天然药物化学成分的常用分离纯化方法

第三章天然药物化学成分的常用分离纯化方法§1．概述

一、研究分离纯化技术的重要性

（一）制备工艺研究的重点

原料经提取加工所得的提取物通常是一个成分复杂的混合物，只有经过进一步地分离纯化，才能得到纯度较高的化学成分。

提取

检识除去部分或全部杂质

提取物目标成分

（杂质＋化学成分）（纯度提高）

（二）检测分析研究的重点

天然产物工作中，无论原料或终产品，经常会是混合物；这些含有杂质成分的样品，检测分析之前，一般都需要做前处理，以便除掉干扰分析的杂质，否则，检测分析工作常常难以进行。

要除掉待测样品中的杂质，同样需要分离纯化技术：

待测样品供试样品检测分析

分离纯化

除掉干扰检测

分析的杂质组分

由上述可见，分离纯化同样也是检测分析的研究重点

二、研究分离纯化方法的基本思路

动、植物原料的提取物的化学组成经常是很复杂的，往往含有几十、几百甚至近千种成分（包括微量成分）。

要从众多成分中分离纯化某种化学成分，其难度可想而知，究竟应当如何着手呢？

其实我们只要抓住一个重要的基本思路，就可以使许多看似困难的分离工作，变得比较容易，这个思路就是：

寻找差异、利用差异

决定分离难易的关键：不在于成分多少, 而在于差异大小。

只要存在显著差异，从上千种成分中分离出某种成分也未必困难；反之，如果差异微小，即便是两种成分的分离，也会相当棘手。

学习和研究分离纯化技术，重在把握思路，切忌生搬硬套，死记硬背，应当重视培养“善于寻找差异和利用差异”的良好习惯。

尽管天然产物中成分众多，然而只要细心研究，总能发现被分离成分之间的某些差异。在分离纯化工作中可以利用的差异是很多的，其中最常利用的有四类差异：

溶解度（或分配系数）、酸碱性（或解离度）、吸附性、分子量

以下，我们便对此进行研究探讨。

前处理

§2 利用溶解度（或分配系数）差异进行分离纯化的方法

一、直接利用溶解度差异

溶解度差异是分离纯化工作中经常考虑利用的重要差异类型。 （一）主要用途：

用于分离 溶解度 不同的成分，通常也是 极性 不同的成分（溶解度与极性相关）。

（二）主要原理：相似相溶 参见第二章：二 1 （2）.

（三）常用方法

基于溶解度差异的分离方法，常见有三种：抽提法、沉淀法、萃取法

1．抽提法（溶剂抽提法）

溶 液 (可溶部分)

提取物 干 燥

粉 碎 溶剂抽提、分离

残 渣 （不溶部分）

实验装置图示:

该方法操作与装置皆很简便。

如上图所示，小量操作在图A 试管中即可进行搅拌抽提，稍大量可置图B 磁力搅拌器中自动搅拌，再大量还可用大型烧瓶（图C ）搅拌抽提，如用有机溶剂抽提，图B 、C 上方应连接回流冷凝管，切忌有机溶剂挥发逸出。

抽提完成后，图A 试管可直接离心分离，图B 、C 装置抽提完成后，可酌情离心或过滤分离。

由上述不难看出，抽提法经过简便操作，即可利用溶解度差异分离获得两类组分。 练习：

带有 冷苯 汉防己甲素 甲基 可溶 汉防己乙素 羟基 难溶

试写分离流程：

混合物

A B C

滤液（……甲素）

残渣（……乙素）

2．沉淀法（溶剂沉淀法）

缓缓滴加另一溶剂

溶液（可溶成分）

提取液混浊、析出沉淀

与原溶剂极性不同沉淀（不溶成分）

但可与之混溶

实验装置与上述抽提法相似，见上图。

需要注意的是沉淀法与抽提法的重要区别在于：

⑴在该法中被分离物料是液体。

⑵该法所加溶剂的目的不是用于溶解，而是用于使某种成分难溶析出，因而必须从极性角度仔细选择溶剂种类，所加溶剂既要能够与原溶剂相混溶，又必须与原溶剂的极性存在显著差异，能使最终的混合溶剂的极性与原溶剂发生显著变化，从而使某些成分随着溶剂的极性改变而由可溶状态转为不溶或难溶状态沉淀析出，达到分离目的。

沉淀法与抽提法也有共同之处：

操作之后都存在固液两相，因而其最终的分离措施是相似的，诸如离心、过滤等都是常用方法。

沉淀法流程实例：

3．萃取法

亲脂溶剂相（脂溶成分）

加入有机溶剂振摇

水提取液

如石油醚、充分混匀

乙醚、氯仿等水相（水溶成分）实验装置图示:

萃取操作也较为简便，所用装置可大可小，然而应注意防止乳化。

萃取流程实例：

萃取脱脂

萃取

（四）两大技巧

1．梯度处理

以上三法皆可进行梯度处理，例如梯度抽提（分步提取），梯度沉淀（分步沉淀），梯度萃取。

普通的溶剂处理法，仅能用于分离极性差异较大、溶解度差异较大的成分，应用受到一定限制；而梯度处理法可以收到更好的分离效果。

2．组合应用

如：水提醇沉水提醚萃分离效果更好

二、改变溶解度差异进行分离

对于溶解度差异较小而不易分离的成分，还可同过多种手段增大其溶解度差异，例如：

改变温度：降温法、升温法等

加入某种试剂：铅盐沉淀法等

制备衍生物：酯化、磺化等。

§3．利用酸碱性（或解离度）差异进行分离纯化的方法

一. 利用酸碱性差异分离----- 酸碱溶液处理法

（与溶剂处理法相似）也有三大方法：( 抽提法沉淀法萃取法)

