微生物检验操作规程
微生物检验操作规程
1. 目的
建立微生物检验标准操作规程，保证检验操作规范化。
2. 范围
适用于本公司相关的微生物检验活动的全过程。
3. 职责
3.1 微生物检验员负责微生物检验的全过程；
3.2 QC主管负责监督检查本规程的有效实施。
4. 操作规程
4.1 微生物检验玻璃器皿吸管的洗涤
4.1.1 一般的玻璃器皿（例如培养皿、试管、三角瓶等），可用毛刷及洗涤剂洗去灰尘、油垢，然后用自来水、蒸馏水充分冲洗，直至玻璃器皿内壁均匀分布一层薄的水膜，即器壁既不挂水珠也无条纹，即洗涤达到标准。
4.1.2 玻璃器皿内有污迹不能洗净时，可浸泡于洗液中，待器皿中有机物氧化分解后，取出用自来水、蒸馏水冲洗干净，备用。
4.1.3 新购的玻璃器皿先用2％盐酸浸泡，再用用自来水、蒸馏水充分冲洗。
4.2 器皿的包扎
4.2.1 试管：塞上胶塞，然后用牛皮纸或报纸把试管头包扎起来。做发酵试验时，将试管头塞上专用的耐高温PVC试管帽。
4.2.2 三角瓶、抽滤瓶：将三角瓶（抽滤瓶）口塞上胶塞，然后用牛皮纸把塞头部包起来。
4.2.3 吸管：将耐高温的移液枪头装盒，用用牛皮纸或报纸包裹。
4.2.4 平皿：10个为一组，用牛皮纸包裹。
4.3消毒和灭菌：
4.3.1 化学灭菌：此法适用于微生物操作过程中不能加热、紫外线的地方。如人手等。
（1）用75%的乙醇溶液或0.1%新洁尔灭擦拭或浸泡。
（2）一般用1～2%的甲醛液浸泡软管和用具。
（3）一般成品漂白粉的有效成分是25～32% 。使用时配成有效成份的2%溶液洒在地面或容器内，（对金属有腐蚀作用）放置10～15min后冲洗即可。
（4）氯灭菌剂的能力以有效氯表示，将氯水配制成50～100PPm 的有效氯溶液，可用于浸泡，冲洗和表面杀菌。但氯对金属有腐蚀作用。
4.3.2 物理灭菌：
4.3.2.1 干热灭菌：适用于干燥的玻璃器皿（吸管、平皿等）、金属器具（镊子等）、固体试液、液状石蜡等。灭菌条件一般选用在160℃干热空气灭菌2h。
（1）器具用牛皮纸或灭菌袋包（装）扎，放入金属容器内。
（2）器具在干燥箱加热前放入，每个器具之间留有足够的空隙，使热
空气能畅通。
（3）关闭箱门接通电源，打开通气孔，使箱内湿空气能逸出，至箱内温度达到100℃时关闭。（4）加热至160℃，保持2小时。
（5）切断电源，冷却至60℃时，打开箱门，取出灭菌器具，并打开箱顶通气口。
注：灭菌时必须注意温度不能超过180℃，以免使棉花、报纸烘焦；灭菌时不得打开箱门；干燥箱未冷却时，不要取出里面器具，防止内外温差过大造成玻璃器具爆炸
璃器具爆炸。
4.3.2.2 湿热灭菌：适用于容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损伤的物品。详见《压力蒸汽灭菌器操作规程》。
（1）装入培养基的瓶用胶塞盖上，再用牛皮纸包扎。
（2）瓶中的培养液不要超过1L，否则灭菌不彻底。
（3）容器的上部应留有足够的空间（一般不超过装量的2/3），以便产生气泡。
（4）器具用牛皮纸包裹。
（5）器具的组合和包裹应允许灭菌蒸汽接触所用物品。
（6）各类器具装入灭菌器时，相互间要留有空隙以使蒸汽自由流动。
4.4 无菌操作的准备工作及注意事项
4.4.1 微生物室应定期按《微生物实验室管理规程》清洁。
4.4.2 微生物室使用前，应先打开紫外灯灭菌20～30min。
4.4.3 微生物室应备有专用剪刀、镊子、接种针，每次使用前后应灭菌消毒。
4.4.4 微生物室应备有75%酒精棉球；新洁尔灭消毒液内浸纱布数块，备用。
4.4.5 进入微生物，换专用鞋，穿好洁净服，离室时脱去洁净服和专用鞋，洁净服和专用鞋只准在微生物室内使用，不准穿到其它地方去，并定期洗换和消毒灭菌。
4.4.6 样品检验前应在原始记录本上记录名称、批号等内容，并在所用平皿或试管上详细记录样品序号、检验日期等内容。
4.4.7 无菌操作前，用75%的酒精棉球擦手。
4.4.8 操作要正确迅速，所用的器皿均应是经过严格灭菌的器皿。
4.4.9 检验完毕，立即清理工作台，弃去不需要物品，打开紫外灯灭菌20～30min。
4.5 微生物检验用培养基、溶液的配制、使用与储存
配制方法参见培养基说明书或检验标准项下规定配制。
4.5.1 水：电导率在25℃时不超过25μs/cm，除非另有规定要求。
4.5.2 称重和溶解：
保存培养基的时间需视培养基中水份蒸发的程度及有无污染而定，已制备好的培养基要保存于冰箱中。在冰箱中存放的培养基在使用前要先置于室温30min，使其与室温一致再使用，因为气体的溶解度可因温度上升而降低，特别是乳糖胆盐发酵管内的倒管会因温度上升而出现气泡，这一点必须注意。
4.5.3 pH 的测定和调整：
用pH计测pH，必要时在灭菌前进行调整，除特殊说明外，培养基灭菌后冷却至25℃时，pH应在标准pH±0.2范围内。一般使用浓度约为40g/L（约1mol/L）的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5 g/L（约1mol/L）的盐酸溶液调整培养基的pH。
4.5.4 分装：将配好的培养基分装到适当的容器中，容器的体积应比培养基体积最少大20%。
4.5.6 培养基的使用：
经过高压的培养基应尽量减少重新加热时间，融化后避免过度加热。融化后应短暂置于室温中（如2 min）以避免玻璃瓶破碎。
融化后的培养基放入47℃～50℃的恒温水浴锅中冷却保温，且应尽快使用，放置时间一般不应超过4 h。未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。敏感的培养基尤应注意，融化后保温时间应尽量缩短，如有特定要求可参考指定的标准。
4.5.7平板的制备和储存
倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成厚度至少为3 mm（直径90 mm的平皿，通常要加入18 mL～20 mL琼脂培养基）。将平皿盖好皿盖后放到水平平面使琼脂冷却凝固。如果平板需储存，或者培养时间超过48h或培养温度高于40℃，则需要倾注更多的培养基。凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和（或）5℃±3℃冰箱的密封袋中，以防止培养基成分的改变。在平板底部或侧边做好标记，标记的内容包括名称、制备日期和（或）有效期。也可使用适宜的培养基编码系统进行标记。
将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限。为了避免冷凝水的产生，平板应冷却后再装入袋中。储存前不要对培养基表面进行干燥处理。
对于采用表面接种形式培养的固体培养基，应先对琼脂表面进行干燥：揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱或培养箱中（温度设为25℃～50℃）；或放在有对流的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商品化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。
4.6 检验方法
做样前，将灭菌好的吸管、培养皿等放入操作台上，操作台、微生物室紫外线灭菌30min，然后关紫外线灭菌灯，开启净风循环30min后开始做样。
详见附录各检测方法
附录1 菌落总数测定
附录2 霉菌和酵母计数
附录3 大肠菌群计数
附录4 大肠埃希氏菌计数
附录5 沙门氏菌检验
附录6 金黄色葡萄球菌检验
菌落总数的测定方法
1. 样品的稀释
1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水中均质1 min～2 min 制成1:10 的样品匀液。
1.2液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
1.3 用1mL微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液面），换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
1.4 按4.6.1.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸头。
1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
1.6 及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
2. 培养
2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。
2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按4.6.1.2.1条件进行培养。
2.3 菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。
2.3.1选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
2.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
2.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
3 结果与报告
3.1菌落总数的计算方法
3.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。
3.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下式计算：
N——样品中菌落数；
ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
3.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
3.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
3.1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
3.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
3.2 菌落总数的报告
3.2.1 菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
3.2.2 菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
3.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
3.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
3.2.5 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。
霉菌和酵母菌计数
1. 样品的稀释
1.1 固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即1:10稀释液。
1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
1.3 取1mL1:10稀释液注入含有9mL无菌水的试管中, 另换一支1mL无菌吸管反复吹吸，此液为1:100稀释液。
