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菌种鉴定实验过程

菌种鉴定实验过程
菌种鉴定实验过程

菌种鉴定实验过程

一、仪器与试剂 1

1.

二、实验过程

1、基因组DNA 提取 按SK8255(细菌)、 SK8259(真菌)、 SK8257(酵母)试剂盒操作。

2、PCR 扩增

2.2 PCR反应体系:

2.3 PCR循环条件:

3、凝胶电泳

1%琼脂糖电泳,150V、100mA 20min电泳观察(见电泳图DNA Ladder Mix make)。

16SrDNA 18SrDNA ITS 26S

4、纯化回收

PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带,纯化方式见附见说明书(SK8131 ),PCR 产物用PCR引物直接测序。

如需要做克隆测序需要进行下面的步骤:

5、连接

按Takara pMD?18-T Vector 连接试剂盒操作。

6、感受态细胞的制备:(氯化钙法)

6.1 从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落,转到一个含有100 ml LB培养基的1

L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床,300转/分)。

6.2 在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml 聚丙烯管中,在

冰上放置10分钟,使培养物冷却至0℃。

6.3 于4 ℃, 以4000转/分离心10分钟,回收细胞。

6.4 倒出培养液,将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

6.5 以10 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬每份沉淀,放置于冰浴上。

6.6 于4℃,,以4000 转/分离心10分钟,回收细胞。

6.7 倒出培养液,将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

6.8 每50ml 初始培养物用2 ml 用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(含20%甘油)重悬每份细胞沉淀。

6.9 将细胞分装成小份(100μl/支),放于-70℃冻存。

7、连接产物转化

7.1 取100μl感受态细胞,置于冰上,完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。

7.2 加入10μl连接液,轻轻混匀。冰上放置30分钟。

7.3 42℃水浴热激90秒。冰上放置15~20分钟。

7.4 加400μl LB培养基,37℃ 200~250 rpm振荡培养1小时。

7.5 用枪头吸取200μl培养菌液,涂布在预先用20μl 100 mM IPTG和100μl 20 mg/ml X-gal

涂布的氨苄青霉素平板上。

7.6 平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体,然后倒置培养过夜。

8、蓝白斑筛选

当外源DNA片段插入到pUC57中后,由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的

编码,从而影响了其产物β-半乳糖苷酶α-片段的活性,因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上

呈现为白色,而非重组克隆呈蓝色,选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落,

9、质粒提取与测序

用M13+_引物扩增(体系如上)。.M13+/-引物测序

三、测序结果分析

16SrDNA 序列在核糖体数据库https://www.sodocs.net/doc/6e15967460.html,/index.jsp上比对;

比对结果范例:

domain Bacteria (0/20/1186838) (界)

phylum "Actinobacteria" (0/20/176308)(门)

class Actinobacteria (0/20/176308) (纲)

subclass Actinobacteridae (0/20/167455) (亚纲)

order Actinomycetales (0/20/166237) (目)

suborder Streptomycineae (0/20/10027) (亚目)

family Streptomycetaceae (0/20/10027)(科)

genus Streptomyces (0/20/9681) (属)

not_calculated 0.995 1242 Streptomyces sp. a16; DQ513513

匹配程度被匹配菌登录序列长度NCBI上登录号

访问

18SrDNA、ITS、26S在NCBI 上blast比对;结果解释:https://www.sodocs.net/doc/6e15967460.html,/p-545514843.html

菌种鉴定手段

菌种鉴定手段 (1)常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和生理生化特征。形态特征包括显微形态和培养特征;理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应等。 (2)BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础,检测微生物的特征指纹图谱,建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比,得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可,已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 BIOLOG是一种微生物菌种快速鉴定系统,涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 (3)分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系,是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室,配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备,以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA(D1/D2)序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列,提供科学的鉴定结果。(4)API细菌数值鉴定系统

API鉴定系统涵盖15个鉴定系列,约有1000种生化反应,目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中,可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列,通过软件将待测细菌与数据库参比,得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)和相关细菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)和库克菌属(Locuria sp.)进行鉴定。 (5)功能性分析及功能基因 CICC不断致力于工业微生物资源的功能及其功能基因研究,目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定,在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。 (6)RAPD、SSCP技术 随着微生物菌种应用的进一步发展,在食品安全管理、生物产品出口认证、知识产权保护等行业需求日益增加,微生物菌种株水平的鉴别技术成为一个迫切需要解决的问题。 CICC采用随机扩增多态性DNA(Randomly amplified polymorphism DNA,RAPD)技术和单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism,SSCP)技术对微生物菌株进行鉴别。如采用RAPD技术能够对同一菌种原始菌株与诱变菌株进行鉴别,对诱变菌株知识产权保护具有重要意义;采用SSCP技

标准菌种管理规程

标准菌种管理规程 目的:规范药品微生物学检定用菌的管理,最大限度降低变异率,确 保菌种的溯源性与稳定性,从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 职责: QC 主管负责菌种的申购、接受、保存、分发,微生物检验员 负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 范围:本规程适用于检定用菌种的管理,包括菌种的申购、保存、传 代、使用及销毁等。 内容: 1术语 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理 中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存 的菌种,用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养 后,作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内,每萌发一次即 称为一代,从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 2.标准: 2.1 检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况(包括临时检验需要),提出购 买计划,交由质量管理部部长审批后,向中检所菌种保藏中心或省(市)药检所购买冻干菌种(标准菌种);也可以直接向省(市)药检所购

买传代用菌种,购买时,需询问与确定菌种的代数,以便传代时控制 代数。 2.2 检定菌的接收 菌种到达实验室后,由QC主管接收菌种,检查其名称和数量,以及 每一支的完整性,同时将菌种的所有信息,填写在《检定菌接收记录》(附表 1)上,内容包括:名称、数量、编号(无编号者按检定菌种 的编号原则编号)、代数、来源、接收日期、接收人等,贴好标签并 储存于 2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过 5 年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养 基上,待菌生长充分以后,转移至2~8℃冰箱中保存。此法仅用于 工作用菌种的短期保存,并应随时检查其污染杂菌和变异等情况,发现异常情况,经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同, 细菌: 1 个月;酵母菌: 2 个月;霉菌及芽胞: 3 个月。 2.3.2 传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 2.3.2.1.甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面 的菌苔,并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到 预先装入试管中的无菌纯化水中,调整菌液浓度,使其等同于10 号比浊管,向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油(浓度 20%),

