实验三-普通光学显微镜的使用方法及细菌的革兰氏染色法

实验三-普通光学显微镜的使用方法及细菌的革兰氏染色法

实验三普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色、革兰氏染色法

生科15.2 周罡201500181104

【实验目的】

1.复习光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。

2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。

3.掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能，了解球菌、杆菌、放线菌、酵母、真菌在光学显微镜下的基本形态特征。

4.学习并掌握微生物的制片及简单染色的基本要求。

5.学习并掌握革兰氏染色法。

6.了解革兰氏染色原理。

7.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。【实验原理】

（一）普通显微镜的基本原理

1.基本原理

现代普通光学显

微镜利用目镜和物镜

两组透镜系统来昂达

成像，故又称为复式显

微镜。它们包括机械部

分和光学部分两部分。机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。

显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的

乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。

2.油镜微生物学使用的显微镜的物镜通

常有低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×），油镜是三者中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与

物镜之间隔的不是一层空气（干燥系），而是一层油脂，称为“油浸系”。由于香柏油与玻璃的折光率相似（香柏油为1.515，玻璃为1.52）。镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气（折光率为1.0）而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰（见下图）

图2 介质为空气（A）与介质为香柏油（B）时

光线通过的比较

（二）简单染色的原理

细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对菌体进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构的方法叫做简单染色。此法操作简

便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

染色前必须固定细菌，其目的有二：

一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；

二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。

固定时尽量维持细胞原有的形态。

（三）革兰氏染色法的原理

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要

性状。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，

用Gˉ表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成

的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所

述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。复染液也是一种碱性染料，

其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G 和G-两大类群，常用的复染液是番红。

经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。

1）G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。

2）Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

【实验器材】

1.菌种

枯草芽孢杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，大肠杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，自选菌种两种。

2.溶液和试剂

草酸铵结晶紫染液，卢戈氏（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，无菌水，香柏油，二甲苯3.仪器和其他用品

普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），接种环，滴管【实验步骤】

（一）显微镜的使用方法

1.观察前的准备

（1）显微镜的安置：置显微镜于平整的实验台上，镜座距试验台边缘约10cm。

镜检时姿势要端正。

（2）光源调节：调节安装在镜座内的光源灯的电压获得适当的照明强度。

（3）根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜

2.显微观察

（1）低倍镜观察：将要观察的玻片标本置于载物台上，用标本夹夹住，移动推

进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10

×物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升

起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用

细调节器调节至图像清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。

（2）高倍镜观察：在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。

（3）油镜观察：在高倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心，将高倍镜转离工作位置，在待观察的样品区域上滴上一滴香柏油，将油镜转到工作位置，油镜镜头此时应正好浸泡在镜油中。调节照明使视野的亮度合适，微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。

3.显微镜用毕后的处理

（1）上升镜筒，取下载玻片。

（2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏

油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，

最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲

苯。

（3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。

（4）将各部分还原，将光源灯亮度调至最低后关闭，将最低放大倍数物

镜转到工作位置，同时将载物台降至最

低位置。

（二）细菌制片及简单染色

1.涂片

取一块载玻片，在玻片的一面用记号笔做好标记，在标记的一面上边用胶头滴管加一小滴无菌水，用接种环无菌操作分别由枯草芽孢杆菌营养琼脂斜面和金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面挑取适量菌苔，将沾有菌苔的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可。

2.干燥与固定

涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准。

3.染色

将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色1.5min。

4.水洗

倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止。

5.干燥

用吸水纸吸去多余水分后自然干燥，或将载玻片通过火焰2-3次。

6.镜检

将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。

（三）革兰氏染色

1.涂片

取一块载玻片，在玻片的一面用记号笔做好标记，在标记的一面上边用胶头滴管加几小滴无菌水，分别取5种活跃生长期菌种（金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，自选菌（1），自选菌（2））按常规方法涂片（不宜过厚）。

2.干燥与固定

涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准。

3.初染

滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1.5min后倾去染液，水洗至流出水无色。

4.媒染

先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。

5.脱色

先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s，立即用水冲洗。

6.复染

将载玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色1.5~2min，水洗，吸去残水晾干。

7.镜检

将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断枯草杆菌以及两种自选菌的

染色结果。【实验结果】

实验二+细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察

实验二细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察 1. 目的要求 （1）学习细菌涂片、染色的基本技术及无菌操作技术。 （2）掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征。 （3）了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 2. 基本原理 （1）简单染色法 用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观 察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细 菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 （2）革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为 两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类

