DNA甲基化研究进展
科技情报开发与经济SCI-TECH INFORMATION DEVELOPMENT＆ECONOMY2009年第19卷第29期
DNA的甲基化修饰常见于细菌、植物和哺乳动物。甲基化修饰有多种方式，被修饰位点的碱基可以是腺嘌呤的N－6位、胞嘧啶的N－4位、鸟嘌呤的N－7位或胞嘧啶的C－5位，分别有不同的酶催化。在高等真核生物中，DNA甲基化仅发生在CpG二核苷酸G5′侧的C上。胞嘧啶的甲基化可能参与基因的表达调控、发育调节、基因组印迹和X染色体灭活，DNA甲基化异常与肿瘤等疾病有关。同样，已有诸多研究表明，细胞衰老过程也伴随着DNA甲基化水平的改变。如体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞DNA甲基化水平随细胞代龄的增加而降低，并且衰老时DNA的甲基化呈现出不均一性［1］。DNA甲基化已成为当前分子生物学的研究热点之一，而对其抑制剂以及分析方法的研究也有了长足的进步。本文将综述近年来DNA甲基化研究的新进展。
1DNA甲基化转录抑制机制
DNA甲基化与基因表达分化调控的相互关系假说已提出多年。此假说源于1979年Mc Ghee等发现与鸡β珠蛋白基因比邻的胞苷甲基化后，该基因转录受抑制的现象。后来又陆续发现许多基因甲基化和基因转录负相关。目前有3种可能的机制解释DNA甲基化对转录的抑制。
第一种机制是DNA甲基化直接干扰特异转录因子与各自启动子的识别位置结合。几种转录因子，如AP－2，C－MYc/Myn，CARBE，E2F和NF－kB，能识别含CpG残基的序列，当CpG残基上的C被甲基化后，结合作用即被抑制。相反，其他一些转录因子（如SP1和CTF）对结合位置上的甲基化不敏感，还有许多因子在DNA上的结合位点上不含CpG二核苷酸，DNA甲基化对这些转录因子基本不起抑制作用。
第二种甲基化转录抑制的机制是通过在甲基化DNA上结合特异的转录阻遏物，或称为甲基CpG结合蛋白而起作用。这种蛋白质能与转录因子竞争甲基化DNA结合位点。迄今为止，已经鉴定了两种这样的转录阻遏物，即MeCP1和MeCP2（甲基胞嘧啶结合蛋白1和2）。
第三种甲基化抑制机制是影响染色质结构。Kass等将一些甲基化或非甲基化的基因模板显微注射入细胞核，发现甲基化的染色质组装成非活化状态，不具转录活性（这表明甲基化抑制转录仅在染色质组装后），即使GAL4－VP16这种强转录激活子也难激发转录。近几年的工作对染色质结构调节机制有了较明确的认识，证明了染色质是处于一个动态构象中，在转录调节上起着重要的作用。染色质构型的变化伴随着组氨酸的乙酰化和去乙酰化。许多乙酰化和去乙酰化的酶已被证明分别是转录增强子蛋白和转录阻遏物蛋白。DNA的失活区域被证明是处于高度甲基化的，同时又是富含低乙酰化组氨酸的。
2DNA甲基化与肿瘤DNA
甲基化可以在转录水平调控基因表达（主要是在转录起始阶段）。通过基因启动子及其附近区域内CpG岛胞嘧啶的甲基化可以关闭某种组织或细胞不必要的基因，而去甲基化作用则可指导组织特异性或阶段特异性基因的活化，使基因表达具有时空特点。正常组织中，广泛表达的基因启动子区CpG岛常处于非甲基化状态；肿瘤胞中，这些CpG岛常变为甲基化状态，其相关基因的表达亦被关闭。最近发现，许多癌中存在高甲基化聚集现象，称为CpG岛甲基子表现型（CIMP），是多个基因同时发生转录失活引起基因外不稳定的一种通路，在肿瘤形成的后期起很重要的作用。在结直肠肿瘤中研究发现，这种表现型最可能存在散发性错配修复缺陷型结直肠癌中，除错配修复缺陷型肿瘤本身的hMLH1基因因高甲基化失活外，还有其他的基因因高甲基化而失活，包括p16，THBS1和CACNAIG等［2］。因此，肿瘤的发生不仅仅在于DNA突变，抑癌基因启动子的异常甲基化可能也是一个重要因素。此后，对许多基因的研究也证实了这一点，其中包括肿瘤抑制基因、细胞周期调节基因、抑制肿瘤转移和浸润基因、DNA修复基因、激素受体基因、抑制血管形成基因等［3］。
