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基因工程总结

基因工程

第一章绪论

1、基因工程的含义：

按照人们的意愿，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种

在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的新的生物类型。

2、基因工程的优点：

①打破物种间基因交流的隔离界限；②克服常规育种的周期长，效率低的缺点，定向改造生物性状；③可按照人的

意愿去改造物种。

3、基因工程理论依据：

①不同基因具有相同的物质基础；②基因是可分割的；③基因是可以转移的；④多肽与基因之间存在对应关系；⑤

遗传密码是通用的；⑥基因可以通过复制传递给下一代。

注：基因工程及其应用的图解看看

第二章DNA重组的相关技术及原理

1、重组DNA技术的原理

重组DNA技术是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体(受体)内，

使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序

2、碱性SDS法提取质粒DNA

原理：强碱使所有DNA变性沉淀，而pH为中性时，质粒DNA复性快，形成闭合环状从沉淀物中分离。

3、提取DNA总的原则

①保证核酸一级结构的完整性；

②其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；

③核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

④其他核酸分子，如RNA也应尽量去除。

4、核酸鉴定

①浓度鉴定②纯度鉴定③完整性鉴定

5、限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。

6、限制性内切酶的命名

①用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。

大肠杆菌(Escherichia coli )Eco

流感嗜血菌(Haemophilus in flue nzae ) Hin

②用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Eco k, Eco R (现在都写成平行，如Eco R)。

③如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制性内切酶，用罗马字母表示。如Eco RI，Ecc RV。

属名种名株名

Haemophilus in flue nzae D 嗜血流感杆菌D 株Hi n d III

Eco RI —Escherichia coli RI

Hin d in—Haemophilus in flue nsae d 川

Sad (II) —Streptomyces achromagenes I ( n )

7、限制性核酸内切酶的作用机制

以环状和线形的双链DNA为底物，在适合的反应条件下，识别一定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断开，产生具有3' - 0H基团和5'—P基团的片段。

&同裂酶：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶

完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如Hi n d n和Hsu I。

不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。如Xma和Sma。

9、同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。女口 Bar HI 、Bgl n 、Bel l 、Xho n 等

10、酶活性单位(U):在最适反应条件下，一个 DNA 分子上含有一个酶切位点， 60 min 内切割1 g 入DNA 所需的

酶量称为一个单位。

11、星号(* )活性：如果改变反应条件就会影响酶的识别位点专一性和切割效率，称为星号( * )活性。

12、基因工程的其他酶

(1) DNA 连接酶:DNA 连接酶能催化双链 DNA 切口处的5'-磷酸和3'-羟基生成磷酸二酯键。； (2) DNA 聚合酶 (Klenow fragment ) 性质 ①5' 3'聚合酶活性。②3'

5'外切酶活性。(失去了 5'

3'外切酶活性)

用途①3'端补平②DNA 的3'末端标记，在3'隐蔽端加上标记的 dNTP ③cDNA 第二链的合成 ④双脱氧末端终止法测定DNA

序列

(3) 核酸酶S1

催化反应类型：ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性区

13、聚合酶链式反应 PCR : PCR 技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增(包括分离)一段目的基因的技术。

加入4种物质： (1) 作为模板的DNA 序列；

(2) 与被分离的目的基因两条链各自5'端序列相互补的 DNA 引物(20个左右碱基的短

DNA 单链);

(3) TaqDNA 聚合酶；

(4) dNTP( dATP, dTTP, dGTP 禾口 dCTP 。 14、 PCR 技术的原理

(1) DNA 模板变性(2) DNA 模板与引物复性(3) DNA 链的延伸 15、 PCR 的过程

第一步预变性(pre-denature ) 90-95 o C 下5分钟，模板DNA 双链完全变性成单链。第二步变性(denature )双链完全变性成单链第三步复性(anneal ) 37-60 o C 下1分钟，引物优先与模板复性。 ① 引物的浓度高② 引物的链短。