菌株鉴定

菌株鉴定 姓名 摘要:pUC载体系列质粒较小,约为2.7 kb,是E.coli最常用的理想质粒克隆载体。当pUC19质粒载体导入到E.coli DH5α后,在IPTG存在下,在含有生色底物X-gal的培养基上形成蓝色菌落。另外质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因(Amp r),质粒pUC19进入E.coli DH5α后,通过α-互补作用,在MAC培养基平板上转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸,pH降低,培养基中的中性红指示剂变红,转化子的菌落变成红色。不含pUC19质粒的E.coli DH5α利用培养基中的有机碳源,不使培养基pH降低,在不含有氨苄青霉素的MAC培养基上形成白色菌落。本实验就是利用这些实验原理进行相应的菌株鉴定实验,其目的是更好地掌握培养基菌落生长情况及菌落颜色的原理,熟悉菌株鉴定的实验步骤,同时学会观察培养基中菌落的颜色特征。通过此次实验,我们达到了预期目的,取得了很好的实验效果。 关键词:pUC19质粒、E.coli DH5α、氨苄青霉素抗性基因(Amp r)、LB培养基、MAC培养基 1.引言 质粒是染色体外的遗传因子,广泛存在于原核生物中,在部分真核生物中也存在。细胞内自然存在的质粒通常不能作为基因工程操作的载体,需要对其进行改造,如根据载体必备的条件插入结构元件和删除质粒上非功能的DNA片段。标记基因是载体所必需的结构元件,按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。选择标记基因用于鉴别目标载体的存在,用于挑选成功转化载体的宿主细胞。筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒,将具有特殊表型的重组质粒挑选出来。α-互补是E.coli最常用的筛选标记,其原理是:β-半乳糖苷酶基因(LacZ)N端多肽和C端多肽单独存在时都无β-半乳糖苷酶活性,当两者存在于同一个细胞即可进行互补而形成完整β-半乳糖苷酶活性。在pUC系列质粒载体上插入了β-半乳糖苷酶的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列,并在这个编码区域中引人多克隆位点,但不破坏LacZ的阅读框架,即不影响其正常功能。而这类载体对应的宿主菌如E.coli DH5α的染色体上整合有β-半乳糖苷酶C端序列的遗传信息。当质粒载体导入到相应宿主菌后,载体上合成的β-半乳糖苷酶N端多肽可以与宿主细胞染色体编码的C 端多肽片段互补形成完整的蛋白质,即表现出β-半乳糖苷酶活性。在乳糖或其结构类似物IPTG存在下,可以诱导β-半乳糖苷酶的合成。在含有生色底物X-gal的培养基上形成蓝色菌落。 pUC载体系列质粒较小,约为2.7kb,是E.coli最常用的理想质粒克隆载体。它们由以下结构元件构成:①来自于E.coli质粒ColE1的松弛型复制起始点。在含有氯霉素的培养基中细胞生长停止后,该复制子仍能继续复制,由此可得到大量质粒DNA。②氨苄青霉素抗性基因(Amp r)。③E.coliβ-半乳糖苷酶基因(LacZ)的启动子及编码β-半乳糖苷酶N端的DNA 序列。④多克隆位点(MCS)区段,包含十几个单一限制性内切酶识别位点,使目的DNA 片段可定向插入。 质粒载体pUC18和pUC19的结构基本相同,只是在LacZ基因的启动子后面多克隆位点的限制性核酸内切酶以互为相反方向排列。在载体pUC18中,EcoRⅠ位点紧接于启动子Plac 下游,而载体pUC19的Hin dⅢ位点紧接于Plac下游,它们共有13个单一限制性核酸内切酶位点。 质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因(Amp r),没有导入质粒pUC19的受体细胞,在

菌种鉴定方法

1. 菌落形态观察 观察菌落的大小、形状、隆起度、边缘、表面性状、颜色与透明度、质地和干湿度。 2. 革兰氏染色 按照革兰氏染色方法进行制片、初染、媒染、脱色、复染、干燥、镜检;干燥后,用油镜观察。 3. 鞭毛染色 挑取18~30 h新鲜平板培养物制备菌悬液,制片,室温自然干燥。滴加硝酸银染色A液覆盖3~5 min,用蒸馏水充分洗去A液,再滴加B液染色约1 min,当涂面出现明显褐色时,立即用蒸馏水冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色,鞭毛显褐色。 4. 糖类分解试验 将被检菌接种于糖发酵培养基中,37℃培养2-3天。如果培养基变黄,说明产酸;如变黄的同时,还有气泡,说明既产酸又产气。培养基仍呈蓝色,说明未产酸。选取木糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖。 5. 吲哚(靛基质)试验 将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中,37℃培养1-2天。于培养液中加入戊醇或二甲苯2-3ml,摇匀,静置片刻后,沿管壁加入试剂2ml,如出现红色沉淀,表示为阳性。 6. 淀粉水解试验 将LB琼脂加热融化,使冷到50℃,加入淀粉溶液,混匀后,倾注平板。将细菌划线接种于平板上,37℃培养24小时,生长后取出,在菌落处滴加革兰氏碘液少许,培养基呈深蓝色,能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环。 9. V-P试验 将被检菌接种于试验培养基中(葡萄糖、K2 HPO4、蛋白胨各5g,溶于1 000ml 水中,分装于试管中,0.075MPa灭菌10分钟),培养2-7天后,于培养物中加入1ml 10%的NaOH,混匀,再加入3-4滴2%氯化铁溶液。数小时后,培养基表面的下层出现红色者,为阳性。 10.甲基红(M.R)试验 接种细菌,于37℃培养2-7天后,于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液(0.1g 甲基经溶于300ml 95%乙醇中,加蒸馏水至500 ml),如呈红色,表示阳性。 11. 柠檬酸盐利用试验 将被检菌接种到Simmons固体柠檬酸盐培养基上,37℃下培养2-4天,能利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长,培养基变为蓝色,不能利用柠檬酸盐的细菌不生长,培养基不变色。 12. 硝酸盐还原试验 将被检细菌接种于硝酸盐培养基中,37℃培养1-2天,每管中先加入甲试剂0.1ml,再加乙试剂数滴,如出现红色,表示阳性。 13. 接触酶试验 将1ml 3%的H2O2倾注于生长物(菌落或菌苔)上,有气泡(O2)发生者为阳性。也可于清洁小试管中加少量H2O2(30%),再用清洁无菌的细玻棒(或火焰封口的毛细管或镍铬做成的接种环)醮细菌少许,插入H2O2液面下,有气

