354671_pug BD matrigel Protocol(Gelatin Collagenase)
BD BioCoat? Matrigel? Matrix 6-well Plates for
Embryonic Stem (ES) Cell Culture
Catalog Number 354671
Guidelines for Use
FOR RESEARCH USE ONLY
NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES
BD Biosciences – Discovery Labware
Two Oak Park, Bedford, MA 01730, tel: 877.232.8995, fax: 800.325.9637, https://www.sodocs.net/doc/793474831.html,
TABLE OF CONTENTS
Intended Use (2)
Materials Provided (2)
Quality Control (2)
Materials Required But Not Supplied (2)
Related BD Products, Not Supplied (3)
Precautions (3)
Procedure for Use (3)
1.0 Flow chart of procedures (Figure 1) (4)
2.0 Preparation of solutions (5)
2.0 Generating mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder- conditioned media (6)
3.0 Culturing human ES cells on BD BioCoat? Matrigel? Matrix 6-well Plates
for ES cell culture (6)
4.0 Dissociating human ES cells from BD BioCoat? Matrigel? Matrix 6-well
Plates for ES cell culture (7)
5.0 Embryoid body formation (7)
6.0 Immunohistochemical detection of cell surface markers (8)
General Guidelines for Use (9)
Stability (9)
Customer and Technical Service (9)
References (10)
INTENDED USE
BD Matrigel? Matrix has been used extensively as a substrate for culturing human embryonic stem (ES) cells with various conditioned or defined media.(1-10)
BD BioCoat?Matrigel? Matrix 6-well Plates for ES Cell Culture provides an optimized surface for culturing human ES cells while maintaining their ability for self-renewal and pluripotency. It is recommended that cells on BD BioCoat Matrigel Matrix 6-well plates for ES cell culture be cultured using mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder-conditioned media (MEF-CM) supplemented with 8 ng/mL BD? basic fibroblast growth factor (bFGF; BD Cat #354060).
This product is FOR RESEARCH USE ONLY; NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.
MATERIALS PROVIDED
Catalog No. 354671
?BD BioCoat Matrigel Matrix 6-well Plates for ES Cell Culture. Comprised of 5 lidded BD Falcon? 6 well plates coated with BD Matrigel Matrix.
QUALITY CONTROL
?Each lot of BD BioCoat Matrigel Matrix 6-well Plate for ES cell culture is tested for the amount of functional proteins coated onto the surface of each well to ensure lot-to-lot
consistency.
?Functional performance has been validated by culturing undifferentiated human ES cells (H9, H14, or H1 from WiCell Institute) in combination with MEF-CM supplemented with 8 ng/mL BD bFGF (this is not a release criteria).
?Tested and found negative for bacteria and fungi.
MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
?MEF feeder cells isolated from CF-1 mouse strain (inactivated through irradiation or mitomycin C-treatment; ATCC Cat # SCRC 1040.1 or SCRC1040.2 respectively).
?Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)
? Gelatin
?Fibroblast culture media components
?DMEM media (Invitrogen, Cat # 11965-092)
?L-Glutamine 200 mM
?Non-essential Amino Acids
?Fetal Bovine Serum (FBS) – Heat inactivated by heating to 56o C for 30 minutes.
?human ES cell culture and media components
?DMEM/F12 medium (Invitrogen, Cat # 113330-032)
?KnockOut? Serum Replacement (Invitrogen, Cat # 108280-028)
?MEM-Non-essential amino acids (10mM)
?L-Glutamine (200mM)
?2-Mercaptoethanol
RELATED BD PRODUCTS, NOT SUPPLIED
? BD? Dispase, Cat # 354235 (may be used as an alternative to collagenase Type IV for human ES cell dissociation)
? BD? Human basic FGF, Cat # 354060
? BD Falcon? 6-well Tissue Culture-treated plate, Cat # 353046
? BD? Delipidized BSA, Cat # 354331
PRECAUTIONS
a.)Storage: BD BioCoat? Matrigel? Matrix 6-well plates for ES cell culture should be
stored at -20°C in the original packaging in order to guarantee shelf life. All plates
should be used once the package is opened and thawed. DO NOT THAW AND RE-FREEZE PLATES. Aseptically remove desired number of plates from packet, re-seal the remaining plates in packet with tape and store at -20o C PROMPTLY (within 5
minutes). Use the re-packaged plates within two weeks.
b.)All procedures should be performed under aseptic conditions.
California Proposition 65 Notice
WARNING: This product contains a chemical known to the state of California to cause cancer. Component: Chloroform
PROCEDURE FOR USE
The following procedure is optimized for culturing human ES cells initially grown on MEF feeder layers or on BD BioCoat Matrigel 6-well plates for ES cell culture. Results may vary depending upon the cell line used, the type of feeder cells used and the specific conditions and health of the cells to be plated (e.g. media, state of differentiation, dissociation technique, etc.). You should optimize conditions for your own system.
Figure1. Steps involved in culturing human ES cells on BD BioCoat? Matrigel? 6-well plates for ES cell culture?.
Thaw MEFs
(Day 1)
?NOTE: BD BioCoat? Matrigel? 6-well plates for ES cell culture (Cat# 354671) are specifically developed for culturing ES cells and are distinct from other BD BioCoat?Matrigel? Matrix 6-well plates (Cat# 354432 & 354603).
1.0Preparation of solutions
1.1Preparation of 0.1% Gelatin Solution (for 500 ml)
1.1.1Add 0.5 g of gelatin to 500 mL of tissue culture grade endotoxin-free
ddH2O. Gelatin will not dissolve completely in water. Autoclave to
dissolve gelatin and sterilize the solution. Once solution has cooled,
store at 4o C.