基本原理：成盐

二. 利用解离度差异分离----- 离子交换法

一．利用酸碱性差异分离----- 酸碱溶液处理法

（一）酸碱抽提法

总提取物，依次用酸水、碱水简单处理之后，往往能够很容易分为碱性、酸性及中性三大类成分。

实例：

①酸水抽提

酸水溶液（碱性成分成盐，溶出）

总提取物

粉末、颗粒碱水溶液（酸性成分成盐，溶出）

或浸膏等

中性溶液（中性成分溶出）

（水或有机溶剂）

酸水抽提过滤

不溶物（杂质）

（二）酸碱沉淀法（可与抽提法或萃取法配用）

1. 碱溶酸沉法

溶于碱水

酸型成分盐型成分

含-COOH 酸化、析出沉淀

或酚OH

实例：大黄水解提取物（氯仿溶液）

[ 碱溶] 碱水萃取

分层

氯仿溶液(含脂溶性杂质) 碱水溶液（与脂溶性成分分离）

[ 酸沉] 酸化（pH2~3），析出沉淀

过滤

酸水液(酸水可溶性杂质) 大黄总蒽醌苷元（与水溶性成分分离）

2．酸溶碱沉法

溶于酸水

碱型成分盐型成分

碱化析出沉淀

酸水溶液(生物碱盐) 生物碱提取物

（酒精浸膏）

（三）酸碱萃取法

（1）用酸水或碱水萃取有机相（与其它脂溶性成分分离）

用酸水从有机溶剂中萃取出碱性成分(成盐而溶于酸水，未成盐的亲脂性杂质留于有机溶剂) 或用碱水从有机溶剂中萃取出酸性成分(成盐而溶于碱水，未成盐的亲脂性杂质留于有机溶剂)

实例：大黄总蒽醌苷元（氯仿溶液）用碱水萃取精制（见上方实例流程图）

（2）用有机溶剂萃取酸水或碱水溶液（与水溶性成分分离）

通常，未成盐的亲脂性成分被有机溶剂萃取，能成盐的亲脂性成分留于酸水或碱水溶液（实现分离）

（3）组合法

1o 酸水萃取碱化有机溶剂萃取

有机相

酸水萃取（初步分离）

分层

有机相(中性或酸性亲脂成分)

酸水液（碱性亲脂成分成盐，例如生物碱盐）

碱化

有机溶剂萃取(再次分离)

分层

碱水液（水溶性成分）

有机相（碱性亲脂成分，例如生物碱）

2o 碱水萃取酸化有机溶剂萃取

原理与（3）1o 相似，可用于精制酸性亲脂成分

（四）pH梯度处理法

普通的酸碱处理法，仅能用于分离酸性、碱性和中性成分；而pH梯度处理法还能分离酸性（或碱性）强弱不同的成分。

PH梯度处理也分为抽提、沉淀、萃取法。

1．pH梯度萃取法

实例：大黄中几种酸性强弱不同的蒽醌苷元的分离

5％NaHCO3萃取

强酸性成分(例如大黄酸)

pH梯度萃取

酸性总提取物弱酸性成分(例如大黄素)

碱性依次增强

酚性成分(例如芦荟大黄素)

同上原理，也可用不同酸度的酸水分离碱性强弱不同的成分。

2．pH梯度抽提法和pH梯度沉淀法

与上述pH梯度萃取法原理相似。

二、离子交换法――（利用解离度差异）见Ch.5层析法

§4利用吸附性差异进行分离

一常用吸附方法的分类

（一）按吸附原理分：

1物理吸附（表面吸附）：它是由构成溶液的分子（含溶质及溶剂）与吸附剂表面分子的分子间力的相互作用所引起。

物理吸附无选择性，可逆，应用广。

2化学吸附（发生化学反应）：吸附剂与被吸附成分各有酸、碱基团时，相互之间会发生化学吸附；例如碱性氧化铝（属碱性吸附剂）与酸性成分之间的吸附，或者硅胶（属弱酸性吸附剂）与生物碱成分之间的吸附等都属化学吸附。

化学吸附具有选择性，难解吸，甚至不可逆，应用较少（通常多回避）。

3半化学吸附（例如聚酰胺氢键吸附），吸附力较弱，介于上述二者之间，应用较多（见§6）。

（二）按被吸附成分与吸附剂的相对关系来分：

1 静态吸附（又称简单吸附法，例如活性碳脱色）

向被处理液体中加入吸附剂，搅匀、充分吸附后，将吸附剂与被处理液体分离（过滤或离心等），必要时重复上述操作多遍，以达到充分吸附。有必要洗脱时，再合并吸附剂另行洗脱；吸附杂质时通常不再洗脱（参见下图）。

2 动态吸附（又称吸附层析法，例如活性碳柱层析）

吸附剂装入层析柱中（见下图），加洗脱剂至略高于吸附剂，加被分离样品于柱顶，洗脱剂由上方不断滴加，从下方不断流出。

在洗脱剂的作用下，被吸附成分不断离开上方吸附剂，又被下方吸附剂重新吸附，按其吸附性强弱不同而被分离成不同的层析谱带（见下图）。

静态吸附装置图示：动态吸附装置图示：

3 静态吸附与动态吸附的比较（见下表）

本节重点：物理吸附中的静态吸附

二．物理吸附法（重点讨论静态吸附）又称简单吸附法

(一)基本规律：

相似相吸（与极性有关，类似于“相似相溶”）

物理吸附法虽无选择性，但其吸附强弱及吸附先后顺序，遵循这一规律。“相似者易于相互吸附”，极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。