物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现 红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革 兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或 附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。 脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱 色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不 同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色 的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 3. 材料及器材 (1) 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌 (2) 革兰氏染色液，载玻片，显微镜等 4. 方法与步骤 Ⅰ涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌 操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。 Ⅱ干燥室温自然干燥。 Ⅲ固定固定时通过火焰2～3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。

光学显微镜的结构与使用方法

光学显微镜的结构与使用方法 【目的要求】 1、熟悉光学显微镜的主要构造及其性能。 2、掌握低倍镜及高倍镜的使用方法。 3、初步掌握油镜的使用方法。 4、了解光学显微镜的维护方法。 【实验原理】 光学显微镜(light microscope)是生物科学和医学研究领域常用的仪器，它在细胞生物学、组织学、病理学、微生物学及其他有关学科的教学研究工作中有着极为广泛的用途，是研究人体及其他生物机体组织和细胞结构强有力的工具。 光学显微镜简称光镜，是利用光线照明使微小物体形成放大影像的仪器。目前使用的光镜种类繁多，外形和结构差别较大，有些类型的光镜有其特殊的用途，如暗视野显微镜、荧光显微镜、相差显微镜，倒置显微镜等，但其基本的构造和工作原理是相似的。一台普通光镜主要由机械系统和光学系统两部分构成，而光学系统则主要包括光源、反光镜、聚光器、物镜和目镜等部件。 光镜是如何使微小物体放大的呢？物镜和目镜的结构虽然比较复杂，但它们的作用都是相当于一个凸透镜，由于被检标本是放在物镜下方的1～2倍焦距之间的，上方形成一倒立的放大实相，该实相正好位于目镜的下焦点（焦平面）之内，目镜进一步将它放大成一个虚像，通过调焦可使虚像落在眼睛的明视距离处，在视网膜上形成一个直立的实像。显微镜中被放大的倒立虚像与视网膜上直立的实像是相吻合的，该虚像看起来好像在离眼睛25cm处。 分辨力是光镜的主要性能指示。所谓分辨力(resolving power)也称为辨率或分辨本领，是指显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能清楚地分辨被检物体细微结构最小间隔的能力，即分辨出标本上相互接近的两点间的最小距离的能力。据测定，人眼的分辨力约为100 μm。显微镜的分辨力由物镜的分辨力决定，物镜的分辨力就是显微镜的分辨力，而目镜与显微镜的分辨力无关。光镜的分辨力（R）（R值越小，分辨率越高）可以下式计算： 这里n为聚光镜与物镜之间介质的折射率（空气为1、油为1.5）； 为标本对物镜镜口张角的半角，sin的最大值为1； 为照明光源的波长（白光约为0.5m）。放大率或放大倍数是光镜性能的另一重要参数，一台显微镜的总放大倍数等于目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。 一、光学显微镜的基本构造及功能 （一）机械部分 1、镜筒：为安装在光镜最上方或镜臂前方的圆筒状结构，其上端装有目镜，下端与物镜转换器相连。根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式或双筒式两类。单筒光镜又分为直立式和倾斜式两种。而双筒式光镜的镜筒均为倾斜的。镜筒直立式光镜的目镜与物镜的中心线互成45度角，在其镜筒中装有能使光线折转45度的棱镜。

高中生物实验：普通光学显微镜的使用方法

高中生物实验：普通光学显微镜的使用方法 普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。 机械部分 镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。 镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。 镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。 镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。 物镜转换器(旋转器)：接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有3-4个圆孔，是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。 镜台(载物台)：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器(推片器)，推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标本作左右、前后方向的移动。 调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。 粗调节器(粗螺旋)：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快

速和较大辐度的升降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物象。 照明部分 装在镜台下方，包括反光镜，集光器。 反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。 集光器(聚光器)位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。 聚光镜：由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。 光学部分 目镜：装在镜筒的上端，通常备有2-3个，上面刻有5*、10*或15*符号以表示其放大倍数，一般装的是10*的目镜。 物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3-4个物镜，其中最短的刻有“10*”符号的为低倍镜，较长的刻有“40*”符号的为高倍镜，最长的刻有“100*”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。 在物镜上，还有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表：