菌种鉴定SOP

微生物的鉴定 1 原则 微生物鉴别应遵循逐步缩小范围的原则,用分类学的知识,一步步地将未知微生物逐步落实到科、属,然后选择相应的鉴定系统将未知的微生物鉴定到种。鉴定包括以下几个环节:①菌种采集②菌种纯化;3菌落形态学观察如形状、大小、色泽;4细胞形态观察如球状、杆状、螺旋状、弧状、丝状及其排列方式;5革兰氏染色反应,阳性或阴性;6氧化与发酵试验;7接触酶与氧化酶试验;鞭毛与动力等等。通过上述基础试验结果再结合细菌鉴定检索表,从而确定微生物所属范围,并选择合适的鉴别试验条,将微生物鉴定到种。也可采用分子生物学鉴定方法,提取DNA后通过扩增、序列分析等方法,测定DNA序列,得到鉴定结果。 2基本定向生化试验 在细菌鉴定过程中,需要最先完成的一些实验成为基本定向生化试验。以下详细介绍这些基本定向生化试验的原理、操作步骤和试剂配制的内容。 A革兰染色试验 原理:由于革兰阳性细菌的细胞壁较厚,细胞壁中的肽聚糖含量高且网格结构紧密,含脂量又低,当用结晶紫复合溶液染色细胞后用脱色时,引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以至关闭,从而阻止了结晶紫-碘复合物的逸出,故而菌体呈现深紫色;而格兰阴性细菌细胞壁中肽聚糖含量低,含脂量又高,当酒精脱色时,脂类物质被溶解,细胞壁通透性增大,结晶紫-碘复合物被抽提出来,从而使菌体呈现复染液的红色。 制片、染色操作在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水,用接种环挑取少量菌龄为18-24小时的菌苔与水滴充分涂抹成均匀的菌膜,自然烘干或在酒精灯火焰上方微热烘干,并在火焰上通过几次,以固定涂片。滴加结晶紫液,初染1分钟,用自来水冲去结晶紫液。滴加卢戈碘液冲去残水并媒染约1分钟后,再用自来水冲去卢戈碘液,将玻片上的水甩干。滴加95%乙醇脱色约20-30秒,并立即用水冲净。滴加沙黄液染1-2分钟后,用水洗净沙黄液,晾干供镜检。 镜检观察在载玻片的菌膜上滴一滴香柏油,用显微镜的油镜观察标本,菌体呈红色为革兰阴性菌;菌体呈蓝紫色为革兰阳性菌。观察菌体的形态、排列(分辨并描述是球菌、杆菌、弧菌、放线菌)和大小(用已标定过大小的目镜微尺测量菌体大小)等。 B. 3%氢氧化钾试验 原理:在碱性溶液(3%KOH)中,革兰阴性细菌的细胞壁会快速破裂,细胞内的脱氧核糖核酸被释放到碱性溶液中,使溶液的黏性增强并形成黏丝:而革兰阳性细菌的细胞壁在碱性溶液中不会被溶解,细菌均匀地分散在碱性溶液中不会产生黏性。本实验用于当革兰染色试验的结果来确定革兰染色实验结果。 材料;3%KOH溶液(W/V)、木质牙签、待检菌的新鲜纯培养物(18-24小时)。 操作:在一洁净的载玻片上等距离滴上滴3%的KOH水溶液;用铜绿假单胞菌或具有等同反应的菌种作为阳性对照;用枯草芽孢杆菌或具有等同反应的菌株作为阴性对照;-用木质或塑料接种环从培养基分别挑取阳性、阴性和待检菌的新鲜纯培养物(18-24小时)于载玻片上的3滴KOH水溶液中,然后用接种环快速

常见细菌鉴定

常见细菌鉴定 平装: 331页 正文语种: 简体中文 开本: 16 ISBN: 9787117119610 条形码: 9787117119610 尺寸: x x cm 重量: 540 g 百分网内容简介 《临床常见细菌、真菌鉴定手册》着重对院内感染的常见细菌、真菌及其耐药性检测和研究进行了细致阐述。细菌耐药也是当前临床面临的重大难题之一,抗生素滥用是造成耐药性不断增长的主要原因。微生物是进化史上最成功的例子,存在几十亿年了,新兴的微生态学理论认为,人类和微生物之间是适应而不是对抗。院内感染菌株绝大部分是条件致病菌,当机体免疫力低下、抗生素使用不合理破坏了正常菌群,导致微生态失衡情况下,引起感染的发生、发展。我从事微生态研究多年,深刻认识到只有从生态平衡角度,将传统的单纯“杀菌”理论转变为“杀菌”加“促菌”理论,保护人体的正常菌群,维护人体微生态平衡,提高机体免疫能力,才是控制感染的根本办法。 百分网目录

上篇临床细菌学 第一章需氧及兼性厌氧,革兰染色阴性杆菌、球杆菌、球菌及弯曲菌和螺旋菌 第一节心杆菌属 第二节放线杆菌属、艾肯菌属、金氏杆菌属和色杆菌属 第三节弗朗西丝菌属 第四节布鲁菌属 第五节军团菌属 第六节假单胞菌属 第七节伯克霍尔德菌属、窄食单胞菌属、丛毛菌属和食酸菌属 第八节不动杆菌属 第九节莫拉菌属 第十节金黄杆菌属和威克斯菌属 第十一节奈瑟菌属 第十二节鲍特菌属 第十三节产碱杆菌属、无色杆菌属、苍白杆菌属和根瘤菌属 第十四节弧菌属 第十五节气单胞菌属 第十六节肠杆菌科

第十七节巴斯德菌属 第十八节弯曲杆菌属和弓形菌属 第十九节螺杆菌属 第二十节巴尔通体属 第二十一节钩端螺旋体属 第二十二节疏螺旋体属 第二十三节密螺旋体属 第二章需氧革兰染色阳性球菌及杆菌 第一节葡萄球菌属 第二节链球菌属 第三节肠球菌属 第四节气球菌属及其相关菌属 第五节李斯特菌属和丹毒丝菌属 第六节棒状杆菌属及相关菌属 第七节芽胞杆菌属和其他需氧芽胞杆菌 第八节分枝杆菌属 第九节奴卡菌属、红球菌属 第三章专性厌氧菌 第一节消化球菌属、消化链球菌属、嗜胨菌属、微金菌属和厌氧球菌属 第二节韦荣菌属、氨基酸球菌属和巨形菌属 第三节丙酸杆菌属、放线菌属、双歧杆菌属、真杆菌

标准菌种管理规程

标准菌种管理规程 目的:规药品微生物学检定用菌的管理,最大限度降低变异率,确保菌种的溯源性与稳定性,从而确保微生物学检验结果的准确可靠。职责:QC主管负责菌种的申购、接受、保存、分发,微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 围:本规程适用于检定用菌种的管理,包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。 容: 1 术语 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种,用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后,作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基,每萌发一次即称为一代,从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。 2.标准: 2.1检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况(包括临时检验需要),提出购买计划,交由质量管理部部长审批后,向中检所菌种保藏中心或省(市)药检所购买冻干菌种(标准菌种);也可以直接向省(市)药

检所购买传代用菌种,购买时,需询问与确定菌种的代数,以便传代时控制代数。 2.2检定菌的接收 菌种到达实验室后,由QC主管接收菌种,检查其名称和数量,以及每一支的完整性,同时将菌种的所有信息,填写在《检定菌接收记录》(附表1)上,容包括:名称、数量、编号(无编号者按检定菌种的编号原则编号)、代数、来源、接收日期、接收人等,贴好标签并储存于2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过5年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌生长充分以后,转移至2~8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存,并应随时检查其污染杂菌和变异等情况,发现异常情况,经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同,细菌:1个月;酵母菌:2个月;霉菌及芽胞:3个月。 2.3.2传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 2.3.2.1.甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔,并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中,调整菌液浓度,使其等同于10号比浊管,向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油(浓度20%),