（二）影响因素（吸附三要素）

吸附剂

溶质(被分离物质)溶质与溶质(争吸)竞争吸附(争夺吸附剂表面)

溶剂溶剂与溶质(解吸)

吸附效果与上述三者的结构特点及极性强弱有关

（三）吸附剂和洗脱剂的分类

吸附剂按极性不同可分为以下两大类：

极性吸附剂非极性吸附剂

别名亲水性吸附剂亲脂性吸附剂

易吸附亲水性成分亲脂性成分

实例氧化铝、硅胶活性碳

活化需去水需去气

洗脱剂按极性不同可分为：亲水性洗脱剂、亲脂性洗脱剂。

（四）、吸附剂和洗脱剂的选择原则(见下表)

（五）简单吸附法的应用

1．精制（吸附杂质）

（1）活性碳脱色常用于提取液精制或结晶、重结晶的操作。

（2）酸性白土脱色、脱臭

用于植物油或脂肪酸精制，效果很好，脱色的同时兼有一定程度的脱臭作用。

例如，花生油脱色；鱼油多不饱和脂肪酸EPA、DHA类产品脱色。

2．浓缩（富集）（吸附有效成分）

用于从大量稀水溶液中浓缩微量物质。

例如，从一叶萩水浸液中浓缩分离抗肿瘤成分一叶萩碱。方法为：将水浸液pH调至碱性（pH

8.5），分次加入活性碳，搅拌，静置，直到上清液检查无生物碱反应时为止。滤集吸碱炭末，

干燥后，与苯回流，苯液回收即得一叶萩碱。

§5利用分子量差异进行分离

一、透析法

1．原理

利用小分子量及小离子化合物在溶液中可通过透析膜，而大分子及大离子化合物不能通过透析膜的性质，借以达到分离的目的。

2．应用

此法通常用于分离纯化化学成分提取物中的大分子成分，如皂苷、蛋白质、多肽、多糖等成分，以除去混杂其中的无机盐、单糖、双糖等小分子化合物。

二、超滤法和超速离心法

超滤法：利用因分子大小不同所引起的扩散速度的差别，进行分离。

超速离心法：利用溶质在超速离心引起的重力场作用下具有不同的沉降性或浮游性。

§6其它分离方法简介

利用各种差异的分离方法还有很多，例如：

分馏法：是利用混合物中各组分的沸点不同，因而在分馏过程中产生蒸汽压的高低差别而得以分离的方法。

升华法：是利用某些固体物质在低于其熔点的温度下，受热后不经过熔化便可直接转化为气体，遇冷后又直接凝结为固体的性质，借以达到与其它成分的分离。

超临界流体提取分离法：见前述

附：化学成分提取分离其它实例

一、从槐米中提取芦丁（碱溶酸沉法）

沸水提取：取槐米加入约6倍量水，煮沸，

碱溶：搅拌下缓缓加入石灰乳至PH 8 – 9，微沸20 –30分钟，趁热抽滤，残渣同上再加4倍水煎煮一次，乘热抽滤，合并滤液。

酸沉：取上述滤液，在60 – 70 ℃下，用浓盐酸调至PH为5，搅匀，静置24小时，抽滤，分出沉淀物，水洗至中性，60 ℃干燥得芦丁粗品。

重结晶纯化：水中重结晶，70 – 80 ℃干燥得芦丁纯品。

注：⑴碱化时选用石灰乳或石灰水是因其含有Ca(OH)2 ，兼有钙盐沉淀法的作用，可除去含-COOH的水溶性杂质，如果胶、粘液质等。⑵使用碱溶酸沉法纯化时，酸碱浓度均不宜过高；强碱，尤其加热时易破坏黄酮母核，酸性过强会形成钅羊盐，使析出的黄酮类化合物又重新溶解，产品收率反而降低。

二、人参总皂苷的制备方法

提取：浸渍法

分离：萃取法

三、远志总皂苷的制备

溶剂提取：石油醚脱脂

乙

醇提苷

分离：醇提酮沉（溶剂沉淀法）

微生物菌种的分离和纯化方法

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，

酶的分离纯化方法介绍

酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。 关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类： 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到； 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。

分离纯化(1)