实验2 细菌的芽孢染色和荚膜染色

实验二细菌的芽孢染色和荚膜染色 生物111班杨明轩1102040128 一、实验目的 1、学习并掌握细菌芽胞染色的原理和方法。 2、学习并掌握细菌荚膜染色的原理和方法。 二、实验原理 （一）细菌的芽孢染色 芽孢通常指某些细菌在生长后期于细胞内形成的一种圆形、椭圆形或圆柱形的、厚壁、折光性高、含水量极低而抗逆性极强的内生休眠体。 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染色剂亲合力不同的原理，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈现出不同的颜色而加以区别。芽孢通常具有厚而致密的壁，透性低，不易着色和脱色，当用着色力强的弱碱性染色剂孔雀绿在加热条件下染色师，芽孢和菌体同时着色，进入菌体的染色剂可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。经对比度大的复染液番红染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，呈绿色；而菌体被复染剂染成红色，易于区别。 （二）细菌的荚膜染色 荚膜是包围细菌细胞的一层粘液性物质，具有明确的外缘，牢固地附着在菌体细胞壁外；荚膜的主要成分是多糖，不易着色，其含水量高达90%以上，易变形。荚膜染色通常采用衬托染色法或称负染法，即将菌体和背景分别着色，从而把不着色且透明的荚膜给衬托出来。 三、实验材料 1、菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），26~28℃培养2~3天； 钾细菌（Bacillus mucilaginosus），点接于阿须贝平板上，26~28℃培养3天。 2、染色剂：孔雀绿染液、番红染液，石炭酸复红、墨汁（已过滤） 3、其他：载玻片、无菌水、洗瓶、擦镜纸、吸水纸、二甲苯、香柏油、接种用具 四、实验方法 （一）细菌的芽孢染色 1、制片：将枯草芽孢杆菌涂片、干燥固定。 2、染色：用吸水纸块盖住涂片处，然后在吸水纸张滴加孔雀绿染液至饱和。加热使染液微冒蒸汽后，保持5min。加热时应不断添加染液，不要使吸水纸干燥。 3、水洗：待玻片冷却后，用镊子除去吸水纸，再用水平轻轻冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 4、复染：用番红染液染色2~3min。 5、镜检：涂片干燥后，置油镜下观察。 6、清理：整理桌面，将显微镜恢复原样，将废片放入废片缸内。 （二）细菌的荚膜染色 1、制片：在洁净的载玻片的中央滴加1滴无菌水，取少许钾细菌制成涂片，在空气中风干。 2、染色：用石炭酸复红在涂片处染色4~5min，水洗，稍风干。 3、滴加一滴墨汁在载玻片的一侧，左手持此玻片，右手拿一干净玻片作推片用。将推片边缘凭证的一端与混合菌液成30°胶接触，顺势将菌液推开（不要太用力），使其涂成一薄层，并在空气中充分自然干燥。 4、镜检：玻片自然干燥后，置油镜下观察。

一显微镜的构造及使用方法

实验一显微镜的构造及使用方法 一、目的要求 1.了解显微镜的构造、性能及成像原理。 2.掌握显微镜的正确适用及维护方法。 二、实验器材 1.显微镜、纱布、绸布 2.酵母菌示教标本 三、普通光学显微镜简介 微生物的最显著的特点就是个体微小，必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态和细胞结构。熟悉显微镜并掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。 显微镜可分为电子显微镜和光学显微镜两大类。光学显微镜包括：明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜、立体显微镜等。其中明视野显微镜为最常用普通光学显微镜，其它显微镜都是在此基础上发展而来的，基本结构相同，只是在某些部分作了一些改变。明视野显微镜简称显微镜。 （一）显微镜的构造 普通光学显微镜的构造可以分为机械和光学系统两大部分。 图1-1 显微镜构造 1.目镜 2.镜筒 3. 转换器 4. 物镜 5. 载物台 6. 聚光器 7. 虹彩光圈 8. 聚光镜调节钮9.反光镜10. 底座11. 镜臂12. 标本片移动钮 13. 细调焦旋钮14. 粗调焦旋钮15.电源开关16.光亮调节钮17.光源 1.机械系统： （1）镜座Base：在显微镜的底部，呈马蹄形、长方形、三角形等。 （2）镜臂Arm：连接镜座和镜筒之间的部分，呈圆弧形，作为移动显微镜时的握持部分。 （3）镜筒Tube：位于镜臂上端的空心圆筒，是光线的通道。镜筒的上端可插入接目镜，下面可与转换器相连接。镜筒的长度一般为160mm。显微镜分为直筒式和斜筒式； 有单筒式的，也有双筒式的。 （4）旋转器Nosepiece：位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有3~4个孔，用于安