细菌鉴定方法

1.2.1 形态学特征 按照东秀珠和蔡妙英编《常见细菌系统鉴定手册》(1999),中科院微生物所编著《一般细菌常用鉴定方法》(1978)的方法进行鉴定。芽孢杆菌属鉴定到种,参照了蔡妙英等译《芽孢杆菌属》(1980)的方法。 (1)革兰氏染色:挑选少许菌苔,涂布于干净玻片的蒸馏水中,风干固定,结晶紫染色(结晶紫2g,草酸铵0.8g,95%乙醇20 ml,加水至100 ml)1min,水洗后碘液(碘1g,碘化钾2g,水300 ml)作用1min,水洗,脱色,用番红O 液染3min,水洗,风干,光学显微镜观察。 (2)鞭毛染色:将16~24h菌龄的菌苔在载玻片上的水滴中轻蘸几下,将玻片倾斜,使菌液缓慢流到另一端,然后平放在空气中干燥。干燥后滴甲液(丹宁酸5g,FeCl3 1.5g,15%福尔马林2ml,1%NaOH 1ml,蒸馏水100 ml)染6~10min,水洗,干燥后,用乙液(2%AgNO3溶液)加热复染30min,蒸馏水冲洗,干燥,镜检,菌体为深褐色,鞭毛为褐色。 (3)运动性:半固体琼脂穿刺法,将菌种接在可使鉴定菌生长良好的培养基中,其中含0.3~0.6%的琼脂。适温培养,运动性可用透射光目测,如生长菌只生长在穿刺线上,边缘十分清晰,则表明鉴定菌无运动性;如生长菌由穿刺线向四周呈云雾状扩散,其边缘呈云雾状,则表示鉴定菌有运动性。 (4)芽孢染色:孔雀绿染色法。按革兰氏染色涂片后,用饱和的孔雀绿水溶液(约7.6%)染20 min,水冲洗后在用0.5%番红O复染20~30s,水洗,吸干,镜检。芽孢呈绿色,菌体和芽孢囊呈微红色。 (5)抗酸染色:常规涂片,石碳酸复红(10%碱性复红乙醇饱和液10 ml,5%石碳酸水溶液100 ml)加热染色5 min,倾去染液用酸性乙醇脱色,吕氏美蓝(2%亚甲基蓝乙醇饱和液30 ml,0.01%KOH 100 ml。)复染2min,水洗,吸干,镜检。 (6)荚膜染色:在载片一端滴一滴无菌水,取少许菌苔在水滴中制成悬液。取一滴墨汁与菌悬液混合,并用另一载片之一端将此水滴在载片上刮成薄膜风干。用纯甲醇固定1min,加0.5%番红O液数滴滴于涂片上,冲去残余甲醇,并染30s,然后倾去染液,立即吸干,镜检。 1.2.2 培养及生理特性 (1)菌落形态:用划线法将菌种接在平板培养基上,适温培养1~2d,出现单菌落开始观察,包括形状和大小,边缘,表面,隆起形状,透明度,菌落和培养基的颜色等。 (2)生长温度和耐热性:将菌种转接到几支试管中,分别在不同温度下培养,每处理2管,目测生长情况。

不常见细菌的快速鉴别方法

不常见细菌的快速鉴别方法 一. 不常见革兰阴性菌 1. 布氏杆菌属 布氏杆菌属是一类革兰阴性细小杆菌,牛、羊、猪等动物最易感染。人类接触带菌动物或食用病畜及其乳制品,均可被感染。布氏杆菌病广泛分布世界各地,我国部分地区曾有流行。布氏杆菌属分为羊、牛、猪、鼠、绵羊及犬布氏杆菌6个种,20个生物型。中国流行的主要是羊、牛、猪三种布氏杆菌,其中以羊布氏杆菌病最为多见。 布氏杆菌属细菌为非抗酸性,无芽胞,无荚膜,无鞭毛,呈球杆状(见图1)。血琼脂(BAP)上为透明或半透明、光滑且有光泽菌落。此细菌不在麦康凯琼脂上生长。布氏杆菌属细菌尿素阳性,触酶、氧化酶阳性,而吲哚阴性。由于该菌属细菌具有强的传染性,因此一旦怀疑应送往LRN B级参考实验室进行确认。 2. 空肠弯曲菌 空肠弯曲菌是一种人畜共患病病原菌,可以引起人和动物发生多种疾病,并且是一种食物源性病原菌,认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因。其致病因素包括粘附、侵袭、产生毒素和分子模拟机制等四个方面,通过分子模拟机制可以引起最严重的并发症一格林一巴利综合征。空肠弯曲菌可以通过产生细胞紧张性肠毒素、细胞毒素和细胞致死性膨胀毒素而致病。空肠弯曲菌对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感,但近年发现了不少耐药菌株及多重耐药性菌株。 空肠弯曲菌菌体轻度弯曲似逗点状(见图2)。菌体一端或两端有鞭毛,运动活泼,在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜,不形成芽胞。微需氧菌,在含2.5~5%氧和10% CO2的环境中生长最好,在正常大气或无氧环境中均不能生长,最适温度为37~42℃。本菌在普通培养基上难以生长,在凝固血清和血琼脂培养基上培养36小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落,单个菌落呈中心凸起,周边不规则,无溶血现象。空肠弯曲生化反应不活泼,不发酵糖类,不分解尿素。可还原硝酸盐,氧化酶和触酶为阳性。能产生微量或不产生硫化氢,甲基红和v-p试验阴性,枸椽酸盐培养基中不生长,在弯曲菌中马尿酸呈阳性反应具有重要鉴定价值。

细菌常用生理生化鉴定

细菌鉴定中常用的生理生化反应 录入时间:2009-8-13 15:12:12 来源:中国生命科技论坛 1、实验原理 (1)细菌生化试验 各种细菌所具有的酶系统不尽相同,对营养基质的分解能力也不一样,因而代谢产物或多或少地各有区别,可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物,从而鉴别细菌的种属,称之为细菌的生化反应。 (2)糖(醇)类发酵试验 不同的细菌含有发酵不同糖(醇)的酶,因而发酵糖(醇)的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同,如有的产酸产气,有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溟甲酚紫[P HS . 2 (黄色)一6 . 8 (紫色)] ,当发酵产酸时,可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。 (3)甲基红(Methylred )试验(该试验简称MR 试验) 很多细菌,如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸再被分解,产生甲酸、乙酸、乳酸等,使培养基的pH 降低到4 . 2 以下,这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 (红色)一pH6 . 2 (黄色)。若某些细菌如产气杆菌,分解葡萄糖产生丙酮酸,但很快将丙酮酸脱梭,转化成醇等物,则培养基的pH 仍在6 . 2 以上,故此时加入甲基红指示剂,呈现黄色。 (4)大分子物质代谢实验. 靛基质(口引睬)试验 某些细菌,如大肠杆菌,能分解蛋白质中的色氨酸,产生靛基质(叫睬),靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合,形成玫瑰色靛基质(红色化合物)。 硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸(肌氨酸、半肌氨酸等),产生硫化氢,硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐,形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性,可借以鉴别细菌。 明胶液化实验 某些细菌具有胶原酶,使明胶被分解,失去凝固能力,呈现液体状态,是为阳性。淀粉水解试验(在紫外诱变中做,本实验不做) 细菌对大分子的淀粉不能直接利用,须靠产生的胞外酶(淀粉酶)将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖),再被细菌吸收利用,细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明,即用碘测定不再产生蓝色。 (5)有机酸盐及氨盐利用试验 柠檬酸盐利用试验 柠檬酸盐培养基系一综合性培养基,其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢按是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌,能利用柠檬酸钠为碳源,因此能在柠檬酸盐培养基上生长,并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐,使培养基变为碱性。此时培养基中的溟廖香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌,在该培养基上不生长,培养基不变色。 2、实验仪器,材料和用具 (1)实验仪器 37OC 恒温培养箱、20OC 恒温培养箱(室温代替)。 (2)微生物材料 大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌这四种菌种的斜面各1 支。 (3)试剂