1.2Preparation of human bFGF
1.2.1 Dissolve 10 μg of bFGF in 1 mL of PBS containing 0.2% BSA. Aliquot
and store at -20o C.
1.3Preparation Collagenase IV (200 units/mL)
1.3.1Dissolve 20,000 units of collagenase IV in 100 mL of DMEM (final
concentration of 1 mg/mL). Filter sterilize, aliquot in 5-10 mL/tubes and
store at -20o C.
NOTE: BD? Dispase can be substituted for collagenase IV
(recommended concentration for BD Dispase is 1.0 to 1.25 units/mL
DMEM/F-12).
1.4Preparation of MEF medium (500 mL)
1.4.1To 440 mL DMEM medium, add 5 mL of non-essential amino acids, 5 mL
of L-glutamine, and 50 mL of heat-inactivated FBS. Filter, and store at
4o C.
1.5Preparation of human ES cell medium (100 mL)
1.5.1To 80 mL of DMEM/F12 medium, add 20 mL of KnockOut? serum
replacement (20%), 1 mL of non-essential amino acids, 0.5 mL of L-
glutamine and β-mercaptoethanol (0.1 mM final concentration) and 100
μL bFGF (10 ng/mL). Filter, and store at 4o C for up to 2 weeks.
1.6Preparation of Embryoid Body Formation medium (100 mL)
1.6.1To 78 mL of DMEM/F12, add 20 mL FBS (not heat-inactivated), 1 mL
non-essential amino acids, 1 mL L-glutamine and β-mercaptoethanol
(0.1 mM final concentration). Filter and store at 4o C for up to 1 month. 2.0Generating MEF-conditioned media (MEF-CM)
2.1 Thawing inactivated MEF feeder cells
2.1.1 Gelatin coat plates or flask by adding 2 mL of 0.1% gelatin solution to
each well of the 6 well plate (10 mL for T75 and 20 mL for T175 flasks)
and incubate at room temperature for 1 hour or overnight.
2.1.2 Aspirate off gelatin immediately prior to plating MEF feeder cells.
2.1.3 Thaw a vial of MEF by immersing it in a 37o C water bath without
submerging the vial below the O-ring on the cap. Spray the vial with
70% ethanol and wipe it dry with a clean Kimwipe?.
2.1.4 Transfer contents of the vial into a sterile 15 mL conical tube in a tissue
culture hood where the rest of the procedures will be performed
aseptically. Add 10 mL of pre-warmed MEF media drop-wise, swirling
the contents gently as you add.
2.1.5 Centrifuge at 1000 rpm for 5 minutes and discard supernatant. Re-
suspend cell pellet in MEF media (0.75 x 105 cells/mL) and add 2.5 mL of
cell suspension to each gelatinized well of 6 well plates (or 20 mL/T75,
45 mL/T175). Make sure cells are spread evenly in the wells or flask and
incubate overnight in 5% CO2 and humidified air at 37o C.
2.2 Collect MEF-CM media for culturing human ES cells
2.2.1 After MEF feeders have been incubated overnight, aspirate off
MEF medium and wash once with 2 mL of PBS.
2.2.2 Add 3 ml of human ES cell medium supplemented with 10 ng/mL
of bFGF to each well (24ml/T-75, 50ml/T-175) and incubate
overnight.
2.2.3 Following 24 hour incubation with MEF feeder cells, collect MEF-
CM, add 8 ng/mL of bFGF, filter and use immediately for culturing
human ES cell cells on BD BioCoat? Matrigel? Matrix 6-well
plates for ES cell culture.
NOTE: MEF-CM can be stored for up to 7 days at 4o C and up to
2 months at -20o C. Supplement stored MEF-CM with 8 ng/mL
bFGF and filter immediately prior to use.
3.0Dissociation and plating of human ES cells on BD BioCoat Matrigel 6-well
plates for ES cell culture
3.1Add pre-warmed MEF-CM (2mL/well) supplemented with 8 ng/mL bFGF to BD
BioCoat Matrigel 6-well plates for ES cell culture and place the plates in a 37o C
incubator with 5% CO2 and humidified air.
3.2Aspirate medium from wells containing human ES cells to be dissociated (cultured
on MEF feeders or BD BioCoat? Matrigel? 6-well plates for ES cell culture).Wash
once briefly with 2 mL PBS and aspirate.
3.3Treat human ES cells to be dissociated with 200 units/mL of collagenase IV or
dispase (1 – 1.25 units/mL) for 6-8 minutes at 37o C, or until the edges of the colony
start to curl up when observed under the microscope.
3.4Aspirate collagenase IV or dispase and wash once gently with 2 mL of MEF-CM.
After wash, add another 2 mL of MEF-CM per well.
3.5Practicing proper aseptic technique, and using a sterile fine pipette tip, gently
break-up and scrape the colonies using small circular motions. Start at the outside
edge of the colony and work your way towards the middle. Try to cut as many
small pieces as possible. This is easiest to do while viewing the process using a
phase contrast microscope (2x or 4x objective).
3.6Gently triturate cell clumps a few times by pipetting up and down (do not make a
single cell suspension). Distribute 0.5 mL of cell suspension to each well on BD
BioCoat Matrigel 6-well plates for ES cell culture containing pre-warmed MEF-CM
and place plates in incubator. As a rough guideline, split cells at a 1:3 to 1:6 ratio.
NOTE: it is important not to swirl contents of plate as this will result in colonies
crowding in the center of the plate. Gently rock the plate side to side and back and
forth just prior to placing into incubator to evenly distribute the cell clumps on the
plate surface.