细菌芽孢染色

姓名班级13级生命基地班学号同组者： 科目微生物学实验题目细菌芽胞染色组别3 【实验题目】 细菌芽孢染色 【实验目的】 1.学习并掌握芽孢染色法 2.了解芽孢的形态特征 【实验器材】 1、菌种： 枯草芽孢杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、梭状芽胞杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。 2、溶液和试剂： a) 5％孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、无菌水 b) 香柏油、二甲苯 3、仪器及其它用品： 普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、试管夹等 【实验原理】 芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆形或椭圆形。在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。是否产生芽孢，以及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。 与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚而致密，通透性低，不易着色，但是，芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进入芽孢，水洗脱色时，菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍保留。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。 【实验内容及步骤】 2、具体步骤： 1)洗片、干燥 取一块载玻片，用水浸湿，用手使用去污粉洗净玻片，竖立在一边自然干燥。干燥后在玻片的一面用记号笔做好标记。方便以后水洗染料，避免洗去细菌。 2)涂片 取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多） 3)加热固定

练习使用光学显微镜

练习使用光学显微镜 蔡清柑 1、教学目标 ①知识目标：正确说明显微镜的结构与功能 ②能力目标：能独立、规范地使用显微镜，能观察到清晰的物像；在认识、使用显微镜的过程中发现问题，并尝试解决问题； ③情感目标：认同显微镜的规范操作方法，养成爱护显微镜的习惯，初步形成实事求是的科学态度。 2、教学重点、难点的分析： ①教学重点显微镜的使用方法。 ②教学难点规范使用显微镜，并观察到物象。 3、课前准备 教师：准备显微镜，并逐个检查（准备两个不同倍数的目镜）；两种标本（写有“上”字的玻片；永久装片），纱布，显微镜的使用课件；课前每班培训几名学生，以便课上帮助教师辅导其他学生。 4、教学程序 4.1导入新课复习显微镜的结构名称及其用途。（让学生指着显微镜说出结构名称及其用途）（展示图片：细胞图）让学生了解细胞非常小（提示图中物象之所以看的很清楚是被放大了百倍以上）而且形状各异。应该要会使用显微镜。 4.2新课过程 1、认识材料和用具引导学生观察实验桌上显微镜、玻片标本、擦镜纸、纱布等。

2、取镜和安放右手握，左手托；略偏左，安目镜。指导学生看书35页及课件展示：取镜和安放。强调安放目镜时，手指不要触摸镜头，对学生进行爱护显微镜的教育。 3、显微镜的构造学生四人一组，看书对照实物回顾显微镜各部分名称。 4、显微镜的使用教师对学生的回答进行鼓励，引出显微镜的使用。介绍两种观察标本： （1）写有“上”字的玻片；（2）永久装片 5、对光要求学生先看书，然后指导学生动手观察。按照先看到一个白亮的视野→放入标本→-看到清晰像的顺序。 （1）低倍物镜对准通光孔。（2）左眼看，右眼睁。（注：两眼都睁开）（3）转动反光镜，看到明亮视野。（注：双手转动反光镜） 6、观察学生边看书或课件展示自学边操作显微镜进行观察。 （1）标本放在载物台上，压住，正对通光孔。 （2）镜筒先下降，直到接近标本。 （3）左眼注视目镜，使镜筒缓缓上升，直到看清物像。 7、强调 ⑴用低倍物镜（4×，即最短的物镜）对准通光孔。 ⑵转动转换器的手法要正确，对学生进行爱护显微镜的教育。 ⑶镜筒先下降后上升，镜筒下降时，眼睛一定要看着物镜，以免压碎标本。 ⑷左眼看目镜，右眼睁开是为了画图。引导学生继续观察。 8、讨论并回答问题： ⑴视野中“上”字是否倒置，其物像比实际大小放大了多少倍？ ⑵若视野中“上”字位于左上方，怎样操作才能将其移至视野中央？ ⑶物像放大倍数越大，视野会越暗还是越亮？ ⑷物像放大倍数越大，视野中看到的细胞数目越多还是越少？

