，在一定的测定条件下，设置入ex入em按照由稀至浓的次序，测定标准溶液的荧光强度，绘制荧光强度一浓度的工作曲线，不改变仪器参数测定未知溶液的荧光强度，由工作曲线即可求出未知溶液的浓度。 (三)分析结果的表述 1.荧光激发光谱、发射光谱以及其他光谱由仪器控制电脑直接绘出。 2?峰面积积分、荧光强度由仪器控制电脑计算显示。 3.定量测试：在相同的测定条件下，测定一系列已知浓度的标准溶液的荧光强度，绘制出 荧光强度-浓度的工作曲线。浓度未知的溶液的荧光强度测定后，由工作曲线求出该溶液的浓度。 (四)注意事项 1.在实验开始前，应提前打开仪器预热，并配制好所需的溶液，对于已经配制好的溶液，在不用时放在4C冰箱中保存，放置时间超过一星期的溶液要重新配制。 2.实验所用的样品池是四面透光的石英池，拿取的时候用手指掐住池体的上角部，不能接触到四个面，清洗样品池后应用擦镜纸对其四个面进行轻轻擦拭。 3.在测试样品时，注意荧光强度范围的设定不要太高，以免测得的荧光强度超过仪器的测 定上限。 4.实验结束后，要及时的清理台面，处理废液，清洗和放置好样品池，将下次要用的溶液放回冰箱，并且按规定登记实验记录，养成良好的实验习惯。
荧光分光光度计的简单使用说明
荧光分光光度计 Fluorescence Spectrometer 国别厂家：日本岛津公司 仪器型号：RF-5301PC 基本原理： 主要技术指标： 灯源：150 W Xe灯 单色器：闪耀式全息光栅，F2.5刻线1300条/mm 波长范围：220 900 nm. 波长精度：±1.5 nm, 分辨率：1.0 nm 狭缝宽:1.5, 3, 5, 10, 15, 20 nm 灵敏度: S/N比150以上（带宽5 nm、水拉曼峰时） 测定方式：荧光光谱测定、定量测定、时间过程测定 软件功能：10通道显示,数据RSC转换, 谱图自动找峰,不同谱图加减乘除, 谱图倒数、导数、常用对数转换等。 主要功能: 固体和液体的激发光谱、发射光谱和同步荧光光谱；荧光物质的定量分析。
使用方法： 1.将荧光光度计的右侧Xe灯开关置于“ON”的位置, 再打开电源开关和电脑电源。 2.双击电脑上的RF-5301PC图标, 静等仪器自检完成,出现喀嚓声后, 显示RF-5301P窗 口。 3.预热：开机预热20分钟后才能进行测定工作。 4.新建文件夹：在Data文件夹里新建本次所做实验的子文件夹 5.启动RF-5301PC后在Acquire Mode中选择欲分析的项目。 6.设定参数：根据测量方式在Configure的Parameter里设定合适的参数。 7.置入样品：将已经装入样品的四面擦净后的石英荧光比色皿放入样品室内试样槽后, 将 盖子盖好。 8.扫描：参数设定完毕后, 点击窗口右下角的“Start”图标,开始扫描, 扫图结束后输入文 件名将文件储存。 9.保存：在“File”中的“Save Channel”对曲线进行保存。 10.转换文件：在“File”的“Data Translation”里单击要转换的“ASCⅡ”格式或者“DIF” 格式。 11.关机：测试完毕后，关闭电脑。之后要先关闭氙灯(Xe灯开关置于“Off”位置), 散热 20分钟后, 再关闭电源开关。 注意事项： 1.开机时，请确保先开氙灯电源，再开主机电源。每次开机后请先确认一下排热风扇工 作正常，以确保仪器正常工作，发现风扇有故障，应停机检查。 2.使用石英样品池时，应手持其棱角处，不能接触光面，用毕后，将其清洗干净。 3.当操作者错误操作或其它干扰引起微机错误时，可重新启动计算机，但无须关断氙灯电 源。 4.光学器件和仪器运行环境需保护清洁。切勿将比色皿放在仪器上。清洁仪器外表时，请 勿使用乙醇乙醚等有机溶剂，请勿在工作中清洁，不使用时请加防尘罩。 5.为延长氙灯的使用寿命, 实验完毕后要先关闭Xe灯, 不关电源主机电源(光度计的右 侧)，等其散热完毕后再关闭电源。
960CRT荧光分光光度计1