1.4 按1.3 操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL 样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。
1.6 及时将15mL～20mL冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
2. 培养
待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，观察并记录。
3. 菌落计数
肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（CFU）表示。
选取菌落数在10CFU～150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。
4. 结果与报告
4.1 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。
4.1.2 若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
4.1.3 若所有平板上菌落数均小于10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
4.1.4 若所有稀释度平板均无菌生长，则以小于1乘最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。
4.2 报告
4.2.1 菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。
4.2.2 菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。
4.2.3 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或
酵母数。
菌落总数、霉菌及酵母数检验流程图
大肠菌群计数
第一法MPN计数
1. 样品的稀释
1.1 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水均质1min～2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋制成1:10 的样品匀液。
1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
1.3 样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。
1.4 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液面），换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
2. 初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1 ℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
3. 复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
4. 大肠菌群最可能数（MPN）的报告
按3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附件B，表1），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。
第二法平板计数法
1. 样品的稀释
按第一法中的1进行。
2. 平板计数
2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
2.2 及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h～24h。
2.3 平板菌落数的选择
大肠菌群计数检验流程图
第一法MPN计数法第二法平板计数法
大肠埃希氏菌计数
第一法MPN计数法
1. 样品的稀释
1.1 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水均质1min～2min,制成1:10 的样品匀液。
1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
1.3 样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。
1.4 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液面），换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
2. 初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1 ℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。产气者进行复发酵试验。如所有LST 肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN 结果。
3. 复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于已提前预温至45℃的EC 肉汤管中，放入带盖的44.5℃±0.2℃水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h，检查小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。
4. 伊红美蓝平板分离培养
轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB平板，36℃±1℃培养18h～24h。观察平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
5. 营养琼脂斜面或平板培养
从每个平板上挑 5 个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36℃±1℃，培养18h～24h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。
6. 鉴定
取培养物进行靛基质试验、MR（甲基红）-VP试验和柠檬酸盐利用试验（详见生化试剂盒使用）。
5.3 大肠埃希氏菌MPN 计数的报告
大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为＋＋――或－＋－－。只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查MPN表（见附件D，表2），报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌MPN 值。
第二法平板计数法
1. 样品稀释
按第一法中的1进行
2. 平板计数
2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。
2.2 将10mL～15mL冷至45℃±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3mL～4mL VRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36℃±1℃培养18h～24h。
2.3 平板菌落数的选择
选择菌落数在10CFU～100CFU之间的平板，暗室中360nm～366nm 波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠埃希氏菌ATCC 25922）和产气肠杆菌（如ATCC 13048）做阳性和阴性对照。
3. 大肠埃希氏菌平板计数的报告
两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g (mL)表示。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
大肠埃希氏菌计数检验流程图
第一法MPN计数第二法平板计数法
沙门氏菌检验
4.5 血清学鉴定
4.5.1 抗原的准备
一般采用1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2％～3％）培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1 mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌株接种在0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管1 次～2次，自远端取菌培养后再检查。
4.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定
在玻片上划出2个约1 cm×2 cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1 滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。
1.6 结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。
附录6
金黄色葡萄球菌检验
第一法金黄色葡萄球菌定性检验
1 操作步骤
1.1 样品的处理
称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤容器中，均质1min～2 min。若样品为液态，吸取25mL 样品至盛有225mL7.5 %氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。
1.2 增菌和分离培养
1.2.1 将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。
1.2.2 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培养18 h～24 h。Baird-Parker平板36℃±1℃培养18h～24h或45h～48h。
1.2.3 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
1.3 鉴定
1.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为
0.5μm～1μm。
1.3.2 血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mLBHI 和营养琼脂小斜面，36℃±1℃培养18h～24h。
取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2mL～0.3 mL，振荡摇匀，置36℃±1 ℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培养18h～48h，重复试验。
1.5 结果与报告
1.5.1结果判定：符合1.