实验四 细菌的芽孢染色

实验四细菌的芽孢染色 生物112 周泓兆1102040226 一、目的 学习并掌握细菌芽孢染色的原理及方法。 二、原理 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染色剂亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而加以区别。芽孢具有厚而致密的壁，因此想要将芽孢染色需要在较高的温度（煮沸）的条件下，用强染色剂（孔雀绿）将菌体和芽孢同时染色。而同时，实验利用了孔雀绿可经水洗脱色的特点，通过水洗将菌体的着色洗脱，而芽孢因具有致密的壁而不会被水将染色洗脱。接下来用番红染色，将菌体染为红色，而在常温下品红无法将芽孢着色，因此在显微镜下形成了芽孢为绿色而菌体为红色的现象。而实验中如果要观察芽孢在菌体中的着生位置，一定要根据各菌的特点来确定培养时间。 三、材料 1.菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），26℃-28℃，培养2-3天。 2.染色剂：孔雀绿染液，番红染液。 3.其它：载玻片，无菌水，洗瓶，酒精棉球，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，接种环，酒精灯，镊子。 四、实验步骤 1.制片：将枯草芽孢杆菌涂片并干燥固定。 2.染色：撕取一块比载玻片略窄的吸水纸，覆盖在涂片出，在吸水纸上滴加孔雀绿直至饱和。用酒精灯加热是染液保持微沸，其间不断添加适量孔雀绿染液，保持吸水纸湿润，染色5min。 3.水洗：待玻片冷却后，用镊子出去吸水纸，再用水瓶轻轻冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 4.复染：用番红染液染色1-2分钟，水洗。 5.镜检：涂片干燥后，滴加香柏油置于油镜下观察。 6.清理：用二甲苯与干净擦镜纸擦净镜头，将涂片放入废片缸，将固体垃圾放入垃圾桶，液体垃圾倒入废液缸，无腐蚀性毒性液体可倒入下水道，用酒精棉球擦洗器材将溅出的染料擦除。 五、结果与讨论： 这个实验成功率很高，主要原因是步骤简单，染色效果明显而且影响因素少，洗脱时间对结果影响要比革兰氏染色中酒精脱色时间的影响小很多。最后结果的小遗憾是孔雀绿绿色的着色较浅，我觉得可以通过适当增加涂片的菌体密度和增加染液煮沸时间，可能会获得更好地效果。 六、思考题： 1.为什么在孔雀绿加热染色时，要待玻片冷却后才能冲洗？ 答：我推测的原因如下：①菌体在突然遇冷之后会变形甚至破裂，影响观察。②在沸腾的情况下染料能更方便地进入芽孢，那么高温下染料也应该更容易从芽孢中被洗出，所以等到冷却使得孔雀绿尽可能留在芽孢内。③防止载玻片在高温下突然遇冷而炸裂。

微生物的革兰氏染色实验报告

微生物的革兰氏染色 一、实验目的： 1、学习并初步掌握革兰氏染色法； 2、了解革兰氏染色的原理； 3、巩固显微镜的使用。 二、实验原理： 革兰氏染色是细菌学中最重要的鉴别染色法。染色步骤分为四个部分： 1、初染：加入碱性染料结晶紫固定细菌图片； 2、媒染：加入碘液，碘与结晶紫形成一种不溶于水的复合物； 3、脱色：利用有机溶剂乙醇或丙酮进行脱色； 4、复染：复红配成碳酸复红作为复染剂。 成分占细胞壁干重的% 革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌肽聚糖含量很高（50~90）含量很低（~10） 磷壁酸含量较高（<50）无 类脂质一般无（<2）含量较高（~20） 蛋白质无含量较高G-和G+细胞壁的比较： 1、阳性（G+）菌细胞壁特点：细胞壁厚，只有一层，主要由肽聚糖构成，肽聚糖含量高，结构紧密，脂类含量低。当乙醇脱色时，细胞壁肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫和碘的复合物被保留在细胞壁内，复染后仍显紫色（如芽孢杆菌）。 2、阴性（G-）菌细胞壁特点：细胞壁薄，由两层构成，内壁层和外壁层，细胞壁中脂类中脂类物质含量较高，肽聚糖含量较低，网状结构交联程度低，乙醇脱色时溶解了脂类物质，通透性增强，结晶紫与碘的复合物易被乙醇抽提出来，因此，革兰氏阴性菌细胞被脱色，当复染时，脱掉紫色的细胞的细胞壁又着上红色（例如大肠杆菌）。 三、实验步骤： 1、取一个载玻片，将其洗净并沿一个方向擦拭干净，直至液体不再其上收缩为止；将接种环整平，用灼烧过的接种环在混匀的菌种中取菌，按常规方法图片，应涂大，不宜过厚。 2、将涂片用火焰固定，不宜烤得太狠，否则菌种呈假阳性。 3、滴加1滴结晶紫染液，染色1min，水洗。 4、滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗 5、滴加脱色乙醇，脱色30~40s，不宜脱色太狠，否则菌种呈假阴性。 6、水洗，滴加番红复染液，复染1min，水洗，晾干 7、镜检并拍照。 四、注意事项： 1、选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。 2、涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 3、脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。实验结果与讨论： 1、结果： 高倍镜下观察的菌体图像：

细菌放线菌的观察与革兰氏染色实验报告

实验一：细菌、放线菌的形态 观察与革兰氏染色 姓名:陈虹邑 学号：200911233012 系别：生物科学与生物技术 班级：周二第一组 试验日期：2011年9月13日 同组成员：邢悦婷呼波