960CRT荧光分光光度计 产品简介-共同特点： 发射单色仪采用1200L/nm凹面光栅。大孔径非球面反射镜，灵敏度特别高，采用1500W 大功率汞灯，激发能量强，采用光源监控技术，测量结果稳定，高性能的光电倍增管，可获得最佳信号噪声比，具有自诊断功能，工作可靠，EM带宽小于10nm 960CRT型特点： 配置Windows95计算机工作站，仪器故障率小，可靠性强 工作站采用中文对话视窗，操作方便 利用鼠标可舒服地进行扫描测定；定量分析；运算；制表和记录等系列操作 可方便地选择联机或脱机工作方式 选配件： ●光源：150W氘灯 ●干涉滤光片（汞灯光源）：254nm、313nm、405nm、436nm、546nm ●干涉滤光片（氘灯光源）：250nm～700nm间任选 主要技术指标： 960MC/CRT型： ●EX波长选择范围：365nm（干涉滤光片） ●EM波长范围：200nm～800nm ●波长准确度：EM±2nm ●波长重现性：EM±1nm ●信噪比：蒸馏水喇曼峰S/N ≥比50,响应时间2s ●测定方法：a.波长扫描b.时间扫描c.定量分析 960CRT型配计算机 ●光谱处理功能： 连续扫描测定：1-4阶导数光谱；计算峰面积；波峰检索；图谱运算；图谱窗口处理；图谱保存及调出；图谱打印输出 ●定量测定： 样品定量分析；时间扫描；绘制标准曲线（1-3次）；浓度直读；自动测定S/N及稳定性；自动背景扣除；定量分析打印输出 970CRT型荧光分光光度计
应用范围 该仪器广泛用于化学、药检、环保、石油化工、医疗卫生、食品营养等场合的微量痕量分析测量。 产品简介 产品特点： 1、高灵敏度高信噪比，S/N比达100以上 2、采用光源监控技术，测量结果稳定 3、采用快速20位A/D变换技术，动态量程宽，线性好 4、采用先进中文windows软件技术，数据图谱处理功能强，操作简便 5、采用标准PC机作为硬件环境，仪器故障率小，可靠性强 6、双单色器系统结构 性能指标：(1)波长范围激发（EX）：200nm-800nm，反射（EM）：200nm-800nm 狭缝：激发（EX）：2nm,5nm,10nm,20nm，发射（EM）：2nm,5nm,10nm,20nm,30nm,40nm，波长准确度：±2nm，波长重复性：≤0.5nm，扫描速度：特快、快、中、慢，时间扫描：60s,300s,600s,900s1200s,1800s6档，灵敏度：6档切换选择，信噪比：激发和发射的频带宽为10nm时蒸馏水的喇曼峰S/N比>100，调零方式：可选择自动调零。
荧光分光光度计及其应用_李淑玲
荧光分光光度计及其应用 李淑玲 地矿部岩矿测试技术研究所 北京 100037 摘要 评述了近年来荧光分光光度计的发展,介绍了国内荧光分光光度计的研制及生产情况,综述了荧光分析技术的应用。 关键词 荧光分光光度计 发展 应用 综述 近年来,我国在荧光分光光度分析技术领域的研究取得了许多新的进展。如荧光总发光光谱技术、荧光探针、光纤荧光传感器、激光诱导时间分辨发光技术、荧光薄层扫描技术、动力学荧光法等。因此,对荧光分光光度计的要求不断提高。目前国内生产荧光分光光度计的厂家较少,国外厂商提供的都是中高档的荧光分光光度计。研制和生产性能可靠的国产荧光分光光度计具有重要意义。 1 基本原理 当激发光照射某些物质时,处在基态的分子吸收激发光后跃迁为激发态,这些激发态分子在因转动、振动等损失一部分激发能量后,以无辐射跃迁下降到低振动能级,再从低振动能级下降到基态,在此过程中激发态分子将以光的形式释放出它们所吸收的能量,这种光称之为荧光,所得到的光谱称为荧光光谱。荧光光谱能够反映荧光物质的特性。荧光分光光度计是基于物质的这种性质而对其进行定性及定量分析的一种分析仪器。 荧光定量分析的数学处理比分子吸收光谱复杂。一般来讲,荧光强度I f等于分子所吸收辐射的光强度I a与量子效率的积[1],即I f= f·I a= f I0(1-10-εbc)。如果荧光物质的浓度足够低,则I f=2.3f I0εbc=kc。这就是荧光定量分析的理论公式,式中ε、b、c分别是摩尔吸光系数、液池厚度及被测物质的浓度。 