1.生物药物:是利用生物体、生物组织或其成分，综合应用生物化学、微生物免疫学、和药 学等的原理与方法制造的一大类用于预防、治疗、诊断的制品。 2.生物制品：主要指菌苗、毒素、应变原与血液制品等。 3.合成与部分合成生物药物：以天然药物为分子母体，经化学或生物学方法修饰改造合成 的生物药物。 4.基因药物：以基因物质（RNA或DNA及其衍生物）作为治疗的药物基础，包括基因治 疗用的重组目的DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酶等。 5.反义药物：以人工合成的十至几十个反义寡核苷酸序列与模板DNA或mRNA互补形成 稳定的双键结构，抑制靶基因的转录和mRNA的翻译，从而起到抗肿瘤和抗病毒的作用。 6.疫苗：使用病毒或立克次氏体，接种于动物、鸡胚或组织培养后，加以处理制成，可分 为弱毒疫苗和死毒疫苗。 7.类毒素：使用细菌产生的外毒素加入甲醛处理后，使之变为无毒性但仍旧有免疫原性的 制剂。 8.细胞破碎：采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大 程度的释放到液相当中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化。 9.过滤：在外力的作用下，悬浮液中的液体通过多孔介质的孔道而固体颗粒被截留下来， 从而实现固液分离的操作。 10.料液：在溶剂萃取中，被提取的溶液被称为料液。 溶质：在溶剂萃取中，欲提取的物质被称为溶质。 萃取剂：用以进行萃取的溶剂。 11.反萃取：将萃取液与反萃取剂（一般为水溶液）相接触，使某种被萃取的有机相溶质转 入水相的过程。 12.萃取液：含溶质的萃取剂溶液。 萃余液：被萃取出溶质以后的溶液。 13.双水相萃取：又称水溶液两相分配技术，它利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的 差异来进行萃取的方法。 14.临界胶束浓度（CMC）：是胶束形成时所需表现活性剂的最低浓度。 15.正常胶束：将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂就会在 水溶液中聚集在一起而形成聚集体，通常情况下，这种聚集体是水溶液中的胶束，被称为正常胶束。 16.反胶束：将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会 在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体被称为反胶束。 17.超临界流体：在临界温度和临界压力以上的流体，高于临界温度和临界压力而接近临界 点的状态。 18.超临界流体萃取技术：是利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有（特 异增加物质溶解能力）来进行分离纯化的技术。 19.固相析出技术：通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固体形式（沉淀和结 晶）从溶液中沉降析出的分离纯化技术称为固相析出技术。 20.盐析法;是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的 中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。 21.有机溶剂沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉 淀析出的分离纯化方法。 22.凝胶层析：又称分子筛层析，是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分 流经体积的差异，使不同分子量的祖坟的一份力的层析方法。 23.类分离（组分离）：将分子量极为悬殊的两类物质分开的方法。 24.分级分离：将分子量相差不大的大分子物质加一分离的方法。 25.离子交换法：利用溶液中带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作 方法。 26.有效粒径：指筛分树脂时，10%体积的树脂颗粒通过，而90%体积的树脂颗粒保留的筛 孔直径。 27.均一系数：指能通过60%体积（筛上体积40%）树脂的筛孔直径与能通过10%体积（筛 上体积90%）的树脂的筛孔直径之比。均一系数越接近1，表明树脂颗粒越均匀，在文献上常常见到用筛目数表示树脂粒度。 28.树脂再生：使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程。 29.转型：树脂去除后，为了发挥其交换能力，按照使用要求人为地赋予平衡离子的过程。 30.毒化：指树脂失去交换性能后，不能用一般的再生手段重获交换能力的现象。 31.洗脱：离子交换完成后，将树脂所吸附的物质释放出来重新转入溶液的过程。

磁珠法分离纯化DNA原理及其步骤

磁珠法分离纯化DNA原理及其步骤 日期：2012-05-22 来源：互联网 标签：核酸纯化核酸分离磁珠法纯化DNA 摘要: 磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。 欢度大力神杯之夏，参与BRAND竞猜活动，获赠BRAND产品！ GeneCopoeia：qPCR mix免费试用体验活动开始！ 磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。 磁珠法纯化DNA原理 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE，COOH)等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有’Mag-Bind’。 核酸分离与纯化的原则 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性：排除其他分子污染。 核酸分离与纯化的步骤 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。 (1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ～> 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。

天然产物分离与纯化

茶叶中茶多酚的提取分离纯化重庆大学课程论文 学生姓名：何英 学号：20161902017t 专业：生物学 学科门类：理学 重庆大学生物工程学院 二O一六年十月

摘要 茶叶中含有600多种化学成分，组分极为复杂。茶叶中的无机矿物质有27种，大多数都是人体健康所必须物质。茶叶中的有机物茶多酚与儿茶素类物质、咖啡碱、茶多糖等决定了茶叶色泽、香气、滋味、营养及保健功效。本文总结了茶多酚为主要内容物的提取纯化及性质为主要内容，对比不同方法的优异，按要求选择一条合适的工艺路线。溶剂浸提法工艺简单、技术成熟。离子沉淀法选择性强、纯度较高但是损失大、收率低、安全性低。树脂吸附法虽工艺简单、纯度高、能耗低但是溶剂用量大、成本高。超临界流体萃取法纯度高但是设备要求高、成本高，不适合大剂量的提取茶多酚。超声波浸提法高效、节时、提取率高但噪音污染，不适合长期使用。微波浸提法高效、节能、节时、提取率高但具有微波辐射。膜分离法工艺简单，环境污染小但纯度低。所以根据不同的要求、设备、成本需要选择不同的方法。 关键词：茶叶，茶多酚，提取方法

1绪论 茶叶起源于我国，后流传于世界。至今，地球上引种茶树的国家已经达到了60多个，近年来世界茶叶种植面积总数达290万公顷[1]。我国是产茶大国，进入21世纪以来，我国的茶产量稳居世界第一[2]。科学研究和临床医学实验表明，茶叶有降血糖、降血脂、抗癌、抗衰老、抗辐射等诸多保健作用，这与茶叶中的有效功能成分密不可分。茶叶中的有效成分包括茶多酚、茶多糖、咖啡碱、茶氨酸、茶蛋白等。所以，用中低档茶叶为原料，提取分离有效成分，大力发展茶叶深加工技术，不仅可以开辟中低档茶叶市场、充分利用茶叶资源，也将成为我国茶叶行业发展的新方向。 茶多酚作为茶叶中最主要的功能性成分，使其成为目前天然产物研究的热点，由于具有多种生理活性和功能，在医疗保健、食品行业、日用品等领域都得到了广泛的应用。因此，优化提取工艺，分离提纯茶多酚具有十分重要的经济和社会效益。目前，国内茶多酚生产企业基本上采用的是溶剂法制备茶多酚，该方法生产周期长，温度高，所制备的茶多酚含量和活性低，且由于在生产过程中使用氯仿等有机溶剂，不仅操作不安全，产品还存在有毒溶剂残留问题，其品质难以满足国内外市场的需求，造成茶多酚产品销售困难，大量积压，同时溶剂法对环境的污染较大，不符合绿色化生产发展的方向。因此，需要选择一条合理，绿色，创新的生产工艺，提高茶多酚产品的质量，实现资源、环境、经济、社会一体化发展。

