无菌检测方法

四川乐至贵均卫生材料有限公司医疗器械产品无菌检测方法

1.目的

建立无菌检测标准规程，对灭菌后的医疗器械产品进行无菌检测，以确定灭菌的有效性。

2.范围

本规程适用于本公司对医疗器械产品的无菌检测。

3.依据

《中国药典》2015版

4.设备、器皿、药品的准备

4.1 设备的准备

电子天平、干热灭菌箱、高压灭菌箱、洁净工作台、放大镜、移液枪、电热培养箱、霉菌培养箱、冰箱、斜口钳、接种环、酒精灯

4.2 器皿的准备

锥心瓶（500ml）、烧杯（1000ml）、试剂瓶（60ml）、量筒（50ml、1000ml）、培养皿（Ф90mm ×15mm）、斜口钳、玻璃棒。

4.3 药品的准备

硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、纯化水、pH7.0 无菌氯化钠溶液。

5.器皿的清洗

将所需的锥形瓶、烧杯、试剂瓶、培养皿、玻璃棒放入超声波清洗机中用纯化水清洗两次，每次15分钟，将清洗完的器皿在180℃条件下进行干热灭菌2小时。

6.取样

按灭菌批次或者生产批次进行取样，随机抽取同一型号的产品4件作无菌检测样品7.培养基的制备

7.1 硫乙醇酸盐流体培养基的制备

取15g硫乙醇酸盐流体培养基和1000ml纯化水于烧杯中混合，加热至微沸（注意加热过程中要不断地搅拌，使其混合均匀）用棉花塞塞紧复用无尘布和绳子绑好后转移至高压灭菌锅内灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间30分钟。灭菌后摇均，冷却至45℃待用。

7.2 胰酪大豆胨液体培养基的制备

取15g胰酪大豆胨和1000ml纯化水于烧杯中混合，操作方法同6.1。

8. 培养基灵敏度检查

8.1 菌种的要求

培养基灵敏度检查所用的菌株（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）传代次数不得超过5代。

8.2 菌液的制备

接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基上，30-35℃培养24小时；接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基上，20-25℃培养24小时。

将上述经24小时培养后的培养物用0.9﹪无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu(菌落形成单位)的菌悬液。制备好的菌液应在2-8℃条件下保存，并在24小时内使用。

8.3 接种及培养

取每管装量15ml的硫乙醇酸盐流体培养基3支，其中2支接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌，另一支不接种作为空白对照，30-35℃培养3天逐日观察并记录。

取每管装量10ml的胰酪大豆胨液体培养基3支，其中2支接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌，另1支不接种作为空白对照，20-25℃培养5天，逐日观察记录。

8.4 灵敏度检测结果判断

空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基试管菌落均生长良好，则判定该培养基的灵敏度检查符合规定。

9. 供试品的无菌检测

9.1 对照试验

取每管装量15ml的硫乙醇酸盐流体培养基3支，接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌，另一支不接种作为空白对照，30-35℃培养14天逐日观察并记录。

取每管装量10ml的胰酪大豆胨液体培养基3支，其中2支接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌，另1支不接种作为空白对照，20-25℃培养14天，逐日观察记录。

9.2 供试品的准备及接种

于微生物实验室超净工作台内将样品剪成小碎段（2～3cm）,其中2件接种于各培养皿足以浸没供试品的适量硫乙醇酸盐流体培养基中，另外2件接种于各培养皿足以浸没供试品的适量胰酪大豆胨液体培养基中，冷却。

9.2 培养

将接种过的硫乙醇酸盐流体培养基的培养皿倒置于电热培养箱中30～35℃条件下培养14天，逐日观察是否有菌落生长并记录；

将接种过的胰酪大豆胨液体培养基的培养皿倒置于霉菌培养箱中20～25℃条件下培养14天，逐日观察是否有菌落生长并记录。

10. 供试品无菌检测结果判定

若上述接种后的培养基经14天培养后均无菌落生长，则可判定供试液为无菌，即为合格；反之，则为不合格。

11. 无菌检测报告（见附表1）

细菌鉴定及检测方法

细菌鉴定及检测方法 一、启动条件 1、目的样出现坏包，若批次相同，取表现性状相同的任意一包进行细菌初步鉴 定。若批次不同则分别进行细菌初步鉴定。 2、随机样出现坏包，必须进行细菌初步鉴定。 二、胀包 1、记录批次。 2、及时用72%的酒精对样品的外表进行消毒，尽量不损坏封合待以后检查。在 超净台内以无菌操作剪开包装，再避开横竖封处剪开一个圆形或三角形。3、对样品进行微生物划线培养。 3.1采用普通营养琼脂培养基做细菌的划线培养36±1℃、48小时。 3.2分别吸取10毫升样品到两个无菌的小试管中，，分别在80和100℃的水 浴中加热10分钟，冷却用营养琼脂分别做芽孢（36±1℃、72小时） 和耐热芽孢（55±1℃、72小时）的划线培养。 3.3采用普通营养琼脂培养基或快速检测培养基做嗜冷菌/低温菌的划线培 养（4—6℃ 10天或21±0.5℃ 25小时）。 3.4 必须用高盐察氏或虎红琼脂培养基做霉菌和酵母菌的划线培养 （25—28℃ 5--7天） 4、对样品做感官检测。 5、用PH计检测样品的PH值。 6、将样品倒掉，进行包装密封性检查，并进行记录。 7、记录菌落特征。 8、选区不同形态的单一菌落进行坚定。 8.1 革兰氏阴性菌和阳性菌的鉴定： 8.1.1涂片、革兰氏染色、镜检。或结晶紫染色、镜检、氢氧化钾拉 丝试验。 8.1.2革兰氏染色、结晶紫染色方法见《微生物检测》 8.1.3氢氧化钾拉丝试验 在微生物载物片上滴一滴3%氢氧化钾，用接种针从培养皿上的