第四步延伸(extend ) 72 o C 下1-2分钟，Taq DNA 聚合酶在引物的3 '端上加上核苷酸。第五步

变性进入循环重复 94 o C 下1分钟，新合成的 DNA 双链又变性成单链模板。

16、 PCR 扩增特异性DNA 片段的主要条件 (1) Taq DNA 聚合酶

(2)引物(primer) (4)模板(template)

(5) dNTPs

(6) Mg 的浓度 17、PCR 的特点 (1) 特异性强

(2)敏感性高

(3)快速 (4)简便

18、电泳的基本原理

DNA 在中性或偏碱性的缓冲液中带负电，在电泳过程中处于凝胶靠负极端的 19、电泳迁移率：与DNA 分子的构型和大小有关与DNA 分子中的碱基组成和顺序无关 DNA 分子的构象(型)：1型：超螺旋环状 n 型：带切口环状

川型：线状

相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快；线性分子次之；伸展开环状最慢

20、影响连接反应的因素 (1) 插入片段与载体的浓度比例

(10~20倍增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。

)

(2) 反应温度 (一般14~16C )

(3)

反应缓冲液

(5 )可以扩增mRNA

DNA 通过凝胶分子筛向正极端移动

第三章基因的克隆载体

1、载体：在基因工程操作中，携带目的基因、实现目的基因进入受体细胞，并在其中得以无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

2、按功能划分：

①克隆载体（cloning vector）:使目的片段能在细菌细胞中复制的载体。

②表达载体（expression vector）:使目的基因能在细菌细胞中表达为RNA或蛋白质的载体。

3、基因克隆载体的必备条件：

①多克隆位点；②能自我复制，有一个复制起点；③选择性标记；④安全。

4、标记基因的作用：①指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞；②指示外源DNA分子是否插

入载体分子形成了重组子。这种指示也可以是选择性的，也可以是非选择性的，绝大多数为后者。

5、质粒：独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。

6、质粒的空间构型：①共价闭合环状DNA（cccDNA）;②开环DNA（ocDNA）；③线形DNA（lDNA）

7、质粒空间构型与电泳速率：scDNA最快、L DNA次之、ocDNA最慢。

8质粒的不亲和性（不相容性）：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不亲和性或不相容性，这两种质粒称为不亲和性质粒，组成不亲和性群；而彼此能够共存于一个细胞中称为亲和性质粒，亲和质粒则属于不同的不亲和群。

9、天然质粒的局限性：

①分子量大，拷贝数低；②筛选标记不理想；③单一酶切位点少或无。

10、质粒载体的构建策略：

①提高质粒载体的拷贝数；②引入多克隆位点MCS;③引入抗性标记基因；

④克隆载体DNA分子应尽可能小；⑤

在克隆载体中组装“元件”。

10、筛选重组子的示意图一一重点

11、互补：

蓝白斑选择原理：①X-gal;② -半乳糖苷酶的显色反应；③ lacZ的互补。

12、穿梭质粒载体：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。

13、T i质粒载体：存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒。

14、T i质粒作为载体的可能性：

①能够自发地整合到植物的染色体上；②能转化多种植物；③强启动子一一T-DNA的opine合成酶基因上游有一个

强启动子，能启动外源基因的表达。

15、天然Ti质粒作载体的缺点：

①分子量太大（200kb）；②限制性酶切位点太多。③被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。④在大肠杆菌中不能复制。

16、T i质粒的改造：

①保留T-DNA的转移功能部分（vir基因，左右边界）。②减少限制性酶切位点，引入单一插入位点。③取消T-DNA

的致瘤基因，使被转化的植物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。④冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。⑤加入大肠杆菌的ori和选择标记。⑥加上真核生物的转录信号和结束信号以及添加polyA的信号序列。

17、Ti载体的类型：①共整合载体——需要同源重组才能插入外源基因；②双元载体一既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。