4.0Maintenance of human ES cells
NOTE: Following dissociation of human ES cells, the cultures should be left undisturbed
for the next day (Day 2). Start changing media from Day 3 after plating cells.
4.1Aspirate spent media from BD BioCoat Matrigel 6-well plates for ES cell culture and
add 2.5 to 3 mL or pre-warmed and sterile-filtered MEF-CM supplemented with 8
ng/mL bFGF.
4.2 Change media on human ES cell cultures everyday from Day 3 to Day 7. Monitor
colonies to ensure that they are mostly undifferentiated.
4.2Cells will typically require passaging on Day 6 to 8.
5.0Immunohistochemical detection of cell surface markers
5.1 Wash the cells twice with 2 mL of PBS.
5.2 Fix the cells with 1 mL of 4% paraformaldehyde for 20 minutes at room
temperature.
5.3 Wash the cells twice with 2 mL of PBS for 5 minutes.
5.4 Block the cells with 1 mL of 0.1% BSA, 10% normal goat serum* in PBS at room
temperature for 45 minutes.
5.5 During the blocking step, prepare the primary antibody working solution with PBS
containing 1% BSA and 10% normal goat serum* to a final desired concentration.
5.6 After blocking, incubate the cells with 1 mL/well of diluted primary antibody working
solution overnight at 2 - 8° C.
5.7 Wash the cells three times with 2 mL of PBS containing 1% BSA for 5 minutes
each.
5.8 Dilute the secondary antibody (fluorescence-conjugated) in PBS containing 1%
BSA. Incubate the cells with secondary antibody at 1 mL per well for 60 minutes at
room temperature in the dark.
5.9 Wash the cells three times with 2 mL of PBS containing 1% BSA for 5 minutes
each.
5.10 Cover the cells with 4 mL of PBS and visualize with a fluorescence microscope.
Label, date and store plates wrapped in aluminum foil at 4o C.
* Substitute normal serum from appropriate species depending on the host species of the secondary antibody.
6.0Embryoid body formation
NOTE: This is a basic protocol for performing spontaneous differentiation studies of
human ES cells by removing cells from the substrata and culturing them in suspension as tightly clustered balls of cells referred to as embryoid bodies (EBs). You should optimize
your own protocols for this step.
6.1Human ES cell colonies are dissociated in the same manner as they are when
passaging.
6.2Cells are triturated into small clumps of cells containing ~50 cells/clump and plated on
non-adherent 6-well plates in differentiation medium, which contains 20% FBS instead
of KnockOut? Serum Replacement, and no bFGF.
6.3Cells are allowed to grow in suspension for 4-15 days and then can be re-plated as
aggregates or after dissociation, on tissue culture dishes coated with desired
substrates or extracellular matrices. Cells can be maintained in DMEM with 20% FBS
for additional periods of time during which cells are harvested and analyzed for
characteristics of differentiation.
GENERAL GUIDELINES FOR USE
Handle all plates under aseptic conditions.
1.Store BD BioCoat? Matrigel? 6-well plates for ES cell culture at -20o C. DO NOT THAW
AND RE-FREEZE PLATES. Aseptically remove desired number of plates from packet, re-seal the remaining plates in packet with tape and store at -20o C promptly (within 5 minutes).
Re-packaged plates may be stored at -20o C and used for up to two weeks.
2.Thaw plates to room temperature immediately prior to use (~15-30 minutes). Add pre-
warmed MEF-CM media and store (1-2 hours maximum) in a 37o C incubator until cells are ready to be plated.
https://www.sodocs.net/doc/793474831.html,e BD BioCoat Matrigel 6-well plates for ES cell culture for up to 7-10 days for culturing
human ES cells.
STABILITY
BD BioCoat Matrigel 6-well plates for ES cell culture are stable for at least 3 months from date of shipment when stored at -20°C.
CUSTOMER AND TECHNICAL SERVICE
For technical assistance, contact Technical Service at:
Tel: 877.232.8995 or 978.901.7389 Fax: 978.901.7491; e-mail: Labware@https://www.sodocs.net/doc/793474831.html,
To place an order in the U.S., contact Customer Service at Tel: 877.232.8995
Fax: 800.325.9637 or 858.812.8889
Outside the U.S., contact your local distributor or nearest BD Bioscience office.
Visit our website https://www.sodocs.net/doc/793474831.html,/discovery_labware for additional information on
BD BioCoat or products including:
? Product Literature
? Bibliography
?List of Related Products
REFERENCES
1. Xu, C., et al., Nature Biotechnology 9:971 (2001).
2. Xu, C., et al., Stem Cells 22:972 (2004).
3. Stojkovic, P., et al., Stem Cells 23:306 (2005).
4. Sj?gren-Jansson, E., et al., Developmental Dynamics 233:1304 (2005).
5. Xu, C., et al., Stem Cells 23:315 (2005a).
6. Wang, L., et al., Blood 105:4598 (2005a).
7. Levenstein, M.E., et al., Stem Cells 24:568 (2006).
8. Ludwig, T.E., et al., Nature Biotechnology, Brief Communications, January 2006.
9. Xu, R.H., et al., Nature Methods 2:185 (2005b).
10. Wang, G., et al., Biochemical and Biophysical Communications 330:934 (2005b). Kimwipe? is a registered trademark of Kimberly Clark Corporation.
KnockOut? is a trademark of Invitrogen Corporation.