2.3、1.3，可判定为金黄色葡萄球菌。
1.5.2结果报告：在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。
第二法金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数
2 操作步骤
2.1 样品的稀释
2.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的容器内，均质1min～2min，制成1:10的样品匀液。
2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
2.1.3 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
2.1.4 按1.1.3 操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。
2.2 样品的接种
根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL、0.4mL 接种量分别加10倍系列稀释入三块Baird-Parker平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。
2.3 培养
2.3.1.1 在通常情况下，涂布后，将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36℃±1℃培养1h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36℃±1℃培养，45h～48h。
2.4 典型菌落计数和确认
2.4.1 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。
2.4.2 选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在20CFU～200CFU 之间的平板，计数典型菌落数。如果：
a）只有一个稀释度平板的菌落数在20CFU～200CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的
典型菌落；
b）最低稀释度平板的菌落数小于20CFU且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；
c）某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，
应计数该稀释度平板上的典型菌落；
d）某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，但
其平板上的菌落数不在20CFU～200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；
以上按公式（1）计算。
e）2 个连续稀释度的平板菌落数均在20CFU～200CFU 之间，按公式（2）计算。
2.4.3 从典型菌落中任选5个菌落（小于5个全选），分别按5.
3.2做血浆凝固酶试验。
2.5 结果计算：
T
公式（1）：
式中
sop微生物检查操作规程
sop微生物检查操作规程 1目的 建立微生物限度检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。 2 范畴 适用于本厂质监科化验室对本厂生产的固体制剂及物料进行微生物限度的检查。 3 责任 化验员有责任按照本操作规程进行检验、判定,并对检验结果负责。 4 定义 微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及操纵菌的检查。 5 内容 5.1 总则： 5.1.1供试品应随机抽样。一样抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的 3倍量。 5.1.2 供试品在检查前不得开启，检查全过程均应严格遵守无菌操作规程，严防 再污染。 5.1.3 操纵菌的污染检查应做相应的已知菌对比试验，对比菌株为大肠杆菌 [CMCC（B）44102]，每批试验已知菌加入量为50-100个。 5.1.4 染菌量的检查或操纵菌的检查均应做空白对比试验。 5.1.5 供试品稀释成稀释液后应在平均状态下取样，凡有抑菌成份或防腐剂的供 试品应做专门处理后进行检验。 5.1.6 供试品稀释后应在1小时内操作完毕。
第2页/共6页 5.1.7 除另有规定外，细菌培养温度为30-35℃，霉菌、酵母菌培养温度为 25-28℃，操纵菌培养温度为36℃±1℃。 5.1.8细菌、霉菌检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位；操纵菌检验报告 以每1g、每1ml或每10cm2为单位报告“检出”或“未检出”。 5.2仪器、用具 恒温培养箱、隔水式生化培养箱、电子天平，移液管(1ml、10ml)、试管、离心管、双碟、镊子、剪刀、不锈钢吸管筒、酒精灯、取样勺、称量纸、研钵一个、不锈钢双碟筒。 5.2.1用具的包扎 移液管：用纱布包住移液管，然后放入不锈钢灭菌筒内。 试管、双碟：试管在管口塞上纱布棉塞、双碟放入不锈钢双碟筒内。 无菌衣、裤、帽、口罩：用布口袋将洗净的衣裤、帽子、口罩配套后装入，扎紧袋口，再用牛皮纸包好。 5.2.2用具的灭菌 将包扎好的用具，在121±0.5 ℃蒸汽灭菌柜中灭菌30 分钟，物品取出时切勿赶忙置冷处，以免急速冷却灭菌物品内蒸汽凝造成负压，易致染菌，应置烘箱烘干。 5.3培养基、试剂 5.3.1营养琼脂培养基 称取本品36克，加1升蒸馏水，加热溶解后，按需要进行分装，经121℃15分钟灭菌备用。 5.3.2虎红培养基 称本品30克，加1升蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌116℃20分钟。 5.3.3胆盐乳糖培养菌（BL） 称本品36克，加1升蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌116℃20分钟。 5.3.4曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB） 称本品42克，加1升蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌116℃20分钟。 5.3.5生理盐水 称取9 g 氯化钠，加水1000 ml 溶解，分装后于121℃±0.5℃湿热灭菌30分钟，供作稀释剂用。 5.3.6 75%酒精棉 量取无水乙醇75ml，加水稀释至100ml，摇匀，将脱脂棉与75%酒精混合即得。
临床微生物检测的基因同源性分析
临床微生物检测的基因同源性分析 医院感染的流行病学研究是临床微生物学工作者的重要课题，在医院感染监测的研究中，一个很重要的问题就是如何确定感染途径和传播途径，以采取有效预防和控制措施，从而防止医院感染或者暴发流行，因此对微生物鉴定和菌株同源性分析提出了更高的要求。 目前，传统的细菌鉴定和同源性分析技术已不能很好地满足医院感染诊断和流行病学调查的需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去认识细菌变得愈来愈重要了。近年来分子生物学的理论和技术在细菌感染诊断中的渗透和广泛应用，使得细菌鉴定、耐药基因的检测、分子流行病学调查变得更加准确、简洁和快速。细菌DNA同源性分析技术如脉冲场凝胶电泳、聚合酶链反应、DNA探针杂交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析细菌的主要手段，它在鉴定细菌感染的爆发、确定院内交叉感染、感染病原菌之间的基因同源性等方面有着重要的作用，本文将对常用基因同源性分析方法的机理和过程做简要综述。 一、质粒分型(Plasmid profile assay)： 1、原理： 质粒是可移动的染色体外元件，可以自发丢失或者被宿主稳定地获得，因此流行病学上相关的分离菌株有可能表现出不同的质粒图谱。