在肿瘤发生中DNA异常甲基化表现为遗传和表遗传两种效应。遗传效应通过甲基化胞嘧啶的自发性脱氨和增加外来致癌物的亲和力等方式起作用，引起基因突变频率增加。而通过DNA CpG岛的甲基化使某些重要基因失去功能是肿瘤发病中的一个重要因素［4］。
3DNA甲基化与细胞衰老和凋亡的关系
研究表明，体外培养的人成纤维细胞的端区在衰老过程中不断缩短，老年个体成纤维细胞及外周血淋巴细胞的端区亦短于年轻个体［5］。当端区缩短至一定程度时，细胞基因组就会变得不稳定，引起细胞功能和代谢的变化，此即衰老的“端区缩短”学说。然而，越来越多的研究表明端区的稳定性不单单依赖于端粒酶的活性。
DNA去甲基化是造成细胞基因组不稳定的原因之一，衰老过程中基因组甲基化水平降低。次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因及
文章编号：1005－6033（2009）29－0118-03收稿日期：2009－08－02
DNA甲基化研究进展*
王琦1，胡凤成2，李春明3
（1.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中，723001；2.陕西省略阳县野生动植物
保护站，陕西略阳，724300；3.陕西省勉县野生动植物保护站，陕西汉中，724200）
摘要：DNA甲基化已成为阐明正常和病理基因表达现象的重要机制，因而已成为当
前分子生物学的研究热点之一。对DNA甲基化的转录抑制机制、在肿瘤发生中的作
用、与细胞衰老和凋亡的关系、抑制剂以及分析方法等方面的研究新进展进行了综述。
关键词：DNA甲基化；基因调控；肿瘤；5氮杂脱氧胞苷
中图分类号：Q78文献标识码：A
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*本文为陕西省教育厅专项科研基金资助项目（08JK249）
的研究成果之一。
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导入细胞内的某些外源性标志基因，如lacZ和lacI等突变率增加，说明衰老细胞基因组不稳定性增加，但衰老期间DNA低甲基化与基因不稳定性有何关系尚不得而知。文献［6］的研究结果表明以5－aza－C处理的老年2BS细胞衰老表型更加明显，端区长度较对照细胞缩短，而年轻细胞则变化不显著，说明甲基化与端区的维持间有一定的关系。由于衰老过程中维持DNA甲基化的DNA甲基化酶活性降低，而促进DAN去甲基化的5－甲基胞嘧啶DNA糖基化酶活性增高，由此可能使老年细胞对5－aza－C的刺激更加敏感。DNA甲基化的改变可以影响染色质的构象，从而可能改变端区结合蛋白与DNA的作用，后者可以进一步引起端区长度的改变。DNA甲基化水平的改变是否由此影响端区的长度尚待验证，但由此说明，DNA甲基化水平降低、端区缩短等影响细胞基因组稳定性的因素在细胞衰老过程中发挥着重要作用。
还有研究结果表明，p16基因外显子Ⅰ的SmaⅠ位点处甲基化水平存在着随增龄而降低的趋势，且该趋势与p16在衰老细胞中的表达增加呈正相关［7］。Brenner等新近发现，人乳腺上皮细胞分裂次数的增加亦与p16基因的甲基化有关，而去甲基化所导致的生长阻滞则以p16的表达增强为前提。可见，甲基化在调节p16在衰老中的表达确实起着一定的作用。但是，该过程如何参与p16的调节尚需进一步的研究。其机制可能涉及p16基因调控区与蛋白质因子相互作用，或者衰老过程影响了DNA的甲基化状态。这些机制的过程和意义目前还不清楚，但是，由于p16在衰老中的重要作用，进一步研究其调控机制，尤其是大DNA甲基化的作用，将有助于进一步阐明衰老及其与肿瘤发生的关系。