细菌鉴定及检测方法

细菌鉴定及检测方法 一、启动条件 1、目的样出现坏包,若批次相同,取表现性状相同的任意一包进行细菌初步鉴 定。若批次不同则分别进行细菌初步鉴定。 2、随机样出现坏包,必须进行细菌初步鉴定。 二、胀包 1、记录批次。 2、及时用72%的酒精对样品的外表进行消毒,尽量不损坏封合待以后检查。在 超净台内以无菌操作剪开包装,再避开横竖封处剪开一个圆形或三角形。3、对样品进行微生物划线培养。 3.1采用普通营养琼脂培养基做细菌的划线培养36±1℃、48小时。 3.2分别吸取10毫升样品到两个无菌的小试管中,,分别在80和100℃的水 浴中加热10分钟,冷却用营养琼脂分别做芽孢(36±1℃、72小时) 和耐热芽孢(55±1℃、72小时)的划线培养。 3.3采用普通营养琼脂培养基或快速检测培养基做嗜冷菌/低温菌的划线培 养(4—6℃ 10天或21±0.5℃ 25小时)。 3.4 必须用高盐察氏或虎红琼脂培养基做霉菌和酵母菌的划线培养 (25—28℃ 5--7天) 4、对样品做感官检测。 5、用PH计检测样品的PH值。 6、将样品倒掉,进行包装密封性检查,并进行记录。 7、记录菌落特征。 8、选区不同形态的单一菌落进行坚定。 8.1 革兰氏阴性菌和阳性菌的鉴定: 8.1.1涂片、革兰氏染色、镜检。或结晶紫染色、镜检、氢氧化钾拉 丝试验。 8.1.2革兰氏染色、结晶紫染色方法见《微生物检测》 8.1.3氢氧化钾拉丝试验 在微生物载物片上滴一滴3%氢氧化钾,用接种针从培养皿上的

菌落中挑取微生物,放在氢氧化钾溶液中用力搅拌。7—10秒后,抬 起针头,观察针头和玻片之间是否有丝状物,如果15—20 秒后二者 之间无丝状物,停止搅拌。 判定:无丝状物阳性;有丝状物阴性。 8.2 过氧化氢酶试验(或过氧化氢酶试纸)(产气试验): 试剂:10%过氧化氢溶液 步骤:在微生物载物片上滴一滴10%过氧化氢,用接种针从培养皿上的菌落中挑取微生物,放在过氧化氢溶液中看是否有气体产生。 判定:产气阳性;不产气阴性。 8.3氧化酶试验 试剂:含1%四甲基双噻二胺和99%的乙醇溶液。 步骤:用上述试剂将一张滤纸浸透(或直接采用氧化酶试纸条),然后进行细菌培养物的涂片试验。 判定:30秒内使显色物质变为深蓝色阳性,不变色阴性。 三、酸包 1、发现酸包后,及时将料液快速转入无菌瓶中。 2、记录批次 3、其它项目检测同胀包。

菌株分离鉴定、药敏实验及PCR扩增实验过程

目录 2.1菌株的分离纯化 (1) 2.1.1菌株的分离 (1) 2.1.2菌株的纯化 (1) 2.2菌株的鉴定 (2) 2.2.1革兰氏染色镜检 (2) 2.2.2菌株的生化鉴定 (2) 2.3药敏试验 (3) 2.3.1药物的配制 (3) 2.3.2质控 (4) 2.3.3MIC(最小抑菌浓度)实验 (4) 2.4 CTX- M型基因的PCR扩增模板的提取 (7) 2.5 CTX- M型基因的PCR扩增 (7) 2.5.1 PCR 扩增引物及条件 (7) 2.5.2电泳检测PCR扩增产物 (8)

2.1菌株的分离纯化 2.1.1菌株的分离 2.1.1.1实验的准备 1.分离管的准备:本实验需要100个50ml离心管 (1)用过的离心管,将盖子拧开,加入清洁剂,沸水浴10min,毛刷清洁; (2)没入加入清洁剂的水中,灌满水,不要留有大气泡; (3)放入超声清洁机中超声清洁45min,25℃,100Hz; (4)倒出管中水,灌满去离子水,再超声20min,25℃,100 Hz; (5)倒出管中水,重复(4)一次; (6)倒出管中水,放入60℃烘箱中烘干; (7)待烘干后装入保鲜袋中,扎孔通气,再用报纸或牛皮纸包好,放入高压锅中高压灭菌,121℃,20min; (8)高压后取出放入烘箱中,烘干后待用。 2.BPW(蛋白胨水)的配制:按所选试剂的规格进行配制,再送入高压锅中高压灭菌,高压后放入烘箱中烘干待用。注意瓶装液体高压前一定要盖子拧松。 3.试管的准备:本实验需要100根试管 (1)塞子拔出,与试管一起放入清洁剂水中,沸水浴煮沸10min,毛刷清洁; (2)10个一捆,于烘箱中烘干后,塞上塞子,报纸或牛皮纸包好,高压; (3)取出后烘干待用。 4.LB肉汤培养液的准备:本实验需要100根LB管 根据所选购商品说明配制,将配制好的LB培养液,分装到100根干净试管,每根3ml,包好后于121℃高压15min,烘干待用。 5.麦康凯琼脂培养基的准备: 按所选商品说明配制,121℃高压15min,温度稍凉后于超净台中倒板,待吹干后收板待用。 2.1.1.2实验过程 (1)每个分离管装入20mlBPW; (2)三点取样剪取100份待检肉样分装到100个分离管中,按肉样的标号在分离管上标号,放入37±1℃温箱摇床上培养6h,200r; (3)取分离管中的菌液50μL加入LB管中,标号,37±1℃温箱摇床上培养10-12h,200r; (4)用接种环取一环菌液画到麦康凯琼脂培养基上,标号,37±1℃温箱过夜培养。 2.1.2菌株的纯化 2.1.2.1实验的准备 1.伊红美兰(EMB)琼脂培养基的准备: 按所选商品的规格配制,121℃高压15min,温度稍凉后于超净台中倒板,待吹干后收板待用。 2. LB肉汤培养液的准备:同2.5.1.1.1中LB肉汤培养液的准备。 2.1.2.2实验过程

菌种鉴定的分子生物学方法

菌种鉴定的分子生物学方法 ——16S rDNA测序鉴定菌种 一.原理 细菌中包括有三种核糖体RNA,分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。5S rRNA虽易分析,但核苷酸太少,没有足够的遗传信息用于分类研究;23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍,分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中,又具有保守性和存在的普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高,因此,现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA,rRNA基因由保守区和可变区组成。在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性,根据这些保守区可以设计出细菌通用物,可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段,并且这些引物仅对细菌是特异性的,也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补,而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此,16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展,越来越多的微生物的16S rDNA序列被测定并收入国际基因数据库中,只要将基因序列放入基因数据库进行对比,便可快速的鉴定所测定的细菌种属,这样用16Sr DNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。二.技术路线 该方法包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。具体技术路线如下: 三.方法步骤 (一)细菌基因组DNA提取(酶解法) 1. 挑取单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。