菌落中挑取微生物，放在氢氧化钾溶液中用力搅拌。7—10秒后，抬 起针头，观察针头和玻片之间是否有丝状物，如果15—20 秒后二者 之间无丝状物，停止搅拌。 判定：无丝状物阳性；有丝状物阴性。 8.2 过氧化氢酶试验（或过氧化氢酶试纸）（产气试验）： 试剂：10%过氧化氢溶液 步骤：在微生物载物片上滴一滴10%过氧化氢，用接种针从培养皿上的菌落中挑取微生物，放在过氧化氢溶液中看是否有气体产生。 判定：产气阳性；不产气阴性。 8.3氧化酶试验 试剂：含1%四甲基双噻二胺和99%的乙醇溶液。 步骤：用上述试剂将一张滤纸浸透（或直接采用氧化酶试纸条），然后进行细菌培养物的涂片试验。 判定：30秒内使显色物质变为深蓝色阳性，不变色阴性。 三、酸包 1、发现酸包后，及时将料液快速转入无菌瓶中。 2、记录批次 3、其它项目检测同胀包。

产碱性蛋白酶菌株的筛选_分子鉴定及其酶学性质的初步研究

碱性蛋白酶是在碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，一般最适pH值为9~11，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，主要用于加酶洗涤剂中，在制革、纺织、医药、化妆品等的生产中也有广泛的应用[1]。目前，全世界所生产的酶中碱性蛋白酶占到总产量的30%左右，显示出良好的使用性能和经济价值。 碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，其中以芽孢杆菌属的碱性蛋白酶研究的最深入。本实验从山东东营的盐碱地采集土样，从中分离出若干株产碱性蛋白酶的菌株，并对其进行16S rRNA分子鉴定以及酶学性质的初步研究，以期为工业应用提供基础理论依据。 1材料与方法 1.1土样来源 山东东营盐碱地中采集土样。 1.2培养基 富集培养基：牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、NaCl0.5g、水 产碱性蛋白酶菌株的筛选、分子鉴定及其酶学性质的初步研究 成堃，路福平*，李玉，王盛楠，王建玲 （天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院，天津300457） 摘要：从盐碱地土壤中筛选到5株产碱性蛋白酶的细菌，分别命名为TCCC11001、TCCC11004、TCCC11013、TCCC11024、TC-CC11029。将其革兰氏染色、16S rRNA鉴定为Bacillus subtilis、Bacillus alcalophilus、Bacillus pumilus、Bacillus subtilis、Bacillus licheni-formis。将菌株接入发酵培养基中，37℃、180r/min摇床培养48h，发酵液进行不同处理后Folin法测定酶活。结果发现：TCCC11001、TCCC11029的最适作用温度为40℃，TCCC11004、TCCC11013、TCCC11024的最适作用温度为50℃；TCCC11001、TCCC11004、TC-CC11013、TCCC11024、TCCC11029的最适作用pH值分别为10.0、11.0、10.0、9.0、11.0；TCCC11004、TCCC11013于40℃保温2h，残留酶活为最高酶活70%；TCCC11001、TCCC11024、TCCC11029的残留酶活＜50%。DFP、PMSF完全抑制酶的活性，表明5种蛋白酶是典型的丝氨酸蛋白酶。 关键词：碱性蛋白酶；芽孢杆菌；分子鉴定；热稳定性 中图分类号：Q93-331；Q55文献标识码：A文章编号：0254－5071（2009）02-0033-04 Screening,molecular classification of alkaline protease-producing strains and enzyme characteristics CHENG Kun,LU Fuping*,LI Yu,WANG Shengnan,WANG Jianling (Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology,College of Bioengineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin300457,China) Abstract：5strains which could produce alkaline protease were isolated from soil and named TCCC11001,TCCC11004,TCCC11013,TCCC11024 and TCCC11029.They were regarded as Bacillus subtilis,Bacillus alcalophilus,Bacillus pumilus,Bacillus subtilis,Bacillus licheniformis after deter-mination of16s rRNA and Gram staining.Enzyme activities were determined after incubating these strains at37℃,180r/min for48h.The results showed the optimal temperature of TCCC11001and TCCC11029was40℃,and for the others,the temperature was50℃;the optimal pH of these five strains were10.0,11.0,10.0,9.0and11.0respectively.Residual enzyme activities of TCCC11004and TCCC11013were as much as70%com-pared to the maximum activity when incubated at40℃for2h,and residual enzyme activities of TCCC11001,TCCC11024,TCCC11029were less than50%.The enzyme activity could be completely inhibited by DFP and PMSF,and it showed that these five proteases were typical serine protease. Key words:alkaline protease;Bacillus;molecular determination;thermostability 收稿日期：2008-10-23 基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）资助项目（2007AA02Z212）；国家科技基础条件平台项目（2005DKA21204-10） 作者简介：成堃（1982-），女，山东济南人，博士研究生，研究方向为发酵工程；路福平*，教授，通讯作者。 [13]TAKAHASHI M,SEKINE T,UBA N,et al.The production of recom- binant APRP,an alkaline protease derived from Bacillus pumilus TY-O-67,by in vitro refolding of Pro-enzyme Fixed on a solid surface[J].J Biochem，2004，136（4）：549-556. [14]WONG S L,CHESTER W.The subtilisin E gene of Bacillus subtilis is transcribed from aσ38Promoter in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA，1984，81：1184-1188. [15]CHANG C T,FAN M H,KUO F C.Potent fibrinolytic enzyme from a mutant of Bacillus subtilis IMR-NK1[J].J Agr Food Chem，2000，48（8）：3210-3216.[16]SEO,J H,LEE S P.Production of Fibrinolytic enzyme from soybean Grits fermented by Bacillus firmus NA-1[J].J Med Food，2004，7（4）：442-449. [17]KIM H K,KIM G T,KIM D K,et al.Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp.KA38originated from fermented fish[J].J Ferment Bioeng，1997，84：307-312. [18]PENG Y,HUANG Q,ZHANG R H,et al.Purification and characteriza- tion of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4screened from dou-chi,a traditional Chinese soybean food[J]. Comp Biochem Phy B，2003，134：45-52. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