一、实验目的及意义 1、巩固油镜的使用; 2、掌握细菌形态观察的基本方法； 3、了解细菌的基本形态和结构。 4、了解革兰氏染色的原理； 5、初步掌握细菌涂片的方法； 6、掌握革兰氏染色的方法； 7、掌握放线菌的涂片方法； 8、观察基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。 二、实验材料与方法 【实验材料】 菌种：溶血链球菌(Strptococcus haemolyticus),螺菌(Spirillum sp.) ,巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium), 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis), 普通变形菌(Proteus vulgaris), 丙酮丁酸梭菌(Clostridium acetotylicum), 褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)等细菌永久装片，放线菌5406，金黄色葡萄球菌 （staphulococcus aureus），大肠杆菌（E. coli） 试剂：香柏油、无菌水、结晶紫、番红或沙黄、95%酒精、碘液 仪器及用具：显微镜、擦镜纸、吸水纸、小滴管，接种环、载玻片、盖玻片、酒精灯 【实验方法】 细菌的观察 1、在载玻片上滴一小滴水，用接种环，采用无菌操作，将细菌挑起，涂到载玻片 上，盖上盖玻片。 2、用显微镜对细菌进行活体观察。观察时先用低倍镜，再用高倍镜，有必要的话， 再用油镜观察。 3、观察细菌的永久装片，观察时先用低倍镜，再用高倍镜，有必要的话，再用油 镜观察，找到细菌的各种结构。

实验五 细菌芽孢染色法

细菌的芽孢染色法 09级生命基地林剑锋（200900140065） 周三下午第四排 摘要 细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置，芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。通过芽孢染色和复染色，使细菌的菌体和芽孢呈现不同颜色，在显微镜下，我们就能够跟容易观察到芽孢，并对其特征进行识别，从而达到区分菌种甚至鉴定菌种的目的。 关键词 芽孢Schaeffer-Fulton氏染色法梭状芽孢 前言 芽孢又叫内生孢子（endospore），是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。由于芽孢壁厚、透性低上不易着色，当用石炭酸，番红，结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颇色，很难观察。 1．实验材料与方法 1.1 实验材料 枯草芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌（Clostridium Prazmowski），5%孔雀绿，0.5%番红，酒精灯，酒精，木夹，香柏油，二甲苯。 1.2实验方法 1.2.1 ．制片 按常规涂片、下燥、固定。 1.2.2 ．染色 加数滴5%孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸汽并开始计时。维持5min。加热过程中及时补充染液。切勿让涂片干涸。 1.2.3 ．水洗 待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水无色为止。 1.2.4 ．复染 用0.5%番红染液复染2min 。 1.2.5 水洗 用缓流水洗后，吸干。 1.2.6 ．镜检 先低倍镜，再高倍镜，最后油镜观察。

2．实验结果与分析 2.1 实验结果 芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。枯草芽孢杆菌芽孢呈椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，菌体基本无大变化；梭状芽孢杆菌芽胞呈圆形，比菌体粗，位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状。 图一枯草芽孢杆菌芽孢染色（x~400）图二梭状芽孢杆菌芽孢染色（x~400） 2.2 实验分析 由于芽孢壁厚、透性低上不易着色，当用番红、结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圈。但是用着色力强的染色剂孔雀绿，在加热条件下染色，使染料不仅进人菌体也可进人芽孢内，进人菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经染色便难以被水洗脱。当用对比度大的复染色剂番红染色后，芽孢仍保留初染剂孔雀绿的绿色，而菌体和芽孢囊被染成复染色剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。 3．实验小结 此次芽孢染色实验，首先，收获到的当然是芽孢的染色方法。其次，对芽孢有了一个系统的认识。芽孢不仅仅是生物的休眠体而已。芽孢的各种特性还是进行生物物种鉴定和分析的重要依据。对细菌的芽孢的描述方法也有了一定的了解。 参考文献 【1】詹火元生物学通报1995年底30卷第2期p34 【2】沈萍，陈向东.微生物学.第二版.北京:高等教育出版社，2006 【3】沈萍，陈向东.微生物学实验.第4 版.北京:高等教育出版社，2007 【4】Madigan, MT; Martinko J, Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th ed.). Lippincott Williams & Wilkins ISBN 0-13-066271-2.