细菌鉴定流程

细菌鉴定流程: 取一环标本四区划线接种平板(如为粪便标本接种SS,MAC平板) 培养18-24小时后取一区菌落革兰染色,报告为革兰阳性球菌/革兰阴性球菌/革兰阳性杆菌/革兰阴性杆菌,注意区分细菌和真菌 一般情况下不会给你们做革兰阳性杆菌和革兰阴性球菌 革兰阳性球菌鉴定流程: 先做3%触酶试验:阳性的为葡萄球菌或微球菌,阴性为链球菌或肠球菌 葡萄球菌和微球菌的区别:葡萄糖OF试验,葡萄球菌为F型,微球菌为O型 所以如果做到一个触酶阳性的革兰阳性球菌都要做下葡萄糖OF试验,DNA酶试验,新生霉素试验,血浆凝固酶试验 链球菌和肠球菌的区别:链球菌高盐和胆汁七叶苷试剂均为阴性,而肠球菌都为阳性。 链球菌属内区别:本来可以通过溶血来区分一些的,但是由于实验室的平板αβ溶血比较难区分 所以如果做到一个触酶阴性的革兰阳性球菌都要做下高盐,胆汁七叶苷,杆菌肽,奥普托欣,CAMP 如果做到一个奥普托欣敏感的革兰阳性球菌再加做胆汁溶菌试验和菊糖试验(阳性为变红)可判定为肺炎链球菌 革兰阴性杆菌鉴定流程: 先做氧化酶试验: 氧化酶阴性的革兰阴性杆菌都要做下KIA,MIU,葡磷两支(做MR,VP),苯丙,枸橼酸盐,硝还,蛋白胨水(做吲哚试验),赖氨酸,鸟氨酸,氨对 如果KIA结果为A/A或者K/A的应为肠杆菌科细菌,如上面向个反应还不能区分细菌到种根据教科书307页加做试验。 一般情况下只会给你们做大肠埃希菌,志贺菌属(四种),沙门菌属(甲副,乙副,伤寒),弗劳地枸橼酸杆菌,肺炎克雷伯,产酸克雷伯,产气肠杆菌,阴沟肠杆菌,普通变形杆菌,奇异变形杆菌,沙雷菌属,摩根菌属,普罗威登斯菌属。 如果KIA结果为K/K应怀疑为不动杆菌属或者嗜麦芽窄食单胞菌:这两个菌区分可通过麦芽糖和赖氨酸试验区分, 如为氧化酶阳性,要做葡萄糖的OF试验(用非发酵),硝还产气,精氨酸双水解酶,一般情况下只有两种菌给你们做一个是铜绿假单胞菌,一个是粪产碱杆菌, 真菌给你们做的一般情况只有白色念珠菌和新生隐球菌,通过墨汁负染,芽管试验,厚膜孢

常见细菌种属鉴定

常见细菌种属鉴定 摘要:【目的】了解细菌生理生化反应原理,掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。分析不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。研究细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。【原理】各种细菌所具有的酶系统不尽相同,对营养基质的分解能力也不一样,因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物,从而鉴别细菌的种属,称之为细菌的生理生化反应。关键词:微生物;细菌;种属;鉴定 Common bacterial species identification Abstract: [ Objective ] to understand bacterial physiological and biochemical reaction principle, master the identification of bacteria commonly found in the physiological and biochemical reaction method. Analysis of different bacteria on different carbon, nitrogen containing compounds are decomposed using the situation. Studies on bacteria in different culture medium with different growth phenomenon and its metabolites in bacterial identification and significance of. [ principle ] various bacteria with enzyme system is endless and same, on nutrition matrix decomposition ability is different, so the metabolite differences. By physiological and biochemical test methods for detection of bacteria on a variety of substrate metabolis m and its metabolites, thus differentiating bacterial species, known as bacterial physiological and biochemical reaction. Key words: microbe; bacteria; species identification 前言 在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。代谢的过程主要是酶促反应过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内,称为胞内酶(endoenzymes)。许多细菌产生胞外酶(exoenzymes),这些酶从细胞中释放出来,以催化细胞外的反应。各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异,如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的最终产物的不同,反映出它们具有不同的酶系和不同的生理特性,这些特性可被用作为细菌鉴定和分类的内容。 在这部分实验中,通过细菌对大分子物质的水解、糖发酵实验、鉴定肠道菌的不同生理生化反应等几个试验,来证明不同细菌生理生化功能的多样性。 1 .材料和方法 1.1实验器材 1.1.1菌种 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌; 1.1.2培养基 固体淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基等; 1.1.3试剂和溶液 甲基红,Lugol’s碘液,40%的KOH,5%的a-萘酚溶液; 1.1.4仪器或其他用具 无菌培养皿,无菌试管,杜氏小管,记号笔,移液管及无菌枪头,棉塞,皮筋,报纸,培养箱等。

菌种鉴定常见问题解答

菌种鉴定常见问题解答 1.菌种鉴定的方法和步骤是什么? 菌种鉴定一般就只要提取基因组DNA,然后PCR扩增16srDNA片段,上GeneBank或者Eztaxon对比即可。一般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌(当然也有例外,DNA序列仅仅是一个参考指标)。 -----消息来源:百度问答 . 2. 微生物的菌种鉴定可以鉴定到“株”一级吗? 如果你的菌株是自然界中分离得到,就只能鉴定到种,不能鉴定到株,因为多多少少和其他株系的细菌有区别,即便你做了一些特征的鉴定,发现和某一株细菌一模一样,你也没有理由说你的细菌就是那一株细菌,因为你不可能把所有的特征都做完,株和株之间的关系就相当于不同的人之间的关系,世界上不可能有完全相同的两个人。除非你知道你的细菌本来就是某一株细菌扩增出来的(而且要保证没有变异,否则就是一个新株),可是这样就没必要鉴定了。 -----消息来源:百度问答 3.为什么鉴定出来的菌种跟我想象的相差太大? 答:我们菌种鉴定使用PCR直接扩增的方法,即以客户提供的菌株为模版直接进行PCR扩增,中间不经过传代培养,因此不会引入新的污染,如果出现结果不一致的情况,一般有以下原因导致: 1、您提供的样品未经过三次分离纯化,含有其他杂菌; 2、您提供样品的真实情况确认如此。 建议您提供三次纯化的菌株重新进行鉴定。 4.为什么有时会出现PCR扩增不出的现象; 答:扩增不出的原因主要有以下几种: 1、您提供的菌种从严格意义上讲不是细菌或者真菌,或者是信息有误; 2、您提供的菌种为革兰氏阳性菌,由于细胞壁较厚,采用常规方法不能有效地破壁; 3、培养基或菌体中表达产物含有抑制PCR产物的组份。 对于第二种或第三种情况需要提供基因组DNA。 5.PCR扩增直接测序为什么会出现套峰的现象; 答:1、测序结果个别碱基出现N,是由细菌rDNA多态性造成,对菌种鉴定没有无影响; 2、所有测序反应均出现大面积套峰,是由于您提供的样品模版不纯造成的。这种情况需要重新纯化菌种。 6.PCR产物克隆测序为什么会出现结果分离的现象? 答:我们以菌种为模版直接进行PCR扩增,然后对PCR产物进行克隆测序,如果出现2种或以上的测序结果,说明您提供的模版不单一,即菌种不纯,含有其他杂菌,这种情况建议您将菌种重新进行三次以上纯化。 7.菌种鉴定可以鉴定到种吗? 答:利用rRNA的保守区域进行鉴定只是菌种鉴定的一个分子生物学指标,通过鉴定结果可以了解未知菌株和NCBI公布序列的哪个种属比较接近。