钯碳含量检测方法

钯炭的含量检测方法 稀王水溶液：盐酸∶硝酸∶水= 3∶1∶1 取供试品约5g置于250ml烧杯中，加入50ml盐酸溶液（1∶1）煮沸10分钟清洗其表面。再用水煮沸洗涤三次。将表面处理好的供试品转移到称量瓶内，放入干燥箱，110℃干燥1小时，取出放入干燥器中，放冷至室温。精密称取处理好的供试品1.0g，置于250ml烧杯中，加入20ml稀王水，置于带调压器的电炉上加热至近沸，直至供试品全部溶解，再继续加热，使溶液体积浓缩至约5ml，然后分三次加入浓盐酸（每次4ml），分别蒸至近干，加入14ml 10%氯化钠溶液，蒸至近干，加入200ml 7%（V/V）盐酸溶液，在搅拌下缓慢加入20ml 1%丁二酮肟乙醇溶液。待沉淀完全后，用已在110℃干燥至恒重的四号石英砂芯漏斗抽滤，用7%（V/V）盐酸溶液洗涤至滤液无色，再用水洗涤至滤液呈中性。将石英砂芯漏斗抽干后，置干燥箱内110℃干燥1小时。取出放入干燥器冷却0.5小时称 重，直至恒重。 Pd含量按下式计算： Pd% = [（W1－W0）×0.3161/W]×100% W1为沉淀与四号石英砂芯漏斗恒重的重量，g； W0为四号石英砂芯漏斗恒重的重量，g； W为供试品重，g； 0.3161为丁二酮肟钯对钯的换算系数。 允许差：两次平行测定结果之差应不大于0.1%，取其算术平均值为测定 结果。

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16S_rDNA鉴定细菌的方法

16S rDNA鉴定细菌的方法 细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分： 1.提取细菌基因组DNA, 2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。 3.琼脂糖凝胶电泳分离 4.胶回收目的片段 5.目的片段测序。 6.BLAST比对获取相似片段。 7.构建系统进化树 试剂： 1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。 1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高压灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。 1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。 1.410×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。 1.5 10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。 6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。 7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。 8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。 9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。 10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。 11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。 12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。 13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等） 14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。 15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避

医学检验--常用血清酶和同工酶测定的临床意义

常用血清酶和同工酶测定的临床意义 1.连续监测法测定血清肌酸激酶（CK） 2.连续监测法测定乳酸脱氢酶（LD）总活性 3.连续监测法测定血清（天）门冬氨酸氨基转移酶（AST） 4.连续监测法测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT） 5.连续监测法测定血清碱性磷酸酶（ALP） 6.连续监测法测定血清中谷氨酰基转移酶（GGT） 7.淀粉酶（AMY）测定 8.比色法测定酸性磷酸酶（ACP） 连续监测法测定血清肌酸激酶（CK） CK是由两种不同的亚基M和B组成的二聚体。 正常人体中有三种同工酶，即CK-BB（CK1）、CK-MB（CK2）和CK-MM（CK3）。 CK作用后生成的磷酸肌酸含高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源。 CK需要镁离子激活。 1.原理 酶偶联反应测定CK活性浓度。 在340nm监测NAD（P）H的生成量，可计算出CK的活性浓度。 2.生理变异 年龄、性别和种族对CK含量都有一定影响。 CK含量和肌肉运动密切相关。 3.参考值 男性38～174U/L（37℃）； 女性26～140U/L（37℃）。 4.临床意义 升高： （1）心肌梗死。心肌梗死发生后2～4h此酶即开始升高，12～48h达最高峰值，可高达正常上限的10～12倍，在2～4天降至正常水平。 （2）病毒性心肌炎。 （3）肌营养不良症、皮肌炎、骨骼肌损伤。 （4）脑血管意外、脑膜炎、甲状腺功能低下等疾病及一些非疾病因素如剧烈运动、各种插管及手术、肌肉注射冬眠灵和抗生素。 降低：甲亢，长久卧床者总CK（主要为CK-MM）可下降。 5.CK同工酶检测原理及临床意义 CK是由两种不同的亚基M和B组成的二聚体，正常人体中有三种同工酶：