常用的分离纯化手段

常用的分离纯化手段 分离 发布日期:2012-8-1有效日期至:2013-1-28查看联系方式 发布单位: 杭州哲博化工科技有限公司分析检测中心查看该会员所有的供求信息查看该会员所有的产品信息 常用的分离纯化手段 资深专家团队---专业检测机构---精准分析服务----先进仪器设备--雄厚技术实力赵老师18 96 8197 425 哲博检测中心，浙大国家大学科技园提供【各种精细化工和高分子材料性能检测，成分分析，配方还原，工艺失效分析】【名校科研院所博士领衔、专业分析专家】 关键词：分离纯化配方分析成分分析 1. 化学分离法 蒸馏与分馏 分离沸点与挥发度相差较大组分的有效方法。有常压蒸馏，减压蒸馏，水蒸气蒸馏。适用于混合液体及液固的分离。 萃取 利用物质在不同溶剂中溶解度的不同和分配系数的差异，使物质达到相互分离的方法。适用于液固，液液的分离。 提取 利用不同的溶剂，从固体样品的基体中，使某种组分得到分离和浓缩。主要利用索氏提取器。如高聚物与填料，高聚物材料中微量助剂的提取与浓缩处理。缺点：①易引起热不稳定的组分变质②溶剂中的杂质也被浓缩③溶剂用量大 结晶与沉淀（溶解沉淀法） 利用样品中各组分在溶剂中的溶解度差异，使某些组分从浓溶液中生成结晶分离出来，是纯化物质的一种有效的方法。适用与高聚物的分离。 过滤与膜分离 过滤是分离液-固非均一体系常用的分离方法。适用于>1μm的颗粒。 膜分离适用于分离< 1μm的胶体颗粒。分为固体高分子膜，阳离子膜，阴离子膜。 灰化，酸化，微波消解—用于无机物的分离。 2. 色谱分离法： 柱色谱法—分离有机化合物的有效手段。分为： 硅胶填充柱—适用于分离大多数弱极性，中等极性和较强极性的化合物。 氧化铝填充柱—适用于分离非极性，弱极性化合物 聚酰胺填充柱—可用于染料，表面活性剂的分离。 阳离子交换柱—分离阳离子，适用于阳离子表面活性剂。 阴离子交换柱—分离阴离子，适用于阴离子表面活性剂。 凝胶色谱法 分为： 凝胶过滤色谱（GFC）—用于分离水溶性大分子。 凝胶渗透色谱（GPC）—用于有机溶剂中可溶的高聚物分子量分布分析及分离。 薄层色谱法—适用于有机化合物的分离。 纸色谱法—主要用于强极性和水溶性化合物，如氨基酸，糖类，有机酸及盐等的分离，亦可用于多种金属阳离子，阴离子的分离与鉴定。 气相色谱法—热稳定好，易挥发的中，小分子量的有机化合物的分离。

化学分离与提纯的常用方法

化学分离与提纯的常用方法 提纯是指将混合物净化除去其杂质，得到混合物中的主体物质，提纯后的杂质不必考虑其化学成分和物理状态。混合物的分离方法有许多种，但根据其分离本质可分为两大类，一类：化学分离法，另一类：物理法，下面就混合物化学分离及提纯方法归纳如下： 分离与提纯的原则 1.引入的试剂一般只跟杂质反应。 2.后续的试剂应除去过量的前加的试剂。 3.不能引进新物质。 4.杂质与试剂反应生成的物质易与被提纯物质分离。 5.过程简单，现象明显，纯度要高。 6.尽可能将杂质转化为所需物质。 7.除去多种杂质时要考虑加入试剂的合理顺序。 8.如遇到极易溶于水的气体时，要防止倒吸现象的发生。 概念区分 清洗：从液体中分离密度较大且不溶的固体，分离沙和水； 过滤：从液体中分离不溶的固体，净化食用水； 溶解和过滤：分离两种固体，一种能溶于某溶剂，另一种则不溶，分离盐和沙； 离心分离法：从液体中分离不溶的固体，分离泥和水； 结晶法：从溶液中分离已溶解的溶质，从海水中提取食盐； 分液：分离两种不互溶的液体，分离油和水； 萃取：入适当溶剂把混合物中某成分溶解及分离，庚烷，取水溶液中的碘； 蒸馏：溶液中分离溶剂和非挥发性溶质，海水中取得纯水；

分馏：离两种互溶而沸点差别较大的液体，液态空气中分离氧和氮；石油的精炼； 升华：离两种固体,其中只有一种可以升华，离碘和沙； 吸附：去混合物中的气态或固态杂质，活性炭除去黄糖中的有色杂质； 分离和提纯常用的化学方法 1.加热法： 当混合物中混有热稳定性差的物质时，可直接加热，使热稳定性差的物质分解而分离出去。如，NaCl中混有NH4Cl，Na2CO3中混有NaHCO3等均可直接加热除去杂质。 2.沉淀法： 在混合物中加入某种试剂，使其中一种以沉淀的形式分离出去的方法。使用该方法一定要注意不能引入新的杂质。若使用多种试剂将溶液中不同微粒逐步沉淀时，应注意后加试剂的过量部分除去，最后加的试剂不引入新的杂质。如，加适量的BaCl2溶液可除去NaCl中混有的Na2SO4。