把质粒提取出来，进行常规的琼脂糖电泳分析，就可以知道分离菌株携带质粒的大小和数目。 2、实验过程：a.质粒抽提；b.0.8%琼脂糖电泳；c.EB染色、凝胶成像。 3、实验方法的评价： 优势： a.步骤比较简单，对实验仪器要求不高。 b.在评价那些从局限的时间和地点（如一个医院中的急性爆发）分离出来的菌株非常有效。 缺点： a.实验结果的重复性不好。 b.分辨力不高。 二、染色体DNA的限制性内切核酸酶分析 (Restriction Endonuclease Assay REA) 1、原理： 限制性内切核酸酶（REA）在特异的核酸识别序列切割DNA，DNA被消化后，所得到的限制性片段的数目和大小是由酶的识别位点和DNA的组成共同决定的。在传统的限制性内切核酸酶分析中，人们用含有相对多的限制性位点的内切核酸酶消化细菌的DNA，这样就会得到成百上千条长度在0.5-50Kb范围内的DNA 片段。恒定的电场琼脂糖电泳，可以根据分子质量的大小将这些DNA片段分开，然后通过EB染色并在紫外灯下观察其图谱。同一种的不同分离菌株的DNA序列的变异可造成限制性位点数目和分布的变化，所以可以导致其REA图谱出现差异。 2、实验流程：a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA（主要是Hind III）； c.0.7%琼脂糖电泳； d.EB 染色、凝胶成像。
无菌技术操作流程(优.选)
无菌技术操作流程 评估环境 环境清洁宽敞，定期消毒，在操作前30分钟停止一切清扫活动，减少人员走动，避免尘埃飞扬，操作台面清洁干燥，操作前用消毒毛巾擦拭操作台面。 操作前准备 1、操作前检查指甲清洁，按七步洗手法洗手，戴口罩 2、用物准备：（1）检查无菌手套密封包装，型号合适，在有效期内。 （2）无菌治疗碗包无破损、无潮湿、消毒条码变色，在有效期内。 （3）无菌治疗巾无破损、无潮湿、消毒条码变色，在有效期内。 （4）无菌持物钳包无破损、无潮湿、消毒条码变色，在有效期内。 （5）无菌敷料容器消毒条码变色，在有效期内。 （6）无菌溶液瓶口无松动，瓶身无裂缝，对光检查溶液透明，澄洁、无混浊、无沉淀、无絮状物，在有效期内。 （7）棉签在有效期内，消毒液在有效期内。 （8）弯盘清洁干燥，治疗盘清洁干燥。 操作过程 一、无菌持物钳的使用法 目的：取用或者传递无菌的敷料、器械等。 流程： 1、打开无菌包，将无菌持物钳置于操作台面上，标明打开日期及时间，有效期为4小时。 2、取放无菌钳时，钳端闭合向下，不可触及容器口边缘，用后立即放回容器内， 3、取远处物品时应当连同容器一起搬移到物品旁使用，从贮槽中取物时应将盖子完全打开，避免物品触碰边缘而污染。 注意事项：无菌持物钳不能夹取油纱布和未灭菌的物品，也不能用来换药或消毒皮肤。使用无菌持物钳时不能低于腰部。 二、无菌包使用法无菌容器使用法铺无菌盘法取用无菌溶液法 1、无菌包使用法： 打开无菌包，手不可触及无菌包内面，无菌治疗巾包消毒指示条码变色，用无菌持物钳夹取无菌治疗巾放治疗盘内，无菌包内物品未用完时，按原折痕包好，系带横向结扎，有效期为24小时。 2、铺无菌盘法：上层向远端呈扇形折叠，开口边向外，治疗巾内面构成无菌区，铺无菌盘区域必须清洁干燥，无菌巾避免潮湿。 打开无菌换药碗，无菌包内物品一次用完时，一手抓住无菌巾四角，包裹另一手拿住无菌物品放于无菌巾内。 无菌容器使用法：手持无菌容器时，应托住底部，从无菌容器内夹取物品时
微生物限度检测方法验证操作规程(2015年版)
微生物限度检测方法验证操作规程 1 目的 确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。 2 依据 《中国药典》2015版。 3 范围 所有需进行微生物限度检测的产品。 4 责任 4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。 4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。 5 程序 5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。 5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。 6 内容 6.1 概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证 6.2.1 验证用菌株
铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501] 黑曲霉[CMCC（F）98 003] 白色念珠菌[CMCC（F）98 001] 6.2.2 验证用菌液制备 6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃培养5～7天，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液，备用。 6.2.3 供试液的制备 6.2.3.1 水溶性供试试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用一稀释液将
无菌技术操作规程
无菌技术操作规程 一、无菌技术操作原则 1、环境要清洁。进行无菌技术操作前半小时，必须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。治疗是每日用紫外线照射消毒一次。 2、进行无菌操作时，衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。 3、无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7 天，过期应重新灭菌。 4、工作人员面向无菌区域，用无菌取无菌物品，手臂须保持在腰部水平以上，不可触及无菌物或跨越无菌区，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 5 进行无菌操作时不可面对无菌区讲话、打喷嚏。怀疑无菌物品被污染，不可使用。 6 进行无菌操作时如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用可，应更换或重新灭菌。 7、一套无菌物品，只能供一个病人用，以免发生交叉感染
二、准备质量标准 1、工作人员着装整洁，洗手、戴口罩、修剪指甲。 2、备齐用物。 3、治疗盘、无菌持物钳或镊，浸泡于消毒液溶液内，无菌溶液、无菌包布、无菌容器及物品、无菌手套、弯盘、75％酒精、无菌棉签。 4、查对无菌物品、灭菌日期及手套好。 5 用物排放有序，符合无菌操作要求。 三、操作流程质量标准 1、选择清洁、干燥、宽阔的场所进行操作。 2 无菌持物钳使用法： 无菌持物钳须置于无菌容器内，有效期限 4 小时；取、放无菌持物钳时，应将盖打开，钳端闭合，不可在盖孔中取、放；如需取远处物品时，应连同容器一起搬移，就地取出无菌物品。 3、无菌包使用法： 1）、查看无菌包的名称、灭菌日期，查看化学指示胶带粘贴。 2）、将无菌包放在清洁、干燥处，撕开粘贴。 3）、用拇指和食指先揭开左右两角，最后揭开内角，注意手不可触及包布的内
表面微生物测试标准操作规程
表面微生物测试标准操作规程（接触平皿法） 1．目的 建立表面微生物测试标准操作规程，保证测试人员操作规范化、标准化。 2．依据《药品生产质量管理规范》（2010年修订本） 3．范围 本规程适用于本公司对洁净区的表面微生物的检测。 4．责任 质量控制化验员负责实施，QC主管负责监督执行 5．内容 洁净区微生物测试点选择表面微生物监测的采样点数目及其布局根据以下几个方面设置： 空调系统验证的结果 房间的大小和布局 房间的用途 与产品的距离 人流物流方向 如何布点：对于同一洁净区，每个相同的取样物体在其不同的地方采2个样。如墙面2个采样点，地面2个采样点，洁净区主要设备2个采样点。