检测鉴定方案

检测鉴定方案 辛集市书香园小区4#楼 检测鉴定方案 一、工程概况： 辛集市书香园小区4#楼位于辛集市教育大道东侧，辛集市一中北邻。该楼为六层砖混结构，一层为储藏间，二至六层为住宅。工程于2006年4月份开工建设，2007年11月份竣工验收，建筑面积平方米。 该工程由辛集市博远房地产开发有限公司开发，河北天艺建筑设计有限公司设计，石家庄中天监理公司监理，辛集市天久住宅建设有限责任公司第七施工处施工。 现该4#楼已入住后多户住宅发现墙体裂缝，为了解该楼建筑工程质量状况，辛集市博远房地产开发有限公司委托河北省建筑工程质量检测中心对该楼工程质量现状进行检测鉴定。 二、依据标准 1、委托书 2、《民用建筑可靠性鉴定标准》(GB50292-1999) 3、《建筑结构检测技术标准》(GB50344-2004) 4、《砌体工程现场检测技术标准》(GB/T50315-2000) 5、《建筑结构荷载规范》(GB50009-2001) 6、《砌体结构设计规范》(GB50003-2001)

7、《建筑抗震设计规范》(GB50011-2001) 8、相关技术资料 三、检测内容 1、基础检测 对该建筑物基础各项工程做法进行检测，纵墙(○17～○18×○A轴处)与横量墙(○A～○B×①轴处)分别开挖一处基础测坑。为便于检测，测坑上部开挖尺寸宜控制在1000mm×1000mm左右，经放坡后测坑底部尺寸应控制在600mm×600mm左右，测坑开挖深度为基础灰土层下皮100mm，测坑内部需将余土清理干净，使基础垫层及大放脚轮廓鲜明，表面无积土。测坑开挖需避开雨水管附近，如测坑周围有堆积物不便开挖，经现场检测人员同意可调换适当位置进行，并做好记录。 检测基础工程实际做法，对其标高、尺寸、材料、损伤等逐一进行检测，检查结果绘制成图并详细记录。 检测工具：洋镐、大锤、铁锹、盒尺、钢尺、水平尺、数字测距仪、数码相机、记录簿等。 检测完毕后及时将测坑进行回填，回填时应分层逐一夯实，恢复表面散水及地面。 2、砌体砂浆强度检测 砂浆强度检测 对该建筑物砌体用砂浆强度进行实地检测，每层随机抽

血清α-淀粉酶(AMS)测定

血清α-淀粉酶（AMS）测定 1. 实验原理 AMS测定采用酶动态比色测定法。所用底物为4,6-亚乙基-α,D-麦芽七糖苷-对硝基苯酚（EPS－G7）。样品中α－淀粉酶分解底物EPS－G7，生成对硝基苯酚（PNP），在405nm处比色，吸光度的上升速率与样品中α-淀粉酶的活力成正比。 2 亚乙基－G5 ＋ 2 G2PNP 5EPS-G7＋5H2O α-淀粉酶 2 亚乙基－G4 ＋ 2 G3PNP 亚乙基－G3＋G4PNP α-葡萄糖苷酶 2G2PNP＋2G3PNP＋G4PNP＋14H2O 5PNP＋14G （反应式中PNP：对硝基苯酚；G：葡萄糖） 2. 标本采集与处理：

2.1 病人准备：无特殊要求。 2.2 标本类型：血清、肝素或EDTA处理的血浆、尿液。 2.3 血清分离血清或血浆应在收集后尽快分离出来。未酸化的尿液，随机或限时收取。 3. 标本存放：不要用嘴吸取标本或对标本吹气，以免唾液污染标本唾液中的淀粉酶使结果升高。血清淀粉酶在20～25℃稳定一个星期，避免微生物降解作用；在2～8℃时稳定一个月。尿液样品在2～8℃可稳定10天，在15～25℃可稳定2天。对于尿液，酸性pH值可使淀粉酶的稳定性减弱，因此，储存前pH值应调至大约7.0。 4. 标本运输：常温条件下运输 5. 标本拒收标准：细菌污染、溶血的不能做测定。 6. 实验材料： 6.1 AMS测定试剂盒（试剂1 6×64 ml ＋试剂2 6×16 ml） 6.1.1 试剂组成 试剂1： GOOD’S 缓冲液pH 7.1 100mmol/L

氯化钠50mmol/L 氯化镁10mmol/L α-葡萄糖苷酶≥23KU/L 试剂2： EPS－G73mmol/L 6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。 6.1.3 试剂稳定性与贮存：原试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。试剂有效期为24个月。6.1.4变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染则试剂不能使用。 6.1.5注意事项：唾液和皮肤中含有α-淀粉酶，应避免用嘴吸取试剂，避免皮肤接触试剂。试剂中含叠氮钠，避免接触皮肤及粘膜。 6.2 校准品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件 6.3 质控品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件 7. 仪器：奥林巴斯AU2700生化分析仪 8. 操作步骤 8.1 项目基本参数：参见生化检验奥林巴斯AU2700生化