《生物分离与纯化技术》授课教案

《生物分离与纯化技术》授课教案 第一章绪论 教学目的：熟悉生物物质的概念、种类和来源；了解分离纯化技术及其基本原理；熟悉分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；掌握分离纯化的特点与一般步骤；了解生物分离纯化技术的发展历史；熟悉生物分离纯化技术的发展趋势。 教学重点：生物物质的概念、种类和来源；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；分离纯化的特点与一般步骤；生物分离纯化技术的发展趋势。 教学难点：分离纯化技术及其基本原理；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作。教学课时：4 学时 教学方法：多媒体教学 教学内容： 第一节生物分离与纯化的概念与原理 一、生物物质的概念、种类和来源 1. 生物物质：氨基酸及其衍生物类、活性多肽类、蛋白质、酶类、核酸及其降解 物、糖、脂类、动物器官或组织制剂、小动物制剂、菌体制剂 2. 生物物质来源：动物器官与组织、植物器官与组织、微生物及其代谢产物、细胞培养产物、血液、分泌物及其代谢物 二、生物分离纯化概念 指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或动植物组织细胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。 三、生物分离纯化技术

生物技术 上游：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程及组织工程；下游：生物产品的回收——生物分离与纯化技术，主要包括离心技术、细胞破碎技术、萃取技术、固相析出技术、色谱技术和膜分离技术等。 四、分离纯化基本原理 有效识别混合物中不同组分间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质或扩大这些差别的分离设备来实现组分间的分离或目标产物的纯化。

第二节分离纯化策略 一、生物分离纯化技术的特点 1. 环境复杂、分离纯化困难 2. 含量低、工艺复杂

蛋白质的分离纯化方法(参考资料)

蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

物质分离和提纯的方法与技巧

物质分离和提纯的方法与技巧 物质的分离是通过适当的方法，把混合物中各组成物质彼此分开，并且恢复到各种物质原来的状态，分别得到纯净物；而物质的提纯是通过适当的方法把混入某物质的少量杂质除去，以便获得相对纯净的物质，又称除杂。 物质的除杂从内容上看，它包含着常见酸碱盐及其他重要物质的性质及特殊化学反应的知识；从过程上看，它是一个原理确定、试剂选择与实验方案确定、操作实施的过程，其考查热点和趋势是化学知识与实验操作的结合，理论与生产实践的结合。 1、主要方法 物质的分离和提纯常用方法有物理方法和化学方法两种，见下表： 2、用化学方法分离和提纯物质的原则 不增：在除杂的过程中不能引入新的杂质； 不减：在除杂的过程中，不能减少或损耗被提纯物质的质量； 不变：在除杂过程中，除杂剂不能使被提纯物质改变； 易分：被提纯物质与杂质或杂质转化成的新物质易于分离； 务尽：选择除杂剂要注意反应进行的程度，除杂越彻底越好。

3、酸、碱、盐溶液中的除杂技巧 ①被提纯物质与杂质所含阳离子相同时，选取与杂质中的阴离子不共存的阳离子，再与被提纯物中的阴离子组合出除杂试剂，如Na2SO4（NaOH）：可选用稀H2SO4为除杂剂（生成物为Na2SO4和H2O，达到目的）。KCl（K２SO４）：可选用BaCl２溶液为除杂试剂（生成物为BaSO KCl，达到目的）。 ４和 ②被提纯物质与杂质所含阴离子相同时，选取与杂质中的阳离子不共存的阴离子，再与被提纯物中的阳离子组合出除杂试剂，如NaCl（BaCl2）：可选用Na2SO4溶液为除杂试剂（生成物为BaSO4和NaCl，达到目的）。KNO3（AgNO3）：可选用KCl２溶液为除杂试剂（生成物为AgCl和KNO3 ，达到目的）。 ③被提纯物质与杂质所含阴、阳离子都不相同时，选取与杂质中的阴、阳离子都不共存的阴、阳离子组合出除杂试剂。如NaNO3（CuSO4）：可选用Ba（OH）2溶液为除杂试剂（生成物为 Cu（OH）2沉淀和BaSO4沉淀，达到目的）。 4、除杂方法的几个优化原则： ①若同时有多种方法能除去杂质，要选择那些简单易行、除杂彻底的方法； ②应尽量选择既可除去杂质，又可增加保留物质的方法，即“一举两得”； ③先考虑物理方法，再用化学方法。 5、除去食盐中可溶性杂质的方法 重结晶后的食盐中还含有硫酸钠、氯化镁、氯化钙等可溶性杂质，它们在溶液中主要以SO42-、 Ca2+、Mg2+ 的形式存在，为将这些杂质离子除净，应注意所加试剂要过量，过量试剂要除去，所以除杂时所加试剂顺序要求是：a、Na2CO3必须在BaCl2之后加；b、过滤之后再加适量盐酸。 试剂加入顺序有多种选择，如： （a）BaCl2、NaOH、Na2CO3、过滤、HCl （b）BaCl2、Na2CO3、NaOH、过滤、HCl （c）NaOH、BaCl2、Na2CO3、过滤、HCl