BD, BD logo, and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. ?2006 BD
蛋白的纯化
第二部分：蛋白的纯化 如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？ 破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。 根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后，菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。 对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。 沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。 取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。 无论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。 包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。 电泳检测的话，可以用SDS-PAGE检测，在上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了，每个蛋白分子与SDS结合，形成了可溶物。 包涵体是不容易破碎的，超声可以破碎菌体释放里面的包涵体，但是不能破碎包涵体；但如果用水煮的话，包涵体会变性，会有一部分可溶于水，所以你跑的上清中有可能有包涵体存在，也有可能没有包涵体； 建议： 还是先将菌体超声破碎，然后离心，取沉淀和上清再跑一次电泳，如果沉淀上清中都有你要的蛋白，说明表达的结果是部分可溶；如果仅上清有就是可溶性表达；如果仅沉淀中有，就是完全包涵体了。不过，一般情况下，应该是第一者的可能性大。
蛋白质的纯化方法
蛋白质纯化的方法 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
动物微生物实验仪器操作规程汇总(DOC)
高压蒸汽灭菌锅操作规程 一、操作步骤 1、开盖：向左转动手轮数圈，直至转动到顶，使锅盖充分提起，拉起左立柱上的保险销，向右推开横梁移开锅盖。 2、通电：接通电源，此时欠压蜂鸣器响，显示本机锅内无压力（当锅内压力升至约0.03Mpa 时蜂鸣器自动关闭），控制面板上的低水位灯亮，锅内属断水状态。 3、加水：将纯水或生活用水直接注入蒸发锅内约8升，同时观察控制面板上的水位灯，当加水至低水位灯灭，高水位灯亮时停止加水。当加水过多发现内胆有存水，开启下排汽阀放去内胆中的多余水量。 4、放样：将灭菌物品仪器堆放在灭菌筐内，各包之间留有间隙，有利于蒸气的穿透，提高灭菌效果。密封：把横梁推向左立柱内，横梁必须全部推入立柱槽内，手动保险销自动下落锁住横梁，旋紧锅盖。 5、设定温度和时间：按一下确认键，进入温度设定状态，按上下键可以调节温度值，再次按下确认键，进入时间设定状态，按左键或上下键设置需要的时间，再次按动确认键，设定完成，仪器进入工作状态，开始加热升温。 6、灭菌结束后，关闭电源，待压力表指针回落零位后，开启安全阀或排汽排水总阀，放净灭菌室内余气。若灭菌后需迅速干燥，须打开安全阀或排汽排水总阀，让灭菌器内的蒸汽迅速排出，使物品上残留水蒸气快速挥发。灭菌液体时严禁使用干燥方法。 7、启盖：同第一步。 二、注意事项 1、堆放灭菌包时应注意安全阀放汽孔位置必须留出空气，保障其畅通，否则易造成锅体爆裂事故。 2、灭菌液体时，应将液体灌装在耐热玻璃瓶中，以不超过3/4体积为好，瓶口选用棉花纱塞。 3、本器尽量使用纯水，以防产生水垢。 动物微生物生实训室
生物显微镜操作规程 一、操作步骤 1、将所需观察的标本放在工作台上卡夹住。 2、将各倍率物镜顺序装于物镜转换器上，目镜插入目镜筒中。 3、操作时将标本移动到工作台中间，先用10×物镜观察，打开电源开关把亮度调节钮移至适当位置，转动粗调手轮将工作台上升到能见到标本的影形，转动微调手轮即可得到清晰的物象。光亮的选择可转动聚光镜架手轮使聚光镜上升或下降，再调节可变光栏，使改变交栏孔径以便获得适合各类细节标本的照明亮度。（为光源和观察需要备有滤色片供使用，滤色片装于可变光栏下部的托架上，可得到选择的色泽。如用低倍物镜观察液体及用高位物镜时感到光源太强时，可将毛玻片装于可变光栏下部托架上使用，可得到暗淡光线）转动工作台上纵向手轮，使工作台同标本作前后方向移动，转动横向手轮使标本作左右方向移动。将所需观察的物体移至中心观察，然后转至高倍物镜或油浸物镜进行观察（用油镜时需加注香切片物体）仍能看见物体的影象，需再转动微调手轮即可达到清晰的物象。例用完毕只要转动粗调手轮将工作台下降到底，再将亮度调节钮移到最小亮度处最后关上电源开关。 4、调节亮度调节钮可以改变灯泡发光亮度以获得最佳亮度。 5、更换灯泡方法：把钨卤素灯插入灯座，然后将它插入底座下方插口处即可。
(整理)包涵体的分离纯化.
包涵体的纯化和复性总结（二） 关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-1 00, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的load ing buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. "取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? " 而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的.