一株纤维素酶产生菌的鉴定及酶学性质研究

一株纤维素酶产生菌的鉴定及酶学性质 研究 1 引言 1.1 研究纤维素酶的作用和意义 纤维素是植物纤维的主要成分，也是地球上最丰富的可再生有机资源。据报道，全世界每年通过光合作用产生的纤维素，其中有89%尚未被人类利用，我国每年仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等)就约有7亿t，如何有效利用这些资源已经成为近年来研究的热点。纤维素占植物干重的35%-50%，是地球上分布最广的碳水化合物，同时又是自然界数量最大的可再生资源。纤维素废弃物的有效利用和生物转化已成为世界上许多国家关注的重要科研领域之一。要使纤维素酶真正能够用于工业生产，首先要降低纤维素酶的生产成本。因此，选育高酶活的纤维素分解菌株就成了解决问题的关键之一。 1.2牛胃消化纤维素 图1-1 图1-2 瘤胃微生物(rumen rnicrobes)是指栖息在瘤胃中的微生物。瘤胃是反刍动物降解纤维素的消化器官，纤维素的降解靠瘤胃微生物分泌的纤维素分

解酶，瘤胃内含有复杂的微生物区系，不同的微生物对纤维素和其它营养物质的消化各显功能，并有互补作用。纤维素的消化是纤维素酶水解的结果，纤维素酶是多组分复合酶，主要为内切型葡聚糖酶，外切型葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。瘤胃微生物通过合成和分泌β-1，4-纤维素分解酶复合物，确保了对植物细胞壁的水解，调控瘤胃内环境促进微生物分泌消化酶，或者向饲料中添加酶制剂，都有利于饲料纤维素的利用。 瘤胃微生物能分泌纤维素酶，因此瘤胃有较强的发酵和分解纤维素的作用。在瘤胃微生物中，对纤维素降解起主要作用的还是瘤胃细菌。本文主要从牛胃液中分离出兼性氧的高产纤维素酶细菌，对分离所得菌株进行初步鉴定及并对其发酵产纤维素酶的酶学性质进行初步探讨，从而为最终得到产纤维素酶，性能优良的微生物菌株。 2 菌种的鉴定 2.1 材料与方法 2.1.1实验的菌种实验用的菌种由齐肇然同学提供的产纤维素酶枯草芽孢杆菌属的Q菌种。 2.1.2 培养基 固体培养基：蛋白胨5.0g，(NH4)2S041.0g，羧甲基纤维素钠 CMC—Na 10.0g，NaCl3.0g，KH2PO4 2.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，FeSO4·7H20 10.0mg、MnSO4·H20 5.0mg，琼脂粉20.0g，蒸馏水1000mL，调pH值6.7。 发酵培养基：蛋白胨2.0g，酵母膏1.0g，(NH4)2SO4 2.0g，CMC-Na 20.0g，NaC1 3.0g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H20 1.0g，FeSO4·7H2O 10.0 mg MnSO4·H2O 5.0mg，调pH值6.7。 Q菌的硫化氢培养基：蛋白胨10.0g ，牛肉膏10.0g ，酵母膏5.0g ，柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 2.0g，葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0g，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0g ，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58g ，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25g，琼脂 18.0g、蒸馏水1000mL，pH6.2～6.6。 Q菌的硝酸盐培养基：硝酸盐培养基，硝酸盐培养基成分为硝酸钾0.2g 蛋白5g，蒸馏水1000mL，pH 7.4。试剂：甲液（对氨基苯磺酸0.8g 5moL/L

淀粉含量检测方法

谷物中淀粉含量的测定 本方法参考GB/T5009.9-2008《食品中淀粉的测定》的第二法酸水解法。 适用范围：本方法适用于谷物原料中淀粉含量的测定。 原理：试样经除去脂肪及可溶性糖类后，其中淀粉用酸水解成具有还原性的糖，然后按还原糖测定，并折算成淀粉。 方法一 1 试剂和材料 1.1 酒石酸铜甲液：34.639g CuSO4溶于水，加入0.5mL浓H2SO4，稀释到 500mL； 酒石酸铜乙液：173g酒石酸钾钠，加50g NaOH，稀释到500mL； 1.2 氢氧化钠溶液：c(NaOH)=1mol/L； 1.3 硫酸铁溶液：50g/L（称取50g硫酸铁，加入200mL水后，慢慢加入100mL 硫酸，冷后加入稀释至1000mL）； 1.4 高锰酸钾标准滴定溶液：c(1/5KMnO4)=0.1mol/L； 1.5 乙醇溶液：85% v/v； 1.6 HCL：1+1和1+3； 1.7 NaOH溶液：40%； 1.8 乙酸铅溶液：20%； 1.9 硫酸钠：10%。 2 仪器设备 2.1粉碎磨：粉碎样品，使其完全通过孔径0.45mm（40目）筛。 2.2锥形瓶：250mL。