微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色

微生实验报告 姓名： xx 专业年级：2011级生物技术 学号：1032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔

径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种： 金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂： 草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚： 乙醇=7:3），xx柏油。 3、器材： 废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。 四、实验方法 （一）简单染色 1．涂片： 取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干： 让涂片自然晾干。 3．固定：

试验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色

实验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色普通光学显微镜的使用 一、实验目的 以染色玻片及活菌为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。 二、显微镜油镜使用的原理 1 普通光学显微镜的基本构造 （1）光学部分: 接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。它使检视物放大, 造成物象。（2）机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。2 显微镜的放大倍数和分辨率（1）放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 （2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为： D=λ/2n·sin(α/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 λ：可见光的波长（平均0.55μm） n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 a：镜口角（即入射角）。3 油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 三、实验材料 1 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、盖玻片、接种环、酒精灯等。 2 细菌三种形态的玻片染色标本。 3 培养12-18h的枯草芽孢杆菌。四、实验方法与步骤 1 染色细菌玻片的油镜观查 （1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 （2）调节光亮度。 （3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。

（4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。 （5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 （6）绘出所观察到的细菌形态图像。 （7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。 （8）、用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去油镜头上的香柏油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。 2 活菌制片观察 取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养12-18h的枯草芽孢杆菌一小环，在水滴上反复涂抹至菌体充分分散，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分，按照油镜的使用步骤，观察草芽孢杆菌形态，边观察边绘图。 五、实验报告 油镜使用的原理 六、思考题 1 油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 2 使用油镜时，为什么必须用镜头油？ 3 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？ 七、实验注意事项 1 不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2 镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。 3 观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4 观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。 5 拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 6 显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。 细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 1 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法及革兰氏染色。 2 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、实验原理 1 简单染色的原理

细菌芽孢染色

微生物学实验报告 题目：细菌芽孢染色 姓名：学号：组别：年级班级： 同组者：时间： 【实验器材】 1．菌种：枯草芽孢杆菌。 2．染色剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液 3．仪器、材料：二甲苯、香柏油、蒸馏水、95%乙醇、显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸。 【实验目的】 1．学习并掌握细菌的芽胞染色法，初步了解芽孢杆菌的形态特征。 2．巩固显微操作技术及无菌操作技术。 【基本原理】 芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子(endospore)，通常为圆形或椭圆形。是否产生芽孢及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，但是，芽孢一旦被着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿或石碳酸复红）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进如芽孢，水洗脱色时菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍然保留。再用对比度大的复染剂染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样可将两者区别开来。 【操作步骤】 1．制片。 按常规方法涂片、干燥及固定。 2．加热染色。 向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。3．脱色。 待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。 4．复染。 用0.5%番红水溶液复染2min。 5．水洗。 用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。 6．镜检。 将载玻片晾干后油镜镜检。 【实验结果】

实验二 革兰氏染色法

实验二革兰氏染色法 【实验目的】 1.学习并初步掌握革兰氏染色法。 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 3.巩固显微镜油镜的使用方法。 【实验仪器、材料】 1.菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌菌液。 2.染色剂：革兰氏染色试剂盒（结晶紫染色液、碘液、脱色液（95%乙醇）、复红染液）。 3.仪器及其他物品： 显微镜、香柏油、无水乙醇、载玻片、擦镜纸、滤纸、酒精灯、试管架、废液缸、记号笔、接种环、镊子、打火机等。 【实验内容】 革兰氏染色法 一、染色标本制备 1.涂片取一张洁净的载玻片，滴加少许生理盐水，用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，与生理盐水研磨均匀，做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。（事先在载玻片的反面滴加菌液的相应位置做好标记） 2.干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥。(温度不宜过高) 3.固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常

用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 二、染色 l.初染滴加结晶紫覆盖菌膜，染lmin，自来水缓缓冲洗，甩去积水。 2.媒染滴加卢氏碘液，染lmin，水洗，甩去积水。 3.脱色滴加95%乙醇数滴，20s~30s，见紫色脱下立即用水冲洗，甩去积水。 4.复染滴加石炭酸复红液，染lmin，水洗，甩去积水，标本片用滤纸吸干。 三、镜检 待染色片充分干燥后，用油镜观察。 【实验结果】 葡萄球菌呈葡萄状排列，呈紫色，为革兰氏阳性菌； 大肠杆菌为散在的短小杆菌，呈红色，为革兰氏阴性菌。 注：绘图展示染色结果 【结果分析、讨论（结论与评价）】 注：分析你的染色结果是否正确？如果不正确，请分析原因。