此外，有文献［8］报道，采用组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）抑制剂SPB和去甲基化制剂5－Aza－Cdr作用于骨髓瘤细胞系U266，发现单用5－Aza－Cdr诱导的细胞凋亡在形态上主要表现早、中期凋亡的特征凋亡比率略有增高。单用SPB组和联合用药组表现出晚期凋亡的形态特征，且凋亡比例明显增高。结果显示单用SPB时C1/M期阻滞，提示药物作用的敏感点可能在C1/M期，细胞凋亡可能发生在C1/M期；而联合用药组则表现出C1期阻滞，提示药物作用的敏感点可能在C1期，细胞凋亡可能发生在C1期。文献的研究结果说明了乙酰化酶抑制剂与去甲基化制剂联合诱导U266细胞凋亡和p16基因重新表达，提示了细胞凋亡与DNA甲基化水平的关系。
4DNA甲基化研究方法及抑制剂的研究进展
近年来甲基化分析方法发展迅速，大致可以分为两大类：基因组DNA及特定DNA片段的甲基化检测。前者检测方法主要有限制性内切酶酶解法、甲基化酶温育法、高效液相色谱（HPLC）法这3种方法；后者包括：DAN印迹、限制性内切酶P、测序法、甲基化特异的PCR（MSP）、甲基化敏感性单链核苷酸引物延伸（MS－SnuPE）、变性高效液相色谱法（DHPLC）、微阵列技术（DNA Microarray）。其中微阵列技术又称DNA芯片或基因芯片，这种基于杂交的寡聚核苷酸微阵列是为了在基因组范围内检测DNA 变异而涌现出来的一种新型技术。主要有整个基因组范围内扫描的差异甲基化杂交（DMH）及针对某个基因检测的甲基化特异性微阵列（MSO）等［9］。
DNA甲基化在癌变过程中发挥重要作用，因此研究甲基化抑制剂的重要性不言而喻。DNA甲基化抑制剂能逆转甲基化效应，包括防止甲基化CpG的突变，重激活因甲基化抑制的基因等。这些抑制剂及其作用靶点较多［10］。
5氮杂胞苷、5氮杂脱氧胞苷和胞苷结构类似，它们能与DNA甲基化酶共价结合，降低酶的生物活性。但此类化合物体内
体外实验均有细胞毒和致突变作用。SAM类似物模拟甲基化酶的辅助因子SAM，竞争抑制甲基化酶。如Sinefungin及其衍生物对依赖SAM的甲基化酶表现强效抑制。但是它们特异性不高，也抑制SAM脱羧酶和SAH水解酶。体内涉及SAM代谢的酶较多，大部分可作为作用靶点。如乙硫氢基酪酸抑制SAM合酶，减少胞内SAM水平，能抑制包括甲基化酶在内的所有依赖SAM的酶。Neplanosin抑制SAH水解酶，使胞内SAH积聚，负反馈抑制DNA甲基化酶。
5DNA甲基化研究的展望
今后，对DNA甲基化的研究一是集中在甲基化系统功能失调后如何引起癌症及肿瘤特异性细胞的变化，另一个是研究DNA甲基化与DNA修复和基因组稳定的关系，最近发现的新的MMR蛋白MED1（也称为MBD4）证实与hMLH1有关，此酶N－末端有优先结合于甲基化DNA的结构域，C－末端有内切酶的活性，进一步的研究将证实这种新蛋白是否能够修复脱氨基的5甲基胞嘧啶及是否与细菌修复新合成DNA链的MutH基因同源［11］。还有一个临床上研究热点是对于抑癌基因甲基化受抑制导致肿瘤的研究。近几年来，由于DNA甲基化分析技术的不断发展和完善，为我们更进一步研究和阐明基因的表达调控、细胞增殖、分化发育和基因组印迹以及肿瘤的发病机制等提供了有力的工具，这将对功能基因组学的研究产生积极而深远的影响。
参考文献
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（责任编辑：薛培荣）────────────────
第一作者简介：王琦，男，1970年10月生，2006年毕业于西北大学（硕士），副教授，陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西省汉中市汉台区朝阳路陕西理工学院南校区，723001.