2.3回流冷凝装置：能与250mL锥形瓶瓶口相匹配。 3操作步骤 称取样品(粉碎过40目筛)2.0g～5.0g，准确至0.0002g，置于放有慢速滤纸 的漏斗中，用50mL石油醚分5次洗去样品中脂肪，再用150mL85%乙醇溶液 分数次洗涤残渣，以除去可溶性糖类物质，滤干乙醇溶液，将滤纸连同残渣一 并转移至250mL锥形瓶中。 加100mL水、30mL(1+1)HCl，在沸水浴上回流2h，回流完毕后，立即在 流水中冷却，待样品水解液冷却完全后，加2滴甲基红指示剂，先用NaOH溶 液（400g/L）调至黄色，再用(1+1)的HCl调至水解液刚变红色。若水解液颜色 较深，可用pH试纸测试，使试样水解液的pH值约为7，然后加20mL的乙酸 铅溶液（200g/L），摇匀，放置10min，再加20mL的硫酸钠溶液(100g/L)，以 除去过多的铅。摇匀后，将全部溶液及滤渣转入500mL容量瓶中，用水洗涤锥 形瓶，洗液合并于容量瓶中，定容，摇匀，过滤，弃去初滤液20mL，滤液供 测定用。 吸取25.00mL滤液于三角瓶中，加25mL酒石酸铜甲液，再加25mL酒石 酸铜乙液，在电炉上加热(在3min内煮沸)并煮沸2min，取下过滤，并用60℃ 水洗涤烧杯和沉淀至洗液不呈碱性为止，将漏斗连同滤纸一同放至前面使用过 的烧杯上，向滤纸内加入硫酸铁(50g/L)40mL，使氧化亚铜完全溶解，摇匀溶液，再加25mL水，用玻璃棒搅拌到看不见Cu2O，以0.1mol/l高锰酸钾标准滴定溶 液滴定至呈微红色，10s不褪色为终点。同样条件做空白。 方法二 1 试剂 1.1 碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜(CuS04·5H2O)及0.050g亚甲蓝,加适量 水溶解，再加水稀释至1000mL。

检测鉴定报告范本

报告编号：××××共8页第1 页工程名称名称要与现有学校名称一致，如与原始资料不符要在括号内注明（原某某学校）工程地点现在名称 委托单位现在名称 鉴定时间×年×月×日至×月×日检验类别委托 鉴定项目安全及抗震鉴定 仪器设备检测所使用设备名称 鉴定依据详见附页 鉴定结论及处理意见 1.鉴定结论 1）有无影响结构安全性缺陷。 2）检测材料强度值是否满足《建筑抗震鉴定标准》规定。 3）抗震构造措施是否满足要求，如不满足，需说明哪里不满足什么标准或规范的要求。 4）安全性等级和试修性评估等级，并注明等级含义。（例：该工程的安全性等级为C su，（安全性不符合标准要求，显著影响整体承载），适修性评估等级为：B'r/ B r （稍难修，改造后的功能尚可达到现行设计标准要求，适修性尚好，宜予修复或改造）。） 2.加固建议 根据鉴定结论，需要加固的项目给出加固建议，如需拆除，则此条改为拆除；如满足各项要求，则无需此条。 （本页以下无正文） 单位名称（盖章） 年月日

报告编号：××××共8页第2 页 1.工程概况 包括建成年份，建筑面积，结构形式，层数，楼板形式，基础形式，基本尺寸；原勘察设计单位，施工单位，监理单位，质检部门，产权所有人等，如果没有资料可查，应注明。 写明鉴定原由。（例：为了保证河北省中小学校舍安全工程顺利实施，按照国务院关于中小学校舍安全工程的统一部署及《全国中小学校舍安全工程实施方案》和《全国中小学校舍安全工程技术指南》的要求，依据《河北省中小学校舍鉴定实施细则》和《河北省中小学校舍安全排查实施细则》，×单位接受委托于×年×月×日～×月×日对以上工程进行了建筑物抗震鉴定与安全性鉴定。） 注明当地设防烈度。 图1该项目正立面图（建筑实体照片） 2.抗震鉴定依据 2.1 该工程设计文件、设计变更及地质勘查报告； 2.2《建筑抗震鉴定标准》（GB 50023-2009）； 2.3《民用建筑可靠性鉴定标准》（GB 50292-1999）； 2.4《建筑工程抗震设防分类标准》（GB 50223-2008）； 2.5《建筑抗震设计规范》（GB 50011-2001）（2008版）； 2.6《建筑结构检测技术标准》（GB/T 50344-2004）。 3.鉴定内容、要求及方法 3.1鉴定内容及要求 此次抗震鉴定包括下列内容及要求： 3.1.1搜集该工程的勘察报告、施工和竣工验收的相关原始资料；当资料不全时，应根据鉴定的需要进行补充实测。 3.1.2调查该工程现状与原始资料相符合的程度、施工质量和维护状况，普查相关的非抗震缺陷，工程现状调查又包括如下内容：1）该建筑的使用状况与原设计或竣工时有无不同；2）该建筑存在的缺陷是否仍属于“现状良好”的范围，并从结构受力的角度，检查结构的使用与原设计有无明显的变化；3）检测结构材料的实际强度等级。