注：表面微生物监测的取样点数应依下列因素确定： 1.洁净区（室）的大小； 2.设备、管路等的复杂程度； 3.生产活动的重要性； 4.易受污染的部位等。 应考虑包含以下部位：每扇门、每个门把手、地板（至少两点）、墙壁（不易被清洁/消毒的部位，至少两点）、公用介 质的管路（不易被清洁/消毒部位）、生产设备的关键性部位（如灌装针、易与人员接触的塑料帘膜、胶塞筒、传输带）等。根据洁净区内设施、设备等表面对产品和洁净室环境的影响程度，通常将表面分为三类：关键表面（与产品、容器及密封件直接接触或暴露于产品、容器及密封件的表面）一般表面（如设备的外表面、墙壁等）和地板，并且分别设定不同的微生物限度要求。 表面微生物的每点取样面积宜控制在25cm2左右。 为避免干扰，宜在生产活动结束后取样。 洁净区微生物测试频率和限度 日常监控一月一次 接触碟（55mm）50cfu/25cm2 ，警戒40cfu/25cm2 ，纠偏 45cfu/25cm2 。 洁净区表面微生物测试方法（接触平皿法）。 洁净区表面微生物测试必须在动态下监测。
微生物检验操作规程
微生物检验操作规程 1.0目的 建立微生物检验标准操作规程，保证检验操作规范化。 2.0适用范围 适用于本公司相关的微生物检验活动的全过程。 3.0职责 3.1 微生物检验员负责微生物检验的全过程； 3.2 QC主管负责监督检查本规程的有效实施。 4.0作业内容 4.1无菌操作要求 4.1.1 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 4.1.2专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 4.1.3 接种样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 4.1.4 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 4.1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 4.1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都要通过火焰消毒。
4.1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。 4.1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。4.2无菌间使用要求 4.2.1 无菌间内应保持清洁，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 4.2.2无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4.2.3处理和接种样品时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 4.3消毒灭菌要求 4.3.1灭菌前准备 （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶，内容物不应超过总体积的2/3（例如500mL的三角瓶最好装300～350mL培养基，以防再次加热融化时爆沸）。 （3）无菌室内使用的毛巾、脱脂棉球用纸包裹，进行湿热灭菌。 4.3.2装放 （1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。 （2）大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。
微生物标准操作规程三10
摩根菌属检验标准操作规程 1．概述 摩根菌属只有1个种，即摩根摩根菌，又分为摩根亚种、塞氏亚种和生物群I。 2．标本类型 血液、尿液、痰、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。 3．鉴定 3.1 形态与染色革兰阴性杆菌。 3.2 培养特性在血琼脂平板上35℃培养18～24小时呈灰白色菌落。在麦康凯琼脂平板上呈无色、半透明的菌落。 3.3 生化反应氧化酶试验阴性，发酵葡萄糖，不发酵甘露醇、乳糖、蔗糖，动力、脲酶和苯丙氨酸脱氨酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验为阳性，VP、枸橼酸盐、精氨酸双水解酶试验均为阴性，TSI为K／A，IMViC+ + - -。 3.4 鉴别要点 3.4.1 本菌属特征麦康凯琼脂平板上形成无色的菌落，IMViC+ + - - ，脲酶、苯丙氨酸脱氨酶试验阳性。 菌名吲哚赖氨酸动力（36℃）海藻糖甘油摩根摩根菌95 1 95 0 5 摩根摩根菌生物Ⅰ群100 100 0 0 100 摩根摩根菌塞氏亚种50 29 79 100 7 3.5 操作步骤 3.5.1 氧化酶试验参见《氧化酶试验标准操作规程》。 3.5.2 鉴定从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。 4．药敏 参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100一$20最新版本文件。 5．质量控制 见《质量管理程序》。 6．检验结果解释与分析 摩根菌属的特征是枸橼酸盐和阿东醇试验阴性而鸟氨酸脱羧酶试验阳性。 7.临床意义 摩根摩根菌存在于人类、犬和其他哺乳动物及爬行动物的粪便中，是条件致病菌和继发感染菌，可引起呼吸道、泌尿道和伤口感染以及菌血症等，也是医源性感染的病原菌。
8.鉴定流程
2015年版微生物限度检验操作规程完整
**文件 目的建立微生物限度检查操作规程，规操作，保证结果的准确性。 围成品、辅料、包装袋及纯化水的检验。 责任品管部微生物限度检验人员 容 概述：本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。 微生物计数法 一、计数方法 1、微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。 3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。 4、菌种及菌液的制备 4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验见表1。 4.2菌液制备按表1规定培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢
子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时使用；若保存在2-8℃，可在24小时使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期使用。 4.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。 4.4培养基适用性检查按照表1规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2围，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。 5、计数方法适用性试验 5.1供试品制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采用适宜的方法制备供试液。制备时若需加温应加热均匀且温度不得超过45℃。供试液从制备到加入检验用培养基不得超过1小时。
临床微生物室标准操作程序
遂昌县中医院 临床微生物室 标准操作程序 SOP