菌种鉴定的几方面特征

菌种鉴定的几方面特征 1、个体形态:镜检细胞形状、大小、排列,革兰氏染色反应,运动性,鞭毛位置、数目,芽孢有无、形状和部位,荚膜,细胞内含物;放线菌和真菌的菌丝结构,孢子丝、孢子囊或孢子穗的形状和结构,孢子的形状、大小、颜色及表面特征等。 2、培养特征:①在固体培养基平板上的菌落和斜面上的菌苔性状(形状、光泽、透明度、颜色、质地等)。 ②在半固体培养基中穿刺接种培养的生长情况。③在液体培养基中混浊程度,液面有无菌膜、菌环,管底有无絮状沉淀,培养液颜色等。3、生理生化特征:生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白的本质和活性直接相关,酶及蛋白质都是基因产物,所以对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较,加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多,因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。4、血清学试验与噬菌体分型。5、氨基酸顺序和蛋白质分析。 6、核酸的碱基组成【(G+C)%】 7、核酸的分子杂交。 营养缺陷型的应用 从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株,称为野生型菌株。野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养(氨基酸、维生素、核酸等)的能力,只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长,称为营养缺陷型。营养缺陷型菌株的筛选,在生产实践和基础理论中都有着重要的意义。生产实践中,营养缺陷型可用于工业微生物育种,协助解除代谢反馈调控机制,从而达到大量积累终产物的目的;也可将营养缺陷型菌株作为生产菌种杂交、重组育种时的遗传标记。在基础理论中,营养缺陷型不仅被广泛应用于阐明微生物代谢途径上,而且在遗传学上具有特殊的地位。在遗传规律中的转化、转导、原生质体融合、质粒和转座因子等的研究中,营养缺陷型是最常用的标记菌种。代谢调控的类型 1、初级代谢的调节控制:虽然代谢调节方式很多,由于微生物细胞体内的所有生化反应都是在酶的催化下进行的,因此,对酶的调节控制是最主要、最有效的调控方式。它包括两个方面,一是调节酶的合成量(反馈阻遏),二是调节现成酶分子的催化活力(反馈抑制)。两者密切配合和协调,以达到最佳的调节效果。①酶合成的调节:酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速度的调节机制,这是一种在基因水平上(在原核生物中主要在转录水平上)的代谢调节。凡能促进酶生物合成的调节,称为诱导,而能阻碍酶生物合成的调节,则称为阻遏。 ②酶活性的调节:酶活性调节是以酶分子的结构为基础的,在酶分子水平上的一种代谢调节。它是通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率,包括酶活性的激活和抑制两个方面。2、次级代谢的调节控制:①次级代谢产物的诱导调节②次级代谢产物碳源分解调节③次级代谢产物氮源分解调节④次级代谢反馈调节⑤磷酸盐调节⑥细胞膜透性的调节原生质体的制备方法 制备大量具有活性的原生质体是微生物原生质体融合育种的前提。为制备原生质体,必须有效地除去细胞壁。去壁的方法有三种:⑴机械法⑵非酶分离法⑶酶法。采用前两种方法制备的原生质体效果差,活性低。酶法分离原生质体的方法:首先选择原始亲株,经过遗传标记筛选,得到直接亲本,采用培养皿平板玻璃纸或摇瓶振荡法培养,取年轻的菌体转入到高渗溶液中,加入有关水解酶,在一定条件下(温度、pH值等)酶解细胞壁。酶解后释放的原生质体和残存菌丝片断的混合液经过滤,除去大部分菌丝碎片。滤液进一步低速离心10min,洗涤后弃去上清液,沉淀悬浮于同一种高渗溶液中,即可得到纯化的原生质体。 融合体的鉴定 融合体中除重组体外,还有异核体或部分结合子、杂合二倍体或杂合系,这些都会在平板上形成菌落,检出融合体的方法有多种,在育种工作中可根据实验目的和微生物不同加以选择,下面是在原生质体融合育种中经常采用的。⑴利用营养缺陷型标记选择融合体,其检出设计的原则是在分离的培养基上只有融合体生长而不能让双亲本原生质体形成菌落。融合的双亲带有不同营养缺陷型标记,原生质体融合处理后的混合物直接分离到基本培养基上就可检出融合体。⑵利用抗药性选择融合体,微生物的抗药性是菌种的重要特性,是由遗传物质决定的。不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异,利用这种特性也可用于融合体筛选。 ⑶利用荧光染色法选择融合体,荧光染色法是事先使双亲染色体而携带不同荧光色素标记,然后在显微操作器和荧光显微镜下,挑取同时带有双亲原生质体荧光标记的融合体,直接分离到再生培养基上再生,最后得到融合体。⑷钝化选择法,用灭活原生质体和具活性原生质体融合(营养缺陷型),由于灭活亲株原生质体和营养缺陷型亲株原生质体在基本培养基上都不能生长,只有融合体才能形成菌落。 菌种选育的方法和特点 1、诱变育种:微生物的诱变育种,是以人工诱变手段诱发微生物基因突变,改变遗传结构和功能,通过筛选,从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的突变株,并且找出发挥这个变株最佳培养基和培养条件,使其在最适的环境条件下合成有效产物。基因突变是微生物变异的主要源泉。人工诱变又是加速基因突变的重要手段。以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种,具有速度快、收效大、方法简单等优点,它是菌种选育的一个重要途径。 2、杂交育种:微生物杂交的本质是基因重组,优点:第一,通过具有不同遗传性状菌株的杂交,使遗传物质进行交换和重新组合,改变亲株的遗传物质基础,扩大变异范围,使两亲株的优良性状集中于重组体内,获得新品种。第二,通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体,不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降,代谢缓慢等缺陷,也可以提高对诱变剂的敏感性,降低对诱变剂的“疲劳” 效应。第三,通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律,丰富并促 进遗传学理论的发展。3、基因工程育种:与传统育种方法不同的是, 基因工程育种不但可以完全突破物种间的障碍,实现真正意义上的远缘 杂交。而且这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍,还可实现动物、 植物、微生物之间的杂交。广义的基因工程育种包括所有利用DNA重 组技术将外源基因导入到微生物细胞,使后者获得前者的某些优良性状 或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。由于微生物是单细胞,且 结构简单,是基因工程理想的表达载体。