2 荧光分光光度计的基本结构 荧光辐射是从样品发生的,其在所有方向发射都相同,原则上可以从任何角度进行观测。但从仪器设计和应用的观点来看,90°角度是最方便且是目前使用较为广泛的方式。 荧光分光光度计的基本结构是: 光源※单色器或滤光片※样品池※单色器或滤光片※检测器。 目前荧光分光光度计的常用光源为氙灯,单色器多用光栅,检测器主要用光电倍增管,普通荧光分光光度计的激发和发射波长一般在200～900nm。 3 荧光分光光度计的分类 3.1 滤光片式荧光计 3.1.1 单光束滤光片荧光计 单光束滤光片荧光计的工作原理是第1滤光片允许紫外线(激发光)通过,第2滤光 李淑玲 女,副研究员,近年从事激光喇曼光谱分析技术应用研究。中国分析测试协会九五分析仪器发展调查项目资助。
F-7000荧光分光光度计操作规程
F-7000荧光分光光度计基本操作规程 1、开机顺序 （1）开启计算机。 （2）开启仪器主机电源。按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）。同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP 和RUN指示灯依次亮起来，都显示绿色。 2、打开运行软件。 （1）双击桌面图标（FL Solution 2.1 for F-7000）。主机自行初始化，扫描界面自动进入。 （2）初始化结束后，须预热15-20分钟，按界面提示选择操作方式。 3、关机顺序（逆开机顺序实施操作）： （1）关闭运行软件FL Solution 2.1 for F-7000。 （2）关闭仪器主机电源。 （3）关闭计算机。 注意事项 （1）注意开机顺序。步骤1-（2）若是未先开主机，则程序会抓取不到主机讯号。 （2）注意关机顺序。 （3）为延长仪器使用寿命，扫描速度、负高压、狭缝的设置一般不宜选在高档。 （4）关机后必须半小时（等氙灯温度降下）方可重新开机。
F-7000荧光分光光度计使用操作步骤 1、开机： （1）开启计算机。 （2）开启仪器主机电源。按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）。同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP 和RUN指示灯依次亮起来，都显示绿色。 2、计算机进入Windows XP视窗后，打开运行软件（如图1）。 （1）双击桌面图标（FL Solution 2.1 for F-7000）。主机自行初始化，扫描界面自动进入。 （2）初始化结束后，须预热15-20分钟，按界面提示选择操作方式。 图1 FL Solution 2.1扫描界面
3、测试模式的选择：波长扫描（wavelength scan） （1）点击扫描界面右侧“Method”。 （2）在“General”选项中的“Measurement”选择“wavelength scan”测量模式，如图2。
荧光分光光度计操作规程
RF-5301PC荧光分光光度计操作规程 一.开机 1.先打开RF-5301PC的电源开关（白色），再开电脑，并在D盘建 立自己的文件夹。 2.运行桌面上的程序进入操作界面。 3.点击?Configure? 选择[PC Configuration]设定存盘路径。
4.点击?Configure? 选择[Instrument]→[Initialization]进行仪器初始化。 待初始化完成后点击OK。
二．光谱分析（Spectrum） 1.点击?Acquire Mode?选择[Spectrum]。 2.点击?Configure? 选择[Parameters] 编辑所需的测试条件。编辑完 毕后点击
三．定量分析（Quantitative） 1.点击?Acquire Mode?选择[Quantitative]编辑所需的测试条件。编 辑完毕后点击
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