18、cos 位点: DNA两端各有12bp 的粘性末端：粘性末端形成的双链区域称为cos 位点。

19、天然噬菌体作为载体的局限性：

① 噬菌体的非必需区太长；②非必需区段上常用的单一限制酶切点少；③选择标记基因少；④载体的安全性

20、噬菌体载体的构建：

构建策略：①删除噬菌体的非必需区，在这个非必需区内制造限制酶切点，删除DNA必需区段上常用的限制

酶切点；②在非必需区引进选择标记基因。③建立DNA重组分子体外包装系统

21、cosmid载体（粘粒）：一类由人工构建的含有入噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，

cos site —carry ing vectors 。

22、酵母人工染色体：

①YAC的特点：（1）只能在酵母细胞中扩增。（2）克隆容量大，为230kb-1700kb。（3）构建原理，按染色体结构构建。

②YAC的组成结构：（1）着丝粒区（Cen）; （2）端粒（Tel）；（3）复制起点（Ori）；（4）克隆位点；（5）在酵母中

的标记基因；（6）在细菌中操作；

第四章目的基因的制备

1、基因组文库：将某种生物整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将所有这些片段都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和无性扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，也称为基因文库。

2、基因组文库构建的一般步骤：

①基因组DNA片段的制备；②载体的准备一一相应的酶切，脱磷酸化等处理阻止载体自连

:③载体与基因组DNA片段的连接一一粘性末端直接连接；人工接头法；同聚物加尾；④转化细胞和克隆选择。

3、cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA,再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA 文库（cDNA library），也称基因文库（gene library）。

4、cDNA文库的特点：

①以mRNA为材料，是RNA病毒进行基因克隆的唯一途径。

②不含内含子序列，可以在细菌中直接表达。

③克隆数比DNA文库小的多，容易筛选。

④常来自结构基因，包含了所有编码蛋白质的基因，筛选的假阳性率低。

⑤结构基因的表达具有器官、代谢阶段特异性，由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同。

⑥在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，表现不均匀性。

5、不对称PCR（asymmetric PCR）

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。

方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般是50:1或100:1,关键是限

制性引物的绝对量。

6、差别杂交：需要两种不同的细胞群体（目的基因正常表达、目的基因不表达），分别制备两种不同mRNA提取物，

以两种总mRNA探针平行杂交，对有表达目的基因的总mRNA反转录构建的cDNA文库进行筛选。

7、差别杂交的局限性：

①杂交灵敏度低，对于低丰度的mRNA尤为明显；②工作量大，需大量的杂交滤膜和鉴定大量的噬菌斑；③重复性差，两套平行滤膜之间的DNA保有量有差别，导致杂交信号不一致。

8消减杂交：

原理：通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建消减文库的方式来分离目的基因。有mRNA消减杂交和基因组消减杂交。前者适合分析两样本中差异表达的基因，后者适合克隆两样本特异性存在的基因。

9、mRNA差异显示PCR（ DD RT-PCR :用3 -端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链；用3 -端锚定引物和5'-

端10-mer 随机引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增（mRNA differential display RT-PCR，DDRT-PCR，在标准的序列胶中电泳2~3小时，可显示出50~100条长度在100~5000 bp之间的DNA条带。

10、染色体步移（chromosome walking ）: 首先以已知基因或分子标记为探针从基因组文库中筛选与其有共同序歹U

的克隆，再以该克隆为探针从文库中筛选与其有部分重叠序列而且更靠近目的基因的新克隆，同理，再以新克隆为

探针依次筛选新克隆，直至所需克隆的目的基因。

11、基因芯片技术（gene chip）特点：

①高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读；②多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差；③微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率；④自动化：降低成本，保证质量。