标准操作规程实验动物隔离检疫标准操作规程【模板】
标 准 操 作 规 程 (Standard Operating Procedure) 实验动物隔离检疫 标准操作规程 Standard Operating Procedure for ethical review system of Laboratory Animal 制定者 Author 兽医办公室/兽医师 Veterinary office 审查者 Reviewer 肖春兰 动物质量办公室/技术员 Technican of Animal Quality Lab 审查者 Reviewer 王婧 办公室主任 Office Director 机构负责人批准Facility Manager Approver 周正宇 中心最高领导者 Top Manager of the Center
修订记录（Revision History）
发放记录（Revision History）
1、目的(Purpose) 规范苏州大学实验动物中心实验动物隔离检疫标准操作规程。 2、适用范围 (Scope) 此文件适合苏州大学实验动物中心所有动物隔离检疫。 3、职责(Responsibility) 3.1 文件编写、批准人员对该文件编写和修改的有效性负责。 3.2 文件编写人员负责根据此文件，对担任实验动物隔离检疫的工作人进行 培训和指导。 3.3 担任实验动物隔离检疫的工作人，负责执行本标准操作规程，并负责反馈 相关信息。 4、操作规程(Procedures) 凡自主采购且来源为不是免检单位（见附表1）的SPF级实验动物，均需在进入我中心SPF动物房前，接受隔离检疫。 4.1 提交自购申请 凡自主采购实验动物的个人及单位，均需向我中心提交自购实验动物申请。 4.1.1 登陆动物管理系统 科研计划人以科研计划用户身份登陆苏州大学实验动物管理系统。 4.1.2 提交动物订购申请 科研计划人点击动物订购项，添加动物订购申报。 4.1.3 注意事项
包涵体纯化全过程(3)
一、包涵体的纯化和复性总结（二） 二、[ 2008-2-25 14:25:00 | By: 飞鸿 ] 三、关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等
细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml 溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. "取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法
混凝土灌缝胶小常识
什么是混凝土灌缝胶？ 混凝土灌缝胶，是双组分改性环氧树脂类低粘度液状的胶粘剂，其粘度低、配比宽松、放热少、适用期长，浆液灌注工艺简便。 混凝土灌缝胶广泛用于混凝土桥梁、房屋、水利、路面等工程中的裂缝注胶修补，以及混凝 土内部蜂窝、疏松等缺陷的补强注胶修补，玻璃钢防腐、结构表面涂层防腐施工。 适用于对混凝土构件、砖瓦构件所产生的缝隙进行灌注粘结，达到裂缝修复加固。 混凝土灌缝胶造价多少？ 要确定混凝土灌缝胶的造价，首先要确定用量多少。混凝土灌缝胶是A、B双组份，重量配 比A：B=3：1，密度为1.0g/cm3，用胶时需要严格按照配比称重；其次，在施工过程中，由 于季节、人为因素的影响，混凝土灌缝胶用量也不同； 另外，由于生产成本等因素的影响，各生产厂家定的混凝土价格是不一样的，这导致市场上 混凝土灌缝胶报价不一，相应的客户购买的价格不一； 混凝土灌缝胶的造价有很多影响因素，不能一概而论。但整体来说，本着节约、质优的原则，选择上海悍马的产品还是蛮不错的。 优质的混凝土灌缝胶都有哪些品牌？ Crafco 美国科来福公司成立于1976年，是世界上路面早期养护的倡导者和领先者。科来福产品和工艺拥有多项世界第一。 它最早倡导开槽工艺；唯一的一家可为用户提供解决路面早期病害的全套解决方案和相关产 品的公司；工艺、设备、材料三个第一强强结合而成为无与伦比的行业领先者。
多项产品品质第一；多项世界专利。科来福产品主要包括裂缝处理系列产品（开槽机、灌缝机、90多种密封胶），坑槽处理系列产品（路面修补机及多种材料）、龟裂处理系列产品（喷注机及材料）、机场场道处理系列产品、防水处理系列产品等。养护范围包括机场、公路、水坝、桥梁、隧道、人行道等等。 BERAM 北美百能（BERAM）灌缝胶产于加拿大的多伦多，产品适合沥青混凝土公路、高速公路、机场跑道等经向纬向和不规则裂缝及接缝的密封修复。适用于空气温度―22℃—40℃，路面温度－22℃—64℃。 上海悍马 进口的混凝土灌缝胶品牌有很多，但由于是进口的价格比同类国产的要贵很多。近几年，国产混凝土灌缝胶研发成果显著，也涌现了一批质量不错的品牌。例如，上海悍马建筑科技有限公司就不错，拥有独立品牌及多项研发专利，在用户当中评价和口碑都很好。 上海悍马建筑科技有限公司是加固材料行业的良心生产商，专业从事加固材料的研发，生产和销售。上海悍马主要生产和销售混凝土灌缝胶、碳纤维布、碳纤维板、碳纤维胶、注射式植筋胶、结构粘钢胶、化学锚栓、结构灌注胶、裂缝修补胶等加固系列产品。 混凝土灌缝胶怎样施工？ 裂缝检查→裂缝处理→设置灌浆嘴→封缝→封缝检验→配制灌浆胶液→灌胶→胶液固化→灌胶效果检验。
蛋白纯化(his标签)说明书
Instruction Manual ProBond TM Purification System For purification of polyhistidine-containing recombinant proteins Catalog nos. K850-01, K851-01, K852-01, K853-01, K854-01, R801-01, R801-15 Version K 2 September2004 25-0006
ii
Table of Contents Kit Contents and Storage (iv) Accessory Products (vi) Introduction (1) Overview (1) Methods (2) Preparing Cell Lysates (2) Purification Procedure—Native Conditions (7) Purification Procedure—Denaturing Conditions (11) Purification Procedure—Hybrid Conditions (13) Troubleshooting (15) Appendix (17) Additional Protocols (17) Recipes (18) Frequently Asked Questions (21) References (22) Technical Service (23) iii