临床微生物室标准操作程序（SOP）目录 1.标本采集与送检原则标准操作程序----------------------WSW-SOP-1 2.血液及骨髓标本的采集标准操作程序——————————WSW-SOP-2 3.呼吸道标本留取标准操作程序—————————————WSW-SOP-3 4.尿液标本留取标准操作程序——————————————WSW-SOP-4 5.脓及创伤感染标本留取标准操作程序——————————WSW-SOP-5 6.生殖道分泌物标本采集标准操作程序——————————WSW-SOP-6 7.粪便标本采集标准操作程序——————————————WSW-SOP-7 8.穿刺液标本留取标准操作程序--------------------------WSW-SOP-8 9.脑脊液、胆汁标本采集标准操作程序——————————WSW-SOP-9 10.组织标本的采集标准操作程序—————————————WSW-SOP-10 11.静脉道管标本采集标准操作程序————————————WSW-SOP-11 12.眼、耳及乳突分泌物标本采集标准操作程序———————WSW-SOP-12 13.样本接收、核对、接种、培养标准操作程序———————WSW-SOP-13 14.菌株的纯化、鉴定、药敏流程标准操作程序———————WSW-SOP-14 15.普通MicroScan板接种培养流程标准操作程序——————WSW-SOP-15 16.判读普通革兰阳性板标准操作程序----------------------WSW-SOP-16 17.判读普通革兰阴性板标准操作程序----------------------WSW-SOP-17 18.普通Microscan 板报告标准操作程序--------------------WSW-SOP-18 19.常见标本培养结果解释标准操作程序--------------------WSW-SOP-19 20.KB法药敏试验标准操作程序----------------------------WSW-SOP-20 21.超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)检测标准操作程序——————WSW-SOP-21 22.β-内酰胺酶检测标准操作程序-------------------------WSW-SOP-22 23.革兰染色标准操作程序————————————————WSW-SOP-23 24.抗酸染色标准操作程序————————————————WSW-SOP-24 25.解脲/人型支原体培养标准操作程序---------------------WSW-S O P-25 26.AccuStep衣原体抗原检测标准操作程序------------------WSW-SOP-26 27.ATB FUNGUS2真菌药敏标准操作程序--------------------WSW-SOP-27 28.培养基的制备标准操作程序-----------------------------WSW-SOP-28 29.触酶试验标准操作程序---------------------------------WSW-SOP-29 30.氧化酶试验标准操作程序-------------------------------WSW-SOP-30 31.芽管试验标准操作程序---------------------------------WSW-SOP-31 32.临床微生物实验室安全标准操作程序---------------------WSW-SOP-32
无菌技术操作流程及评分标准
无菌技术操作流程 开始：各位老师下午好，我操作的项目是无菌技术操作。 1. 无菌技术操作的目的：保持无菌物品无菌区域不被污染，防止一切微生物侵入机体，避免给患者带来不应有的损失和危害 2. 环境评估：操作前30分钟停止清扫，操作中减少人员走动，开窗、通风、换气，操作台宽敞、平坦、整洁、干燥。 3. 用物准备：治疗盘无菌包：包内置无菌巾若干无菌容器内置无菌持物钳棉签无菌包：内置治疗碗一个，镊子两把，弯盘一个无菌纱布罐无菌棉球罐无菌生理盐水一次性无菌手套 铺无菌盘 1. 洗手戴口罩。 2. 治疗盘清洁，干燥。铺无菌换药盘。 3. 开无菌包：（化学指示胶带有变色，在有效期内，无潮湿、无破损。）斜角打开（打开无菌包内角时，手不可触及包布内面，不得跨越无菌区域）看化学指示卡，有变色。用无菌持物钳夹取一块无菌巾放入治疗盘内，将无菌包按原折痕“一字”包好后，看时间：记录日期、时间、并签名、24 小时内有效。 4. 铺无菌巾：双手捏住无菌巾一侧两角外面轻轻抖开，由近及远的将治疗巾一半铺于治疗盘上，将上下对齐后上层扇形折三次，开口外边向外，使治疗巾内面构成一无菌区。 5. 开无菌包，（指示胶带变色，在有效期内，侧孔、底孔闭合） 1）打开无菌包，看化学指示卡变色 2）用无菌钳分别取治疗碗（内含两把镊子）、弯盘放入无菌盘内。 3）打开无菌纱布罐夹取纱布置无菌盘内；同法夹取无菌棉球置治疗碗内（手不可触及容器边缘或内侧），无菌容器盖内面朝下直接盖上。 6. 倒无菌溶液：（拿起溶液瓶，看瓶签）口述：瓶身干净，标签完整、字迹清楚， 0.9%Nacl500ml，在有效使用期内，瓶盖无松动，瓶身瓶底无无裂缝，对光检查：（溶液澄清、无杂质）。除盖：查棉签（无漏气，在有效试用期内）写好开包日期，消毒瓶盖、手指，开瓶盖。倒溶液于治疗碗内，再次消毒瓶口，盖回瓶盖看时间：记录日期、时间、签名，（24 小时有效）。 7. 铺完盘，看时间口述：记录名称、时间并签名（小标签贴于盘缘）、4 小时内有效。述：已铺好换药盘，可以给病人进行换药护理。一份无菌物品只供一位病人使用，以防交叉感染。 带无菌手套 1．检查手套：7 号无菌手套，在有效使用期内，无潮湿、破损，将手套放置于操作台，打开手套，戴手套，戴手套时应防止手套外面（无菌面）触及手套内面及非无菌物品或区域。为使手套与手贴合，可双手交叉互推。边做边口述：手套完好无破损，可进行无菌操作。3．脱手套，置于医疗垃圾桶内，将用物推至处置室归类处理。 无菌技术操作原则：
微生物检验操作规程
微生物检验操作规程 1.目的 为规范微生物检验员的工作流程及检验方法，确保检测数据的准确性及生产环境的卫生条件符和前提方案的要求，特制订本规程。 2.职责 微生物检验员负责按本规程进行微生物检验及记录的填写整理。 3.商业无菌检测 3.1抽样方法 以《成品留样管理规定》商业无菌检测留样。 3.2检测范围 公司生产各品类产品(发酵核桃乳除外)。 3.3检测方法 GB4789.26-2013 《食品微生物学检验商业无菌检验》。 3.3.1操作 样品准备：每个批次取3听样品，在包装容器表面用防水油性记号笔标注样品编号，观察并记录时否有泄露、包装是否有小孔，锈蚀，压痕、膨胀及其它异常情况。 称重：准备好的样品每个批次取2听称重，精确到1g，并记录。 保温：准备好的样品每个批次取剩下的1听置于2℃~5℃冰箱保存作为对照，称重后样品于36±1℃的恒温箱中保温10天，每日观察，保温期间如有胖听、泄漏及时剔除并开罐检查。
保温结束后，再次称重并记录，比较保温前后有无变化。如变轻，表明样品发生泄漏，并记录。将所有包装物置于室温直至开启检查。 开启：如有膨胀的样品，将样品先置于2℃~5℃冰箱冷藏数小时后开启。 如有膨胀样品用冷水和洗涤剂清洗待检样品光滑面，水冲洗后用无菌纱布擦干。以含4%碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面15min后用无菌纱布擦干，用酒精灯将表面残余的碘乙醇溶液全部燃烧完。 在百级洁净实验室内将保温后样品摇匀，用无菌镊子开启，开罐时不得伤及卷边结构，在开启下一个样品前应将镊子在火焰下灼烧灭菌。 留样：开启后用灭菌移液器无菌取出至少30ml至灭菌容器中，做好标记了，保存2-5℃冰箱中，有需要可用于进一步实验，待该批样品得出检验结论后可弃去。 感官检查：开启后，将样品内容物倒入透明玻璃瓶中，观察其组织形态，色泽和气味有无腐败变质迹象并记录。 pH测定：被测液温度应调到20±2℃，与对照样品比较是否有显著差异，pH 相差0.5及以上为显著差异。 涂片：用无菌接种环挑取样液涂于载玻片上，待干后用酒精灯火焰固定，然后向载玻片上滴一滴结晶紫，覆盖固定的料液1min，用蒸馏水小流沿载玻片一端冲洗，待冲洗后水不为紫色为止，自然干燥。 镜检：至少观察5个视野，记录菌体形态特征及每个视野的菌数，与同批冷藏对照样比较，判断是否有明显微生物增殖现象，菌数有百倍或百倍以上增长判为明显增殖。 3.3.2判定
临床微生物学检验