壳聚糖酶生产菌筛选鉴定及其酶学性质

壳聚糖酶生产菌筛选、鉴定及其酶学性质 阎贺静，周念波，涂邵勇，梅双喜，王海波，李 佳 （武汉生物工程学院生物工程系，湖北武汉430415） 摘 要：以壳聚糖为唯一碳源，筛选获得壳聚糖酶活力较高的菌株，根据菌株菌落形态及ITS 序列分析，初步鉴定该菌株为烟 曲霉(Aspergillus fumigatus )。该壳聚糖酶的最适反应温度为55℃，最适pH 值为5.6，在45~60℃和pH 值4.0~8.0范围内稳定，Mn 2+对 酶有明显的促进作用，Ag +、Cu 2+、Zn 2+对酶有明显的抑制作用，其酶学特征表明该壳聚糖酶在壳聚糖降解方面具有应用潜力。 关键词：壳聚糖酶；筛选；鉴定；酶学特性中图分类号：Q814.1 文献标识码：A 文章编号：1004-874X （2012）24-0161-04 Isolation,identification and enzyme characteristics of a strain producing chitosanase YAN He-jing,ZHOU Nian-bo,TU Shao-yong,MEI Shuang-xi,WANG Hai-bo,LI Jia (Bioengineering Department,Wuhan Bioengineering Institute,Wuhan 430415,China ) Abstract:The aim of this paper was to screen chitosanase producing strain and to investigate the characteristics of the chitosanase produced by this strain.Chitsoan was used as the sole carbon source for the acclimatization and screening of strain.A strain with a higher chitosanase activity was isolated from soil.It was identified as Aspergillus fumigatus by its morphology in solid medium and by analyzing the sequence of ITS.The optimum temperature and pH were 55℃and 5.6,respectively.And the chitosanase is stable at 45~60℃and pH 4.0~8.0,respectively.The activity of the enzyme is strongly promoted by Mn 2+and inhibited by Ag +,Cu 2+and Zn 2+.The properties of chitosanase indicated that it has a great potential application in chitosan degradation. Key words:chitosanase;isolation;identification;enzyme characteristics 壳聚糖酶(chitosanase ，EC.3.2.1.132)又称壳聚糖-N-乙酰-氨基葡糖苷水解酶(chitosan N-acetylglucosaminohydr-olase)，是一种对线性壳聚糖具有水解专一性的酶。壳聚糖酶对真菌细胞壁有降解作用，广泛应用于真菌原生质体的提取。同时，壳聚糖酶还可用于真菌的分类研究以及真菌致病菌的诊断。此外，壳聚糖酶在酶解壳聚糖为壳寡糖方面作用理想，且在食品及医药领域具有巨大应用潜力，使壳聚糖酶成为目前国内外研究热点。 目前，壳聚糖酶生产水平较低、价格昂贵，限制了壳聚糖酶的应用。因此，提高壳聚糖酶的生产水平成为研究重点。国内外学者对此进行了大量研究，主要集中在高产菌株筛选、诱变以及基因工程菌构建等方面。目前已筛选出多种产壳聚糖酶的微生物，包括细菌如Bacillus circulans 、Bacillus cereus 及Bacillus subtilis [1-3]，链霉菌如 Streptomyces [4]，真菌如Aspergillus fumigatas 、Aspergillus oryzae 及Trichoderma reesei 等[5-7]。但壳聚糖酶产量较高者并不多见。近年来，随着分子生物学技术的发展，许多壳聚糖酶基因被克隆、表达。国内外已有许多成功克隆表达壳聚糖酶的例子，如Streptomyces N -174、Bcillus circulans MH -K1、Bacillus subtilis HD145、Aspergillus fumigatus 等[8-11]。但是，壳聚糖酶的克隆、表达主要集中在 酶的催化特性及分子结构研究，关于重组酶产量的报道较少。虽然国内近年来关于壳聚糖酶的克隆和表达的研究报告逐年增多，但重组体壳聚糖酶的产量尚未满足工业化生产的水平[12-15]。因此，获得高效、稳定的壳聚糖酶基因及其高产菌株仍是目前应用中的关键问题。从自然界中发现、筛选、诱变或构建壳聚糖酶高产菌株是提高目的酶生产水平的主要途径。我们从湖泊、河流附近采集样品进行壳聚糖酶生产菌的筛选，对筛选菌株进行平板培养考察其生长特性，并进行ITS 序列分类鉴定，通过粗酶酶学特性的研究考察该壳聚糖酶的应用潜力。 1 材料与方法 1.1 试验材料 供试土壤采集于武汉各地河流、湖畔附件的泥土或水 底淤泥。其他化学试剂均为分析纯。 初筛培养基：胶体壳聚糖1%（取1g 壳聚糖粉末用30mL 1%HAC 溶解)、(NH 4)2SO 40.5%、K 2HPO 40.2%、NaCl 0.5%、MgSO 4·7H 2O 0.1%、琼脂2%。复筛培养基：(NH 4)2SO 41%、酵母提取物0.05%、 K 2HPO 40.07%、KH 2PO 40.03%、NaCl 0.5%、MgSO 4·7H 2O 0.05%、葡萄糖0.1%、胶体壳聚糖1%。 发酵培养基同复筛培养基。 1.2试验方法 1.2.1菌株筛选（1）样品处理：称取10g 新鲜样品加入装有90mL 无菌水和玻璃珠的三角瓶中，室温震荡30min 使样品充分打散，静置获得样品悬液。 收稿日期：2012-11-17 基金项目：湖北省教育厅项目(B20114607);武汉市教育局项目 (2010085) 作者简介：阎贺静（1987-），女，博士，讲师，E-mail ：yanhejing@ji https://www.sodocs.net/doc/7610634223.html, 广东农业科学2012年第24期 161

检验方法验证方案(含量测定)