Kit Contents and Storage Types of Products This manual is supplied with the following products: Product Catalog No. ProBond? Purification System K850-01 ProBond? Purification System with Antibody with Anti-Xpress? Antibody K851-01 with Anti-myc-HRP Antibody K852-01 with Anti-His(C-term)-HRP Antibody K853-01 with Anti-V5-HRP Antibody K854-01 ProBond? Nickel-Chelating Resin (50 ml) R801-01 ProBond? Nickel Chelating Resin (150 ml) R801-15 ProBond?Purification System Components The ProBond? Purification System includes enough resin, reagents, and columns for six purifications. The components are listed below. See next page for resin specifications. Component Composition Quantity ProBond? Resin 50% slurry in 20% ethanol 12 ml 5X Native Purification Buffer 250 mM NaH2 PO4, pH 8.0 2.5 M NaCl 1 × 125 ml bottle Guanidinium Lysis Buffer 6 M Guanidine HCl 20 mM sodium phosphate, pH 7.8 500 mM NaCl 1 × 60 ml bottle Denaturing Binding Buffer 8 M Urea 20 mM sodium phosphate, pH 7.8 500 mM NaCl 2 × 125 ml bottles Denaturing Wash Buffer 8 M Urea 20 mM sodium phosphate, pH 6.0 500 mM NaCl 2 × 125 ml bottles Denaturing Elution Buffer 8 M Urea 20 mM NaH2PO4, pH 4.0 500 mM NaCl 1 × 60 ml bottle 3 M Imidazole, 20 mM sodium phosphate, pH 6.0 500 mM NaCl 1 × 8 ml bottle Purification Columns 10 ml columns 6 Continued on next page iv
动物实验标准操作规程
动物实验标准操作规程 一、人流线路工作人员进入第一更衣室→脱去个人外衣（饰品）放入衣柜→脱去蓝色拖鞋后(→淋浴室)进入第二更衣室→穿上红色拖鞋→手消毒（0.1%新洁尔灭）→按操作规范穿上无菌连体衣，戴上一次性无菌口罩、手套→进入缓冲间→风淋→进入清洁走廊→进入洁净区域工作→进入饲养室或检疫室→所有工作结束后→进入污物走廊、脱掉红色拖鞋→进入缓冲间→穿上蓝色拖鞋，进入洗刷、消毒区域，取掉手套、口罩、连体衣，分别放入指定的回收桶中→进入第一更衣室，穿上个人衣（饰）→出屏障系统。 二、物流线路物品→高压蒸汽灭菌器或传递窗或渡槽→消毒传递间→清洁准备室→清洁走廊→饲养室或动物实验室→污物经包装处理→（后室缓冲间）→次清洁走廊→气闸（缓冲间）→清洗消毒室→外部区域。 三、动物流线路外来SPF级实验动物→传递窗→消毒传递间→清洁准备室→清洁走廊→饲养室或动物实验室→生产繁殖或实验处理后→（后室缓冲间）→次清洁走廊→气闸（缓冲间）→清洗消毒室→外部区域。 四、空气（压力）流程新风口→空气初效过滤器→空气中效过滤器→空气高效过滤器→屏障系统内各区域并产生压力梯度: ①清洁走廊→饲养室或动物实验室→（后室缓冲间）→次清洁走廊→气闸（缓冲间）→室外。②(进入屏障系统内)气闸(缓冲间)→第2更衣室→淋浴室→第1更衣室→室外。③(离开屏障系统内)气闸(缓冲间)→清洗准备间
(消毒室)→外部区域。④消毒传递间→传递窗→清洗消毒室→外部区域。 五、注意事项为了防止空气倒流，必须调节并保持4.4中各区域间的压力梯度，同时，必须时刻保证2更衣室、消毒传递间、气闸（缓冲间）至少20Pa的正压。 六、质量记录动物/物品传递管理记录表、动物饲养环境参数与异常情况记录表。
蛋白纯化的一般原则及方法选择
随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易lIl。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1 蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可 以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2.各种蛋白纯化方法及优缺点 2.1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保护蛋白的活性。硫酸铵分馏常用做纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG 和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果， 在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。
冷补液体灌缝胶(路面裂缝专用)