王琦，胡凤成，李春明DNA甲基化研究进展本刊E-mail:bjb＠sxinfo．net综述
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科技情报开发与经济
SCI -TECH INFORMATION DEVELOPMENT ＆ECONOMY 2009年第19卷第29期
Research Advances in DNA Methylation
WANG Qi ,HU Feng-cheng ,LI Chun-ming
ABSTRACT ：DNA methylation ,which has been widely considered as the most important mechanism for normal and
pathological gene expression ，
has been listed among the hotspots of molecular biology research .This paper summarizes the new research advances in aspects of the transcription repression mechanism of DNA methylation ，the functions of DNA methylation in tumors formation ，the relevancy of DNA methylation to cell senescence and apoptosis ，the inhibitors ,and the analytical methods ，etc .KEY WORDS ：DNA methylation ;regulation of gene expression ;tumor ;5－aza－Dc
溢洪道是一种普遍存在于各种水利枢纽工程中的泄水建筑
物，特别在水库的泄水工程中应用极为广泛。一般来说，溢洪道多为开敞式结构，由进水渠、控制段、泄槽段、消能防冲段和出水
渠段等几部分组成。在满足泄洪量的基础上，
由于泄流洪水的巨大能量往往会造成对下游河床的冲刷，因此溢洪道消能方案的选择，尤其是在溢洪道单宽流量较大的情况下成为其结构设计的难点之一。本文主要总结近年内众多水利工程中溢洪道的消能设计方案，为今后的设计工作提供参考依据。
1挑流消能溢洪道作为一种水利工程中普遍存在的泄水建筑物，在各
种消能形式中，挑流消能占的比例最大，已有近70年的历史。在高坝工程中，挑流消能方式应用更为广泛［1］。据统计［2］，在国内
外已建成的坝高大于70m 的泄洪枢纽工程中，
采用挑流消能方式的国外占74.4％，
国内则占97.7％。挑流消能是在泄水建筑物末端利用鼻坎将泄出的高速水流挑离建筑物较远的下游，使水流的能量在空中和下游水垫中消耗。这种消能方式对下游冲刷区的地质要求较高，因此相对而言，中小工程挑流消能一般不需在下游河床修建很多防护工程，大型工程挑流消能一般需修建水垫塘才能保证工程安全要求。
挑流消能效果的好坏受许多因素制约，主要有以下几方面因素：消能段的单宽流量；上、下游水位差及下游水深河床地质条件；挑流鼻坎的几何尺寸，包括射角、反弧曲率半径和鼻坎顶
高程等。文献
［3］中总结了在达到一定消能效果的条件下有关挑流鼻坎几何尺寸的确定方法，有一定的参考价值。刘数华在文献
［4］
中总结了3种挑流鼻坎的型式，即扩散型、窄缝式和多层式，并且描述了各个类型挑流鼻坎的特点和适用的地形地质条件。湛正刚在洪家渡水电站溢洪道出口消能工的设计研究中提到了4种挑流鼻坎消能工［5］，分别为大分流墩收缩式挑坎、平面扩散式消能工、平面扩散斜切槽式差动挑坎和曲面贴角鼻坎消能工，
并且详细描述了4种方案的优缺点，这对于不同条件下消能方案的选择有着很好的参考价值。不过需要指出的是针对不同的地质和水文等条件，需要适当地进行一些水工模型试验来对挑流消能工的形式和尺寸进行一定程度的优化，以达到更好的消能冲防效果。如姚文玲在那新水电站溢洪道的消能方案选择上利用模型试验先后5次优化了消能工结构［6］，最终确定了一种针对性较强消能方案，取得了很好的泄洪效果。
2底流消能
底流消能是一种常规的消能形式，通过水跃产生的表面漩
滚和强烈的紊动来达到消能目的，从而降低流速。由于它具有入池流态稳定、消能效率高、尾水波动小、泄洪雾化影响小的特
点，常常在工程中被采用。但高水头、
大流量泄洪工程采用这种消能工时，由于消力池底板临底流速较大，底板的抗冲保护难度很大［7］，因此这种消能形式的研究和工程应用一直局限在中、低水头的泄水消能工程中。据统计，国外403座坝高大于100m 的高坝中，采用底流消能的有124座，其中前苏联的萨扬舒申斯克坝高242m ，是目前世界上采用底流消能最高的坝；印度的巴
克拉坝高226m ，
美国的德沃歇克坝高219m ，也都采用底流消能。
近年来，针对底流消能在高水头、大流量的泄水建筑物上不能普及应用这一问题，文献［8］中提出了一种新型的跌坎式底流消能工来改进底流消能方案，并提出了准确的水力学公式来为工程设计提供依据。对于大单宽流量低佛氏数水跃,可根据工程实际情况采用一级或多级消力池消能，可达到圆满的消能效果。此外，对拱坝消力池的向心水流也找到了一些特殊措施，如文献［9］中提到的T 形墩消能方案和宽尾墩设计，均能明显地减小第二共轭水深，改善下游冲刷情况，获得良好的效能效果；并可以
文章编号：1005－6033（2009）29－0120-02
收稿日期:2009－08－12
溢洪道消能方案研究进展
张建军
（晋中市水利勘测设计院，山西晋中，030060）
摘要：将国内外有关溢洪道消能方案的研究成果进行了归纳和总结，着重探讨了挑
流消能、
底流消能和阶梯溢洪道消能，并介绍了一些新型的消能方案和模型试验成果。关键词：溢洪道消能；挑流消能；底流消能；阶梯溢洪道消能中图分类号：TV87文献标识码：A
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