临床微生物学检验 确保高压效果的可靠性。 【适用范围】 蒸气式高压锅。 【该SOP变动程序】 本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。 【操作方法】 1．将水加到高压锅内至其刻度线，将欲灭菌物品放入锅内，关闭锅门，拧紧螺丝并确认已经封闭。 2．打开排气阀。 3．打开蒸汽开关，向锅内输入蒸汽或接通电源，使产生蒸汽。 4．观察排气阀的排气情况，待排出的气体由冷气变为蒸汽，压力表达到0.05mPa 时，关闭排气阀。 5．观察压力表，当压力升至0.15mPa时，开始计时。 6．压力达0.15mPa后，可调节进气阀，减少进气量，维持压力并使其稳定在 0.15mPa。电加热时，可切断电源，维持压力持续15分钟，至多不超过30分 钟，否则营养物质破坏。 7．关闭进气阀门或切断电源，让锅内物品自然冷却，不可马上打开排气阀，以免发生意外。 8．待锅内压力降为零时，可打开锅盖，取出物品。 操作人员部门主管质量负责人姓名唐玉贞检验科检验科 日期 06年06月06日
确保培养箱温度恒定。 【适用范围】 各种类型隔水式、温度设定为27℃、35℃、42℃、56℃培养箱。 【该SOP变动程序】 本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。 【操作方法】 1．培养箱应放置于水平地面（或坚固的水平台），电源电压须匹配。 2．从注水口先将隔水箱内的水注满到浮标要求的位置。 3．将温度调节旋扭调至所需温度，然后将电源开关拨至“开”处。 4．每次使用时应在培养箱顶部插入标准温度计，监测实际温度。 5．培养箱工作温度波动范围应控制在±10C以内。 6．培养箱正面贴有温度记录表，记录每天上班和下班时温度，如温度超出正常范围，指示该温度的刻度应划上红圈，并把修正温度记录下来。 7．培养箱内外应保持清洁。 操作人员部门主管质量负责人 姓名唐玉贞检验科检验科 日期 06年06月06日
无菌操作规程
无菌操作规程 （一）无菌技术操作原则 1、环境要清洁。进行无菌技术操作前半小时，须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。治疗室每日用紫外线照射消毒一次。 2、进行无菌操作时，衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。 3、无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌物品一经使用后，必须再经无菌处理后方可使用，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 4、无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7-14天，过期应重新灭菌。 5、取无菌物品时，必须用无菌钳（镊）。未经消毒的物品不可触及无菌物或跨越无菌区。 6、进行无菌操作时如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，应更换或重新灭菌。 7、一套无菌物品，只能供一个病员使用，以免发生交叉感染。（二）准备质量标准 1、工作人员着装整洁，洗手、戴口罩、修剪指甲。 2、备齐用物。
3、治疗盘、无菌持物钳或镊，浸泡于消毒溶液内，无菌溶液、无菌包布、无菌容器及物品、无菌手套、弯盘、75%酒精、无菌棉签。 4、查对无菌物品、灭菌日期及手套号。 5、用物排放有序，符合无菌操作要求。 （三）操作流程质量标准 1、选择清洁、干燥、宽阔的场所进行操作。 2、解开无菌包系带卷放在包布下边。 3、用拇指和食指先揭左右两角，最后揭开内角，注意手不可触及包布的内面。用无菌钳（镊）取出一块无菌巾放于治疗盘内，剩余部分按原折痕包起扎好，并注明开包时间。 4、铺无菌盘： 单巾铺盘：双手拇、食指捏住治疗巾两上角外面，轻轻抖开，双折铺于治疗盘上，内面为无菌区，盖的半幅成扇形折到对面无菌盘上，开口边向外，放入无菌物品后，边缘对齐盖好。将开口处向上翻折两次，两侧边缘向下翻一次，以保持无菌。 双巾铺盘：双手捏住无菌巾的左右两上角的外面，轻轻抖开，由远向近铺于治疗盘上，无菌面向上，放入无菌物品。依上法夹取另一块无菌巾，由近侧向对侧覆盖于治疗盘内上，边缘多余部分反折，不应暴露无菌区。 5、打开无菌容器盖，必须把盖的无菌面（内面）向上，放在稳妥处，夹取所需物品放入无菌盘内后立即盖严。 6、倒无菌溶液，仔细检查核对溶液后，面对瓶签两拇指将橡皮
微生物检验操作规程样本
微生物检验操作规程
1. 目的 建立微生物检验标准操作规程, 保证检验操作规范化。 2. 范围 适用于本公司相关的微生物检验活动的全过程。 3. 职责 3.1 微生物检验员负责微生物检验的全过程; 3.2 QC主管负责监督检查本规程的有效实施。 4. 操作规程 4.1 微生物检验玻璃器皿吸管的洗涤 4.1.1 一般的玻璃器皿( 例如培养皿、试管、三角瓶等) , 可用毛刷及洗涤剂洗去灰尘、油垢, 然后用自来水、蒸馏水充分冲洗, 直至玻璃器皿内壁均匀分布一层薄的水膜, 即器壁既不挂水珠也无条纹, 即洗涤达到标准。 4.1.2 玻璃器皿内有污迹不能洗净时, 可浸泡于洗液中, 待器皿中有机物氧化分解后, 取出用自来水、蒸馏水冲洗干净, 备用。 4.1.3 新购的玻璃器皿先用2％盐酸浸泡, 再用用自来水、蒸馏水充分冲洗。 4.2 器皿的包扎 4.2.1 试管: 塞上胶塞, 然后用牛皮纸或报纸把试管头包扎起来。做发酵试验时, 将试管头塞上专用的耐高温PVC试管帽。 4.2.2 三角瓶、抽滤瓶: 将三角瓶( 抽滤瓶) 口塞上胶塞, 然后用牛皮纸把塞头部包起来。
4.2.3 吸管: 将耐高温的移液枪头装盒, 用用牛皮纸或报纸包裹。 4.2.4 平皿: 10个为一组, 用牛皮纸包裹。 4.3消毒和灭菌: 4.3.1 化学灭菌: 此法适用于微生物操作过程中不能加热、紫外线的地方。如人手等。 ( 1) 用75%的乙醇溶液或0.1%新洁尔灭擦拭或浸泡。 ( 2) 一般用1～2%的甲醛液浸泡软管和用具。 ( 3) 一般成品漂白粉的有效成分是25～32% 。使用时配成有效成份的2%溶液洒在地面或容器内, ( 对金属有腐蚀作用) 放置10～15min后冲洗即可。 ( 4) 氯灭菌剂的能力以有效氯表示, 将氯水配制成50～100PPm 的有效氯溶液, 可用于浸泡, 冲洗和表面杀菌。但氯对金属有腐蚀作用。 4.3.2 物理灭菌: 4.3.2.1 干热灭菌: 适用于干燥的玻璃器皿( 吸管、平皿等) 、金属器具( 镊子等) 、固体试液、液状石蜡等。灭菌条件一般选用在160℃干热空气灭菌2h。 ( 1) 器具用牛皮纸或灭菌袋包( 装) 扎, 放入金属容器内。 ( 2) 器具在干燥箱加热前放入, 每个器具之间留有足够的空隙, 使热 空气能畅通。 ( 3) 关闭箱门接通电源, 打开通气孔, 使箱内湿空气能逸出, 至箱内温度达到100℃时关闭。 ( 4) 加热至160℃, 保持2小时。
微生物限度检查操作规程中国药典四部通则样本
—、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。 二、 引用标准：《中国药典》( 通则1105-1106) 三、 目录1.微生物限度标准 2.设备.仪器及用具 3?消毒液、稀释剂.试液及培养基 4. 检查总则(通则1105:非无菌产品微生物限度检查：微生 物计数法，通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法) 5. 微生物计数法检查 6. 控制菌检查法 7. 实验技术 &附件 1. 微生物限度标准 非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准 *未做统一规定。 L1成品微生物限度标准
(1).” 一”为不得检出。 (2).目测霉变者以不合格论。 (3).”无”为标准依据或无相应规定。 1.2工艺用水微生物限度标准 1.3内包装材料微生物限度标准 说明：1?”一”为每100 cm2中不得检出。2.目测霉变者以不合格论。3.”无”为标准依据或无相应规定。 2.设施、仪器及用具