冷补液体灌缝胶 冷补液体灌缝胶单组分新型油性有机硅冷补液体灌缝产品，适用于水泥或沥青路面、广场、机场跑道、屋面、地下室的伸缩缝、沉降缝、切割缝及新修水泥路面施工缝等病害裂（接）缝的粘接密封。该产品是具有优异抗位移变化与防水性能的快速固化的油性材料，它吸收空气中的水分反应固化,耐候性强，高温不流淌，低温不脆裂，可在80℃至-50℃施工。该产品雨前施工雨后及气温骤变时固化的胶体与裂缝两侧的粘结面不会剥离，并保持弹性。冷补液体灌缝胶颜色可根据客户需求进行定制，以适应各种颜色路面裂缝处理的需要，使用寿命不少于10年。经测定，每公斤冷补液体灌缝胶可灌注常规裂缝10-30延米，扩缝、除尘、灌胶及用胶等各项工料合计每米冷补液体灌缝胶成本不超过3元，比常规热灌缝每米节省成本9元左右。 冷补液体灌缝胶施工工艺： 1、清理（裂缝宽度大于3mm） 宽度大于3毫米的裂缝，灌缝前，用铁钩将裂缝内杂物清除，裂缝内及裂缝两侧应清洁无污物，尘土、碎片、杂草。 2、扩缝（裂缝宽度小于3mm） 裂缝宽度少于3mm，采用背负式扩缝机，体积少，重量轻，扩缝活动自如，可跟踪任意转弯扩缝，扩缝宽度一般为4至6毫米，扩缝深度为6至10毫米。 3、除尘清理 采用狼牙吹风除尘清理机，在保证浮尘清除干净的同时，再用弹性钢刷将扩缝后残留在缝内松动的混凝土渣完全抠掉。 4、填充 对较宽较深的裂缝，可在灌胶前在清理好的裂缝内填充粒径大于裂缝宽度的砂砾或弹性泡沫条，上方预留0.5-1cm空间用于注胶。 5、注胶 宽度3毫米以下的裂缝，必须先用扩缝机扩缝后再灌胶，扩缝后裂缝宽度及深度均为6-8毫米为宜（扩缝的原因是因为由于裂缝的宽度过小，灌缝胶固有的表面张力，不能做到胶体的自流平，从而不能顺利的罐入裂缝内）。扩缝后，每公斤冷灌缝胶可灌注20-30延米。宽度大于3毫米的裂缝，可采用背负式灌胶机或专用灌胶袋直接注胶。经测定，每公斤冷灌缝胶可灌注常规裂缝10-20延米，扩缝、除尘、灌胶及用胶等各项工料合计每米冷灌缝成本不超过3元。 6、水泥新修路面施工缝灌胶 切割后的施工缝一般宽度为1厘米、深度为7厘米，灌胶时可用砂砾或弹性泡沫条填充裂缝内，上方预留0.5cm空间用于灌胶。每公斤冷灌缝胶可灌注施工缝15延米，每米成本为1.5元。 友情提示：灌缝胶固含量为75%，等胶体固化后会有轻微收缩，低于裂缝两侧的路面高度，避免车辆轮胎直接磨损胶体。因此注胶时，千万不能高于裂缝周边路面，否则等灌缝胶处于半固化状态时，半固化的裂缝内的胶条已经初步成型，具有一定的弹性和整体强度，会和路面上的胶条一起被轮胎带走。 7、开放交通 灌缝胶表干时间15℃以上小于1小时，15℃以下表干时间相对延长，对于宽度少于1厘米宽的裂缝，注胶后可直接开放交通。
抗肿瘤药物体内筛选试验标准操作规程(SOP)
抗肿瘤药物体内筛选标准操作规程概述： 抗肿瘤药物是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖的一类药物，作用机制包括抑制肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。 本操作规程包括与抗肿瘤药物申请临床试验和申请上市有关的非临床有效性和安全性研究的内容，其中着力强调非临床有效性和安全性之间的关联性，以及非临床研究和临床试验之间的关联性。旨在一方面为抗肿瘤药物的非临床研究提供技术参考；另一方面，通过技术要求引导科学有序的研发过程，使国内此类药物的研发更趋规范和合理。 本操作规程仅代表目前对抗肿瘤药物非临床研究的一般性认识。具体药物的非临床研究应在本指导原则的基础上，根据药物的自身特点制订研究方案。 研究目的： 建立一套包括抗肿瘤药物体内作用的药效学研究和评价体系及相应的标准操作规程以 及抗肿瘤药物安全性和作用新机制的研究。 ①有效性研究 抗肿瘤药物有效性研究的目的主要在于探索受试物的作用机制、作用强度、抗瘤谱等，为之后的安全性评价以及临床试验中适应症、给药方案的选择提参考信息。 ②安全性评价 安全性评价的目的主要包括：（1）估算 I 期临床试验的起始剂量；（2）预测药物的毒性靶器官或靶组织；（3）预测药物毒性的性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案的制订提供参考。 研究计划： (a)小鼠急性毒性测试
按照急性毒性测试的常规方法，选用昆明种小鼠，通过腹腔注射方式给药，测定体外抗肿瘤活性突出的化合物的半数致死量（LD50），参考给药小鼠体重变化情况，评价化合物的急性毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试的给药剂量。 (b)小鼠体内抗肿瘤活性测试 根据动物体内抗肿瘤活性测试的标准方法，选用昆明种小鼠，皮下接种肉瘤S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低的化合物，设定合适的剂量通过腹腔注射方式给药，以临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺作为阳性对照药物，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。 (c)专利保护范围内的化合物的继续合成 申请保护范围较大的专利，合成部分可能具有良好活性的新的化合物，拓展研究范围，发现活性更强的化合物，并申请新的发明专利。并可针对具体化合物申请从属专利，延长高活性化合物的保护期限。 （d）体外抗肿瘤活性的广泛筛选 采用MTT法或台盼蓝染色法，测定化合物对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性，确定化合物在不同瘤株间抗肿瘤活性的选择性，为裸鼠模型实验提供依据。 （e）抗肿瘤作用机理的深入研究 根据抗肿瘤（f）人癌裸鼠移植瘤模型实验活性化合物作用机理特征，选用微管蛋白聚合等实验从分子水平确认化合物的作用机理；利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内皮细胞骨架的影响及诱导凋亡的途经，从细胞水平上阐明化合物的作用机理。 根据抗肿瘤新药审批办法的要求，采用裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型，以相对肿瘤增值率和生存时间为指标，确定化合物的抗肿瘤活性。 （g）动物体内药物代谢动力学实验
包涵体蛋白的分离纯化
包涵体蛋白的分离纯化 赵玲0743085096 包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH 值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%~95%,此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。 1. 包涵体的形成 重组蛋白不论在原核细胞还是真核细胞中表达时,都可形成包涵体。通常所说的包涵体是指重组蛋白在大肠杆菌中高效表达时形成的无活性蛋白聚集体,一般含有50%以上重组蛋白,其余为核糖体组分、RNA聚合酶,外膜蛋白等杂蛋白,以及质粒DNA、RNA片断、脂质、肽聚糖、脂多糖等成分]。由于包涵体在相差显微镜下为黑色斑点, 所以也称为折射体。包涵体形成的原因主要有以下几点: ⑴蛋白合成速度太快,以致于没有足够的时间进行折叠。蛋白折叠的动力学模型表明:蛋白质天然构象形成的速率取决于肽链的合成速率、折叠速率和聚集速率几个因素。中间体正确折叠是分子内的一级反应,而中间体的聚集是发生在分子间的二级或高级反应,因此,折叠中间体的浓度对聚集反应影响非常大];⑵重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺少真核生物的翻译后修饰系统(如糖基化等) ,致使中间体大量积累,容易形成包涵体;⑶培养条件不佳和重组蛋白所处的环境也可导致包涵体形成,如发酵温度高,胞内pH 接近蛋白的等电点等;⑷二硫键在蛋白折叠中有重要作用,而大肠杆菌胞内的还原环境不利于二硫键的形成;⑸包 涵体不溶可能由于分子间无活性的β2片层含量高于天然结构或盐沉淀蛋白。包涵体蛋白虽然不具有天然