所以许许多多来自于不同界的 物种(人体、动物、植物、微生物等)的基因都被成功地克隆到微生物 细胞中并获得表达。 诱变育种的方法和优缺点 诱变育种具有方法简单、投资少、收获大等优点,但它最大缺点是缺乏 定向性。在诱变育种过程中应注意出发菌株、诱变剂及诱变剂量的选择、 诱变处理方式方法的应用,以及结合有效的筛选方法等来弥补不足,以 提高诱变育种的效率。诱变育种的步骤和方法包括:出发菌株的选择, 单孢子(或单细胞)菌悬液的制备,诱变剂及诱变剂量的选择,诱变的 处理方法,以及纯化分离等。1.出发菌株要求:⑴对诱变因素敏感的菌 株;⑵选择具备一定生产能力,并且在生产过程中经过自然选育的菌株; ⑶采用具有有利性状的菌株,如生长速度快、营养要求低以及产孢子早 而多的菌株;⑷选择纯种作出发菌株;⑸选择出发菌株应考虑其稳定性; ⑹选择出发菌株的其他因素;2.出发菌株的纯化:确定诱变出发菌株之 后,就要进行纯化,通过菌种纯化分离,从单菌落中挑选所需要的优良 菌株,与具有其他性状的菌株分离开来,从中获得遗传性状基本一致的, 并且稳定的变种。纯种分离方法,常用划线分离法和稀释分离法。 3. 单孢子(或单细胞)悬液的制备:在诱变育种中,所处理的细胞必须 是单细胞、均匀的悬液状态。这是因为,一方面分散状态的细胞可以均 匀地接触诱变剂,另一方面又可避免长出不纯菌落。4.诱变剂及诱变剂 量:凡能诱发生物基因突变,并且突变频率远远超过自发突变率的物理 因子或化学物质,称为诱变剂。它们包括物理诱变剂、化学诱变剂和生 物诱变剂三大类。诱变的最适剂量,应该使所希望得到的突变株在存活 群体中占有最大的比例,这样可以减少以后的筛选工作量。5.诱变的处 理方法:⑴单因子处理⑵复合因子处理①两个以上因子同时处理②不同 诱变剂交替处理③同一种诱变剂连续重复使用④紫外线光复活交替处 理。 反馈阻遏和反馈抑制的原理 反馈阻遏:主要是通过终产物与阻遏蛋白的亲和力的改变,使阻遏蛋 白与操纵基因结合,不能合成mRNA,从而达到对整个反应过程进行调 节的目的。反馈抑制:主要的作用方式在于末端产物对反应途径中调 节酶的抑制。受反馈抑制的调节酶一般都是变构酶,酶活力调控的实质 就是变构酶的变构调节。变构酶分子具有两个和低分子物质结合位点, 一个是与底物结合的催化中心(活性中心),另一个可与调节因子(又 称效应物)相结合的调节中心(变构中心)。当效应物与调节中心结合 后,可引起酶蛋白分子发生构象变化,从而引起酶的活性中心对底物的 亲和力和催化能力的改变,阻碍了酶和它的底物的结合,促进或抑制了 酶活力,使整个代谢途径的快、慢受到调节,称这种现象为变构效应。 抗反馈调节菌株的筛选 抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其 特点是所需产物不断积累,不会因其浓度超量而终止生产,如果由于结 构基因突变而使变构酶成为不能和代谢终产物相结合的,便是失去了反 馈抑制的突变,称为“抗反馈突变型”,若是由于调节基因突变引起调节 蛋白不能和代谢终产物相结合而失去阻遏作用的,称为“抗阻遏突变 型”。操纵基因突变也能造成抗阻遏作用,产生类似于组成型突变的现 象。其方法是把结构类似物作为筛选的遗传标记。通常是把结构类似物 和培养基混合制成平板,诱变后菌体分离其上,经培养,那些被解除反 馈调节的突变株可以选择性地生长,并在细胞内合成相应的氨基酸。变 株的菌落在生长过程把氨基酸分泌到培养基中,促使菌落周围敏感菌的 生长,形成一个混淆的增殖圈,挑取增殖圈大而明显的菌落,进一步试 验复证。 建库前的菌种的检定(大肠杆菌表达的工程菌菌种) 1、划种LB琼脂平板,应呈典型大肠杆菌集落形态,无其他杂菌生长, 2、涂片革兰氏染色,在光学显微镜下观察为典型的革兰氏阴性杆菌, 3、对抗生素的抗性,应与原始菌种相符,大多数为抗氨卡青霉素, 4、 电镜检查,应为典型大肠杆菌形态,无支原体、病毒样颗粒及其他微生 物污染。5、生化反应,应符合大肠杆菌生物学性状,6目的产物表达 量,在摇床中培养应不低于原始菌种的表达量,7、表达产物的类型, 用免疫学或合适方法证明型别无误,8、质粒检查,质粒的酶切图谱应 与原始质粒相符。 微生物细胞的破碎方法 化学法:1、自溶法,细胞膜结构在一定的条件下,由于细胞自体的各 种水解酶如蛋白酶、酯酶等的酶解作用而发生溶解,2、表面活性剂处 理法,常用十二烷基硫酸钠等阴离子表面活性剂,3、脂溶性溶剂处理 法:用丙酮、氯仿、甲苯等溶解细胞的脂蛋白,4、用低渗溶液,如氨 水、稀盐及含有少量有机溶剂的水溶液处理,是细胞膜胀破。物理法: 1机械磨碎法,2、加压破碎法,在55Mpa的高压下,急速喷射撞击挤 压。3超声破碎法,4反复冻融法。生物学的方法主要是采用酶解法 生物产品浓缩和干燥的方法 浓缩:1、减压干燥浓缩法,是通过降低液面的压力使液体沸点降低, 减压的真空度越高,沸点降得越低,蒸发越快。此法适用于一些不耐热 的生物大分子及生物制品的浓缩。2、吸收法,是通过一种吸收剂直接 吸收除去溶液中溶剂分子,是溶液浓缩的方法。使用的吸收剂必须与溶 液不起化学反应,对生物大分子不起吸附租用,易与溶液分开,吸收剂 除去溶剂后能反复使用(常用的是聚乙二醇)3、超滤法,是使用一种 特制的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法。通过超滤 法,蛋白质和酶的稀释液一般可浓缩到10%~50%浓度,回收率高达90%。 应用超滤法关键是在于滤膜的选择。干燥:1,真空干燥,适用于不耐 高温、易氧化的物质的干燥和保存,其原理与减压浓缩相同,真空度越 高,沸点降得越低,蒸发越快。2、冷冻真空干燥,又称为升华干燥, 除利用真空干燥的原理外,同时增加了温度因素。在相同压力下,水蒸 汽压力随温度的下降而下降,故在低温低压下,冰很容易升华为气体。 基因工程产品一般需检测的指标 1、鉴别试验, 2、外观,冷冻干燥制品应为白色薄壳疏松体。加入标量 蒸馏水后应迅速溶解为澄明液体,不得含有肉眼可见的不溶物,3、化 学检定4、pH值5、水分,一般冷冻干燥生物制品应不高于3%,6、效 价测定7、无菌试验8、异常毒性试验9、蛋白质含量,一般用Lowry法 测定10、比活性11、纯度,根据要求用电泳法和高效液相色谱法等12、 分子量,一般用还原型SDS—PAGA法13、外源性DNA法残留量,一般 用固相斑点杂交法,以地高辛标记的核酸探针法测定14、IgG残留量15、 宿主蛋白残量,一般用酶联免疫法测定16、残余抗生素活性17、细菌内 毒素含量18、等电点19、紫外光谱扫描20、肽图21、N—末端氨基酸序 列。 菌种衰退的原因,防止措施和保存方法 原因:1、基因突变--主要原因:有关基因发生负突变导致菌种衰退, 表型延迟造成菌种衰退,质粒脱落导致菌种衰退,2、连续传代--加 速衰退,3、不适宜的培养和保藏条件--加速衰退。防止措施:控制 传代次数,菌种经常纯化,创造良好的培养条件,利用不易衰退的细胞 移种传代,采用有效的菌种保藏方法,讲究菌种选育技术。保存方法: 斜面低温保藏法,石蜡油封藏法,砂土管保藏法,麸皮保藏法,甘油悬 液保藏法,冷冻真空干燥保藏法,液氮超低温保藏法,宿主保藏法

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