2.1、设施： 2丄1?微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台直及环境应定期进行监测。 2.12其它设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30?35?）;霉菌培养箱（25-280 ；电炉（或其它适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300匕）；电冰箱。生化试剂储存箱。 2.2仪器及器mi 2.2.1.菌落计数器；显微镜（1500X）;电子天平或药物天平（感量O.lg）; pH系列比色计。 222?玻璃器皿：锥形瓶（250?300ml,内装玻璃珠若干）.研钵（玻璃或陶瓷制,f 10?12cm）、培养皿（f 9cm）.量筒（100ml）.试管（18x 180mm）及塞、吸管（lml分度0.01, 10ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。 2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%?2%盐酸（工业用）液中约2?6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。用于化学分析的玻璃仪器，需用重洛酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2?3次，晾干备用。 2.3用过的玻璃器皿： 231未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外， 可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备 用。容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗 2~3 次。
药品微生物限度检验方法标准操作规程
药品微生物限度检验方法标准操作规 程
标准操作规程 目的：建立一个药品微生物限度检验标准操作规程。 范围：适用于本企业生产的所有品种，本企业所有洁净生产区域，QC微生物限度检查室，洁净工作室等。 责任者：QC主任、化验员。 规程： 本规程引至《中国药典》。 1. 概述：微生物限度检查系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。我公司QC设无菌操作室，用于微生物限度检查。无菌操作室的管理及使用制度见本文附录一。 2. 抽样：供试品应按批号随即抽样，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍。抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应缺陷选用疑问的样品，但因机构损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药
品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。 3. 供试品的保存：供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。 4. 检查： 4.1. 使用设备：电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75％酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。 4.2. 检查的全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。使用设备、仪器、人员及无菌操作室常见的消毒、灭菌方法见本文附录二。除另有规定外，供试品制备成供试液后，均在均匀状态取样。制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。 标准操作规程 4.3. 培养：除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30－35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25－28℃，控制菌培养温度为36±1℃，检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。 4.4. 复检
版药典表面微生物检测操作规程
1.目的：建立表面微生物测试标准操作规程，保证测试人员操作规范化、标准化。 2.范围：适用于洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物量的测试。 3.责任：表面微生物检测员。 4.内容： 4.1基本概念： 4.1.1菌落:细菌培养后,由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落,简称CFU.通常用个数表示。 4.1.2表面微生物： 4.1.3表面微生物菌落数: 规定面积的洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面，用接触平皿法或擦拭法检测的微生物的菌落数目，以个/皿表示。 4.2测试原理: 本测试方法利用接触平皿法或擦拭法收集洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物，经若干时间，在适宜的方法和条件下让其繁殖到可见的菌落数，以平板培养皿中的菌落数来评定洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物数，并以此来评定洁净区的洁净度。 4.3测试方法： 4.3.1使用的仪器设备和培养基: 高压消毒锅:使用时应严格按照操作规程进行。 恒温培养箱:必须定期对培养箱的温度计进行检定。 培养皿:一般采用φ90mm×15mm玻璃培养皿。使用前将培养皿置于160℃干热灭菌120min。 接触碟：一般采用φ55mm无菌接触碟。 培养基:胰酪大豆胨琼脂培养基。 将培养基加热熔化，冷却至约45℃在无菌操作条件下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。待琼脂培养基凝固后，将培养基平皿放入32℃恒温培养箱中培养
72小时若培养基平皿上确无菌落生长即可供采样用，制备好的培养基平皿应在2-8℃的坏境中存放。 4.3.2采样点选择： 洁净区微生物测试点选择表面微生物监测的采样点数目及其布局根据以下几个方面设置： 空调系统验证的结果 房间的用途 与产品的距离 人流物流方向 如何布点：对于同一洁净区，每个相同的取样物体在其不同的地方采2个样。如墙面2个采样点，地面2个采样点，洁净区主要设备2个采样点。 注：表面微生物监测的取样点数应依下列因素确定： 1.洁净区（室）的大小； 2.设备、管路等的复杂程度； 3.生产活动的重要性； 4.易受污染的部位等。 应考虑包含以下部位：每扇门、每个门把手、地板（至少两点）、墙壁（不易被清洁/消毒的部位，至少两点）、公用介质的管路（不易被清洁/消毒部位）、生产设备的关键性部位（如灌装针、易与人员接触的塑料帘膜、胶塞筒、传输带）等。根据洁净区内设施、设备等表面对产品和洁净室环境的影响程度，通常将表面分为三类：关键表面（与产品、容器及密封件直接接触或暴露于产品、容器及密封件的表面）一般表面（如设备的外表面、墙壁等）和地板，并且分别设定不同的微生物限度要求。 表面微生物的每点取样面积宜控制在25cm2左右。为避免干扰，宜在生产活动结束后取样。 4.3.3采样方法： 洁净区表面微生物测试方法。 4.3.3.1接触平皿法： 取样：表面微生物监测用于表面菌监测，接触平皿法广泛应用。取样时，打开碟盖，无菌培养基表面与设备直接接触，均匀按压接触碟底板，确保全部琼脂表面 取样后，需要立即用75%酒精擦拭被取样表面，以除去残留琼脂。 收好的营养琼脂接触碟在32℃培养72小时。 4.3.3.2棉签擦拭法：