天然产物提取分离新技术

天然产物提取分离新技术 ■常温超高压技术 高压生物化学研究已经证明：压力达到一定值，蛋白质、多糖（淀粉、纤维素）等有机大分子会发生变性，但生物碱、低聚糖、甾、萜、苷、挥发油、维生素等小分子物质则不发生任何变化。 在高压生物化学的研究中还证明了：高压灭菌的机理是，压力作用于微生物，使细胞壁变性、破裂，细胞内容物外泄，从而使微生物致死。在肉、鱼、水果、蔬菜的高压加工中也证实了细胞的这种变化。 超高压提取就是利用了超高压对生物材料的这种作用实现有效成分提取的。植物细胞壁上有很多微孔，因此我们可以把植物细胞壁看作是由许多微孔组成的薄膜。当植物细胞处于溶剂中时，溶剂将通过这些微孔进入细胞内部。 1.升压时： 通过渗透作用，溶剂进入细胞内部；由于我们施加的压力非常大，因此通量很大，细胞内部在短时间内就会充满溶剂。 细胞内部充满溶剂后，细胞壁两侧压力平衡。 2.保压时： 细胞内容物与进入细胞内部的溶剂接触，经过一段时间，有效成分溶于这些溶剂中。 3.泄压时： 细胞外部的压力减小为零，细胞内部的压力仍然保持平衡时的压力，此时压力差与施加压力时方向相反。由于我们施加的是超高压，因此这种反方向的压力差仍然是很大的。 4.在反方向压力作用下，细胞壁变形；如果变形超过了其反向变形极限，细胞壁破坏；于是，溶解了有效成分的溶剂泄出，与其它溶剂汇合。 5.如果在反方向压力作用下细胞壁的变形仍然没有超过其反向变形极限，细胞内部已经溶解了有效成分的溶剂将通过渗透作用排出，与其它溶剂汇合。由于反方向压力差非常大，因此溶解了有效成分的溶剂快速且完全地泄出。

常温超高压提取技术可以使用多种溶剂，包括水、不同浓度的醇和其它有机溶剂，可以从不同的天然产物中提取不同性质（如生物碱、黄酮、皂甙、多糖、挥发油）的有效成分。 ■超声波提取技术 超声波是一种高频率的机械波。超声场主要通过超声空化向体系提供能量。频率范围在15-60kHz的超声，常被用于过程强化和引发化学反应，超声波在天然产物有效成分提取等方面已有了一定作用。其原理主要是利用超声的空化作用对细胞膜的破坏，有助于有效成分的溶出与释放，超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散，同时超声波的热效应使水温基本在57℃，对原料有水浴作用。超声波提取与传统的回流提取、索氏提取发比较，具有提取速度快、时间短、收率高、无需加热等优点。已被许多天然产物分析过程选为供试样处理的手段。 ■微波辅助提取技术 微波是一种非电离的电磁辐射。微波辅助提取（Microwave Assisted Extract ion，MAE）是利用微波能来提高萃取率的新发展起来的技术。被提取的极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦引起发热，可以保证能量的快速传递和充分利用，易于溶出和释放。微波辅助提取（以下简称微波提取）的研究表明，微波辐射诱导萃取技术具有选择性高、操作时间短、溶剂耗量少、有效成分收率高的特点，已被成功应用在药材的浸出、中药活性成分的提取方面。它的原理是利用磁控管所产生的每秒24.5亿次超高频率的快速震动，使药材内分子间相互碰撞、挤压，这样有利于有效成分的浸出，提取过程中，药材不凝聚，不糊化，克服了热水提取易凝聚、易糊化的缺点。 微波萃取技术有一定的局限性，只适宜于对热稳定的产物。 ■酶法提取技术 天然植物的细胞壁由纤维素构成，其中的有效成分往往是包裹在细胞壁内。酶法就是利用纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等（主要是纤维素酶），破坏植物的细胞壁，以利于有效成分最大限度溶出的一种方法。酶反应可以较温和的将植物组织分解，从而大幅度提高提取效率。 ■分子蒸馏技术

蛋白质分离纯化的一般程序

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品 纯化方案是由几种纯化方法组成的，一般选择的依据是从抽提液中有效成分和

常见的分离与提纯的方法

常见的分离与提纯的方法： (1)物质分离与提纯常用的物理方法 粗盐提纯时把粗盐 溶于水， 溶于水的杂质除去 KNO3 变化大， 度随温度变化小， 用该法从二者的混 合液中提纯 从食盐水溶液中提 取食盐晶体 制无水乙醇 灰 浓硫酸或 2]

CCl4 2 水、苯的分离除去

除去 体， 过盛有饱和 溶液的洗气瓶 粗碘中碘与钾、钠、钙、镁的碘化物混合， 特点将碘与杂质分开 精制除去中的

的NaOH溶液，生成Fe(OH)3和NaAlO2，过滤后，分别再加盐酸重新生成Fe3+和Al3+。注意转化过程中尽量减少被分离物质的损失．而且转化后的物质要易恢复为原物质。 ④酸碱法 被提纯物质不与酸或碱反应，而杂质可与酸或碱发生反应，可用酸或碱作除杂试剂。例如：用盐酸除去SiO2中的石灰石，用氢氧化钠除去铁粉中的铝粉。 ⑤氧化还原法 a．对混合物中混有的还原性杂质，可加入适当的氧化剂将杂质氧化为被提纯物质。例如：将氯水滴入混有FeCl2的FeCl3溶液中，除去FeCl2杂质。 b．对混合物中混有的氧化性杂质，可加入适当还原剂将杂质还原为被提纯物质。例如：将过量铁粉加入混有FeCl3的FeCl2溶液中，振荡过滤，除去FeCl3 杂质。 ⑥调节pH法 通过加入试剂来调节溶液的pH，使溶液中某组分沉淀而分离的方法。一般加入相应的难溶或微溶物来调节。例如：在CaCl2溶液中含有FeCl3杂质，由于Fe3+水解，溶液呈酸性，可采用调节溶液pH的方法将Fe3+沉淀除去，为此，可向溶液中加氧化钙或氢氧化钙或碳酸钙等。 ⑦电解法 此法利用电解原理来分离、提纯物质。例如：电解精炼铜，将粗铜作阳极，精铜作阴极，电解液为含铜离子的溶液，通直流电，在阳极铜及比铜活泼的杂质金属失电子，在阴极只有铜离子得电子析出，从而提纯了铜。