检验方法验证方案 目的：证明所采用的检验方法适于相应的检测要求，具有可靠的准确度、精密度。范围：含量的检定方法的前验证 编定依据：《药品生产质量管理规范》1998年修订版及验证管理办法 职责：验证小组人员 目录 1.概述 2.验证目的 3.职责 3.1验证小组 3.2品质部 3.3化验室 4.验证内容 4.1验证的准备工作 4.2适用性验证 4.2.1准确度试验 4.2.2精密度试验 4.3拟订验证周期 4.4验证结果评定与结论 5.附件

1. 概述 对小容量注射剂的含量测定，本公司采用福林酚测定法，该检验方法具有测量准确、精密度高、专属性强、定量准确可靠、方法简便易行的特点，可满足小容量注射剂含量测定的要求。检验方法标准操作规程。用本方法进行转移因子注射液、胸腺肽注射液的含量测定。 2. 验证目的 为确认对转移因子注射液、胸腺肽注射的含量测定的紫外分光光度法，适合相应的检测要求，特制订本验证方案，进行验证。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案变更申请及批准书，报验证工作小组批准。 验证前，应首先对验证所需的仪器、设备进行验证，对所需仪器、仪表、量具等进行校正。 3. 职责 3.1 验证工作小组 负责验证方案的审批。 负责验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施。 负责验证数据及结果的审核。 负责验证报告的审批。 负责发放验证合格证书。 负责再验证周期的确认。 3.2 品质部 负责验证所需仪器、设备的安装、调试，并做好相应的记录。 负责组织验证所需仪器、设备的验证。 负责仪器、仪表、量具等的校正。 负责拟订检验方法的再验证周期 3.3 化验室 负责验证所需的标准品、样品、试剂、试液等的准备。 负责验证方案指定的试验的实施。 负责收集各项验证、试验记录，并对试验结果进行分析后，报验证工作小组。 4. 验证内容 4.1 验证的准备工作 4.1.1 验证所需文件资料 品质部负责提供验证所需的文件资料，包括该检验方法的标准操作规程。以及负责提供验证所需仪器、设备的验证报告以及仪器、仪表、量具等的校正报告。 检查人：日期：

安全性鉴定方法及步骤

框架结构安全性检测鉴定方法及步骤 一、检测鉴定依据 1.《民用建筑可靠性鉴定标准》GB 50292-1999 2.《建筑结构荷载规范》GBJ 9—87 3.《回弹法检测混凝土抗压强度技术规程》（J GJ/T 23-92） 4.《混凝土结构设计规范》GBJ 10—89 5.《危险房屋鉴定标准》JGJ 125—99 6.《混凝土结构加固技术规范》（C ECS 25:90） 7.《钻芯法检测混凝土强度技术规程》（C ECS 03:88） 8.原工程相关资料：包括工程设计图纸、设计变更、施工记录、 地质勘查报告、使用功能及荷载变更、历次加固方案和修复 处理方案、改造的相关资料等 二、鉴定内容 1、调查及检测 ①结构基本情况勘察检查结构的布置形式、结构及其支承构造、构件及其连接构造、结构的细部尺寸及相关的几何参数。 ②结构使用条件核实：检查结构上的作用、建筑物的内外环境及使用历史。 ③地基及基础的检查：当无地基基础的相关资料时，应检查场地类别、地基土情况、地基稳定性及地基变形等情况，主要通过局部开挖，调查现有基础工作状态，观测其整体及局部变形（沉降）情况及其在上部结构中的反应。如有问题，需作进一步检测。 ④材料性能检测分析检测主体承重结构材料的强度：混凝土结构检测梁板、柱子的混凝土强度、混凝土碳化深度，检测保护层厚度、钢筋分布情况等。

混凝土强度检测可采用拔出法、回弹法、取芯法及回弹超声综合法等，钢筋分布及混凝土保护层厚度用扫描仪扫描检测。 混凝土强度检测采用随机抽取的办法，抽检构件数量约为总体构件数量的30%（指主要构件），位置可根据现场条件适当选取，钢筋分布检测选取有代表性的构件及重要的构件进行。 ⑤承重结构情况检查检查结构的体系，房屋的整体性连接、房屋局部易损部位的构造、检查框架梁、板、柱子的裂缝及承重砖墙的裂缝变形等。 2、理论计算分析 根据现场检测所得到的主体承重结构材料强度，结合原工程图纸和调查情况，进行整体结构计算，分析结构构件的承载能力等是否满足相关设计规范的要求。计算分析时，结构构件材料按原设计（或设计变更）和现场实测指标两种情况综合考虑取用，几何参数按设计图纸(或设计变更)并结合现有建筑的实际情况取用。 3、建筑结构安全性鉴定 安全性鉴定按照现行标准要求(《民用建筑可靠性鉴定标准》GB 50292-1999)，分构件、子单元、鉴定单元三个层次进行，每一个层次又分为四个安全性和三个使用性等级，按照标准规定的检查项目和步骤，结合现场调查和原设计有关资料以及计算结果，逐层进行。最后，综合分析得出整个建筑的安全性评价。 4、结论及建议 根据鉴定结果，对结构的整体安全度作出评价。 当鉴定结果不符合标准要求时，结合建筑物的实际情况及结构的使用功能要求等提出加固处理方案，并通过经济技术比较，推荐最优的加固方案。