实验四.细菌芽孢染色

实验四.细菌芽孢染色 一. 目的要求： 目的：掌握细菌芽孢染色方法 内容：１．学习并掌握芽孢染色法 ２．初步了解芽孢杆菌的形态特征 二. 基本原理： 芽孢壁厚，透性低，着色脱色较困难。因此先用着色力较强的孔雀绿，在加热的条件下染色，使染料不仅进入菌体也可以进入芽孢内，进入菌体内的染料经水洗脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂（如沙黄、番红、碱性复红）染色后，芽孢仍保留初染色剂的颜色，此时菌体被染成红色，芽孢呈绿色。 三. 器材 1.菌种：培养了16-20小时左右的枯草杆菌（37℃） 2.染色剂：5%的孔雀绿水溶液.0.5%番红水溶液石炭酸复红染液 0.05%碱性复红蒸馏水 3.仪器或其他用品：小试管.滴管.烧杯.试管架.载玻片.木夹子.显微镜等 二甲苯.香柏油 四. 操作步骤： 一）方法1： 1.取37℃培养了18-24小时的枯草杆菌作涂片，并干燥固定。 2.于载玻片上滴入3-5滴5%孔雀绿水溶液 3.用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计时约5min ,加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料 4.倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 5.用0.5%的番红溶液（或0.5%沙黄水溶液或0.05%碱性复红）复染2分钟，水洗. 6.制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体呈红色。 二）方法2： 1.加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环培养16—20小时的枯草杆菌于试管中，充分混匀打散，制成弄的菌悬液。 2.加5%的孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。 3.将此试管浸于沸水浴中，加热20-30min . 4.用接种环从试管底部挑取数环欲洁净的载玻片上，并涂布均匀，将玻片通过微火3次固定。 5.水洗至流出的水中无孔雀绿颜色为止。 6.加复染液染2-3分钟，水洗。 7.干燥后用油镜观察，芽孢绿色，菌体红色。 五.实验报告： 1.绘图：枯草杆菌的芽孢形态，芽孢的着色位置。 2.芽孢染色的操作要点？ 资料介绍： 1、菌种培养：37℃、18-24小时为宜。 2、染色剂的配制： A.5%的孔雀绿水溶液 孔雀绿 5g 蒸馏水 100ml

零基础光学显微镜使用方法

零基础光学显微镜使用方法 编撰：杨历佳 我在本文中主要介绍的内容有：光学显微镜的组成、各部件的作用和原理、具体的操作方法及注意事项、保养和清洁。 普通光学显微镜按物镜放大倍数可以分10倍、40倍和100倍等。根据微生物等样本的大小,选择不同的放大倍数。例如要观察真菌（如酵母菌等）10×10就可以看的很清楚；如果要观察细菌的话至少要用到10×40；想要看的更为清楚就要用100倍的油镜来看，使用油镜时需要滴加香柏油。一般的镜检用400倍（10×40）基本上就足够了。 光学显微镜的组成结构 光学显微镜主要包括：物镜、目镜、反光镜、粗/细准焦螺旋、遮光器、盖玻片和载玻片等部件。如图：

1、物镜： 显微镜的放大作用主要取决于物镜，是显微镜最重要的光学部件，利用光线使被检物体第一次成像。物镜质量的好坏直接影响显微镜映像质量，它是决定显微镜的分辨率和成像清晰程度的主要部件。所以对物镜的质量和校正很重要，它是衡量一台显微镜质量的首要标准。 物镜刻有“10×”符号的为低倍镜，刻有“40×”符号的为高倍镜，刻有“100×”符号的为油镜。 以40×物镜为例，物镜上的数字分别为：40/0.65和160(∞)/0.17 （1）40表示物镜的放大倍数：放大倍数是指眼睛看到的像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。例:放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后，像的长度是100μm。要是以面积计算，则放大了10，000倍。显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积； （2）0.65为数值孔径（mm），数值孔径越大，样本观察的分辨率和放大率越大，视场宽度与工作距离越小。 数值孔径的定义是：物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（u）半数的正弦之乘积。 （3）160为镜筒长度（mm），∞指无穷大。机械镜筒长（镜筒长度）是指从物镜的安装定位处到显微镜镜筒上端面的距离，标准定为160mm； （4）0.17为所需盖玻片的标准厚度单位（mm）； 工作距离（物距）： 样本调准焦点时，物镜前端与试样或盖玻片顶面的距离。 10倍物镜有效工作距离为6.5mm，40倍物镜有效工作距离为0.48mm。

微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色

微生实验报告 姓名：王晶晖 专业年级：2011级生物技术 学号：040312011032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种：金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂：草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚：乙醇=7:3），香柏油。 3、器材：废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。 四、实验方法 （一）简单染色 1．涂片：取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干：让涂片自然晾干。 3．固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰（通常2~3次）固定（具体温度以不烫手为宜）。 4．染色：将固定过的涂片加复红染色1~2min 5．水洗：用水洗去涂片上的染色液。 6．干燥：将吸过地涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 7．镜检：先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上滴加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌形态。 （二）革兰氏染色