分离纯化蛋白质的方法及原理

（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分

总结生物药物分离纯化的方法

总结归纳本课程介绍的可用于物质分离纯化的方法，并说出每种方法的原理。 萃取分离法 溶剂萃取法原理： 利用物质在两种互不相溶的液相中分配特性不同而进行的分离 设法使一种溶解于液相的物质传递到另一液相的操作 pH影响分配系数-表观分配系数 双水相萃取原理：利用生物物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行分离的过程 反胶束萃取原理：表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，非极性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水性物质能够溶于极性核内部的水中，由于周围的水层和极性基团的保护，蛋白质不与有机溶剂接触，从而不会造成失活。 超临界萃取原理：当气体物质处于其临界温度(Tc)和临界压力(Pc)以上时，不会凝缩为液体，只是密度增大，具有许多特殊的物理化学性质：流体的密度接近于液体的密度,粘度接近于气体；在临界点附近,超临界流体的溶解度对温度和压力的变化非常敏感； 固相析出分离法 盐析法原理： 盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。 破坏双电层：在高盐溶液中，带大量电荷的盐离子能中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。 破坏水化层：中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。 有机溶剂沉淀法原理： 1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。 等电点沉淀法原理： Pl时分子表面静电荷未零，双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用。主要：去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。 成盐沉淀法原理： 1.金属离子沉淀 所用的金属离子，包括Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等。 蛋白质和酶分子中因为含有羟基、氨基、咪唑基和硫氢基等，均可以和上述金属离子作用形成盐复合物。 分离沉淀→复合物分解→除金属离子（离子交换或金属螯合剂EDTA） 2.有机酸类复合盐 含氮有机酸如苦味酸、苦桐酸和鞣酸等能够与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉析出。工业上用此法制备蛋白质时，需采取较温和的条件，有时还加入一定的稳定剂，以防止蛋白质变性。 亲和沉淀法原理：

几类类天然产物的提取分离方法

几类类天然产物的提取分离方法

几类类天然产物的提取分离方法 本人总结了一些分离方法，以抛砖引玉！ 总述 1)提取前文献查阅综述和药材生药鉴定2)提取方法 ①粉碎成粗粉 ②有机溶剂法和水提法③水蒸气蒸馏法④升华法 3)分离纯化法 ①根据物质溶解度的不同进行分离 a.温度不同,溶解度不同 b.改变溶液的极性去杂 c.酸碱法 d.沉淀法 ②根据物质分配比不同极性分离 a.液-液萃取法 b.反流分布法 c.液滴逆流层析法 d.高速逆流层析法 e.GC法 f.LC法:LC分配层析载体主要有---硅胶,硅藻土,纤维素等;有正反相之分;压力有低、中、高之分;载量有分析、制备之分。 ③根据物质吸附性不同极性分离 a.※极性吸附剂（如SiO2,Al2O3...)极性强，吸附力大 ※非极性吸附剂(如活性炭－对非极性化合物的吸附力强(洗脱时洗脱力随洗脱剂的极性降低而增大)。 b.化合物的极性大小依化合物的官能团的极性大小 而定; 溶剂的极性大小可按其介电常数大小排列 （极性渐大> ）: 己烷苯无水乙醚CHCl3 AcOEt 乙醇甲醇水e 1.88 2.29 4.47 5.20 6.11 26.0 31.2 81.0 c.氢键力吸附聚酰胺吸附层析--洗脱剂的洗脱力由小到大为: 水> 甲醇> 丙酮> NaOH液> 甲酰胺> 尿素水液 ④根据物质分子的大小进行分离 如葡萄糖凝胶(Sephadex G and LH-20...)过泸法等 ⑤根据物质解离程度不同的分离法离子交换法： 强酸：-SO3H 强碱：-N+(CH3)3Cl- 弱酸：-CO2H 弱碱：-NH2(NH,N) 一、糖及苷类的提取和分离 1 溶剂处理法 2 铅盐沉淀法 3 大孔树脂处理法 4 柱色谱分离法 二醌类化合物的提取和分离 一提取方法: 一般选用甲醇或乙醇为溶剂，可同时将游离态和成苷的蒽醌类化合物从药材中提取出来，浓缩后再依次用有机溶剂提取（多用索氏提取法），可根据极性大小不同进行初步分离（如将苷和苷元分开）。

的分离纯化.doc

mRNA的分离纯化 【实验原理】 真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。其中rRNA为75％～85％，tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。 真核生物mRNA有特征性的结构，即具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20~300个腺苷酸组成的poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。 一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT)纤维素柱，即可得到较纯的mRNA。 目前常用的mRNA的纯化方法有： （1）寡聚（dT）－纤维素柱层析法，即分离mRNA的标准方法； （2）寡聚（dT）－纤维素液相离心法，即用寡聚（dT）－纤维素直接加入到总的RNA溶液中并使mRNA与寡聚（dT）－纤维素结合，离心收集寡聚（dT）－纤维素／mRNA 复合物，再用洗脱液分离mRNA，然后离心除去寡聚（dT）－纤维素；