沥青路面裂缝灌缝施工方案
公路路面灌缝施工技术方案 1、工程概述： 根据市公路局[2012]41号文件精神,大力开展路面灌缝预防性养护技术的应用。涪陵区公路局组织局技术人员对本局辖区内的国省道干线公路G319线、S103线、S408线、S303线、S105线、S413线的路面裂缝状况进行了调查，共排查出需进行路面灌缝预防性养护的裂缝长度28787.2M。其中沥青路面裂缝长度11906.2M；砼路面裂缝长度16881M。由于沥青路面或砼路面产生裂缝后，路面地表水的渗入，从而破坏路面面层和基层稳定性，由此可能造成更加严重的路面病害发生。为了有效控制路面裂缝进一步发育,延长路面的使用寿命, 使路面处于良好的工作状态，确保通行车辆在公路上快速、安全、平稳、舒适地运行。涪陵区公路局决定对本次调查的沥青路面或砼路面裂缝进行灌缝处理。 2、技术方案编制依据： 2.1公路沥青路面养护技术规范JTJ073-2001 2.2公路养护安全作业规程JTG H30-2004 2.3公路养护技术规范JTG H10-2009 2.4公路养护质量检查评定标准JTG075-94 2.5公路工程质量检验评定标准JTG F 80/1-2004 2.6路面橡胶沥青灌封胶JT/740-2009 2.7市公路局[2012]41号文件
3、技术方案适合范围： 本技术方案适用于涪陵区公路局辖区内的国省道干线公路G319线、S103线、S408线、S303线、S105线、S413线的路面裂缝的灌缝处理。 4、总体要求： 4.1本工程施工工期为2012年8月20日至2012年10月20日，总共62天。 4.2养护单位作业人员上岗前应接受安全和养护施工现场培训，合格后再上岗。 4.3每次灌缝作业前，养护单位作业班长应对作业人员进行安全技术交底，并做好记录。 4.4对路面裂缝灌缝前后须进行照相，记录反映病貌、修补日期、时间、气象资料和修补作业单位、完成后状况。 5、施工准备 5.1人员准备 施工总负责人：1人；技术负责人：1人；施工队长：1人，计划投入民工6人。 5.2机械准备 农用车两辆，服务车一辆，热风枪一台，吹风机一台，炒砂箱一个，开槽机一台，灌缝机一台，冲击电钻一台等。 5.3材料准备 各类材料准备充分，能满足工程前期施工需要，且所有原材料经
动物实验室管理规定
动物实验室管理规定 为加强对动物实验室的规范化管理，保证实验动物质量，确保实验研究和检测结果准确可靠以及安全评价符合标准，同时为了防止人畜共患病的发生及蔓延，根据我动物实验室实际情况规定如下： 1.实验动物的管理及使用必须严格按照《实验动物管理条例》和《广东省实验动物管理条例》的有关条款执行。 2.国家对实验动物生产和使用实行许可证制度。本动物实验室（屏障环境）已获得《广东省实验动物使用许可证》，面向广大科研工作者开放。需要开展动物实验的单位和个人，可向动物实验室提出申请，经审批通过并按规定办理相关手续后，即可进入实验室进行实验动物的饲养和实验操作。 3.本办法所称实验动物，是指经人工饲养培育，遗传背景明确或者来源清楚，对其质量实行控制，用于科学研究、教学、医药、生产和检定以及其他科学实验的动物。 4.在动物实验室进行动物实验活动的人员必须严格遵守动物实验实验室各项规章制度，服从工作人员的管理和安排。 5.深圳第三人民医院实验动物管理委员会负责指导和监督实验动物工作，动物实验室具体负责动物实验的管理、监督和检查工作。 6.动物实验室的工作人员（包括管理人员、实验动物技术人员和饲养人员）必须经过正规的实验动物培训，并持有“广东省实验动物学会”颁发的《实验动物技术培训班结业证书》或相关实验动物从业人员资格证书。实验动物从业人员实行定期健康体检制度，确认无传染病（含微生物和寄生虫）和其他影响实验动物工作疾病的人员方可上岗。 7.凡申请进入动物实验室进行动物实验操作的人员（包括研究生）必须提交相关实验动物从业人员资格证书，无证人员必须参加本动物实验室举办的岗前培训，经考核合格并取得深圳第三人民医院动物实验室颁发的《实验动物上岗培训合格证》后，方可申请进入动物实验室从事动物实验操作。 8.购买实验动物必须选择有资质的实验动物生产单位，在动物进入动物实验室的同时提交《实验动物生产许可证》复印件和《实验动物质量合格证》原件。
Protocol蛋白质纯化步骤
Protocol 蛋白质纯化方法（镍柱） 柱前操作 1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min; 2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质； 3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体； 4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？ 5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）； 6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱； 平衡柱子（柱体积：V） 7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）； 8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？ 9. 3V BB; 柱层析 10.上样； 11. 10V Washing Buffer（WB）； 12. 6V Elute Buffer（EB); 13.分管收集，每管1~2ml. 各种缓冲液配方 1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.9 1000ml NaCl: 58.44×4=233.76g Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g 2. 8×CB: 400mM NiSO4 1000ml NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g 3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g 4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g 5. 6M 尿素 1000ml 尿素：60.06×6=360.36g