第五章目的基因导入受体细胞

1、DNA体外连接应注意的事项：

①插入片段与载体的酶切位点互补

②DNA插入的方向正确

③插入基因的开放阅读框（ORF正确（1）DNA定位插入载体（2）起始密码

④防止载体自身环化连接（1）提高插入片段的用量（2）用碱性磷酸酶处理载体

2、大肠杆菌受体细胞的选择

①重组缺陷型：避免与受体基因组进行同源重组，便于重组DNA独立存在

②限制缺陷型：避免修饰和降解，使重组DNA稳定存在易于转化或转导：提高细胞的通透性，较高的转化率

③遗传互补型：有明显的选择性差异，有利于重组体筛选具有较好的翻译后加工，有利于真核基因表达

④感染缺陷型：防止感染，安全性高，无致病基因

3、感受态大肠杆菌的制备

制备原理：当细菌处于0C、二价阳离子（如Ca2+、MgT等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态；此时转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNA在42C短时间热冲击后吸

附在细胞表面而利于进入，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。

4、外源DNA导入细菌的几种方法

（1）转化（2）转染（3）转导

5、重组质粒导入受体的转化方法

（1）热激法或热休克转化法（2）电转化法（3）平板培养细菌

6、重组DNA导入真核细胞

（1）酵母细胞①利用原生质体进行转化②利用Li +盐进行转化

（2）植物细胞①农杆菌介导法②电击法③基因枪法

（3）哺乳动物细胞①磷酸钙沉淀法②脂质体（lipofectin ）载体法③显微注射法③DEAE---葡聚糖转染法

7、重组体克隆的筛选和鉴定

①遗传表型直接筛选法②DNA电泳检测法③核酸杂交检测法④免疫化学检测法

⑤转译筛选法⑥真核生物常用的重组基因选择方法⑦DNA序列测定

8根据载体的抗药性标记进行筛选

pBR322抗菌素标记选择（图已省---打出来黑的）

①四环素抗性基因

②氨苄青霉素抗性基因

③-半乳糖苷酶显色反应选择法

9、核酸杂交检测法

①Souther n hybridizatio n 原理

根据毛细血管作用的原理，使在凝胶电泳中分离的DNA片段转移并结合到适当的滤膜上，然后通过同已标记的单链

DNA或RNA探针进行杂交，以检测被转移DNA片段，成为DNA印迹杂交技术。也称Southern杂交

②Norther n hybridization ___ 原理

指根据毛细管作用的原理，使在凝胶电泳中已分离的RNA转移并结合到适当的滤膜上，然后通过同已标记的单链DNA 或RNA探针进行杂交，以检测被转移RNA片段，称为RNA印迹杂交技术，也称为Northern杂交（Northern blot ）

③Dot blot hybridizati on 原理

在杂交的基础上发展起来的用于快速检测特异核酸分子的杂交技术。将核酸样品直接转移到适当的滤膜上，然后进行杂交检测。

④Colony and plaque hybridizati on 原理

将菌落或噬菌斑直接转移到滤膜上，使溶菌班变性的DNA同滤膜原位结合，然后进行杂交测验。

杂交后根据杂交信号及其相对应的菌落或噬菌斑的位置，便可从大量菌落或噬菌斑中筛选出含有目标基因序列（与探针同源）的菌落或噬菌斑。所以，有时也称菌落（噬菌斑）原位杂交。

11、酶联免疫吸附测定（ELISA）原理：

一抗（primary antibody ）:与目标分子的特异结合。

二抗（secondary antibody ）: 与一抗的特异性结合。

酶联（enzyme-link ）:二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。

12、一般克隆与筛选策略

13、H AT法原理

选择培养基中有次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷,培养基中的氨基喋啉阻断细胞核苷酸的全程合成，但启动以次黄嘌呤为底物进行核苷酸的补救合成途径，不受氨基喋啉的抑制，另外培养基中的胸苷可通过胸苷激酶的作用合成核苷酸, tk +能合成核苷酸，而tk「不能合成而死亡。

14、二氢叶酸还原酶基因（DHFR （看图背原理）

（1）选择原理

①二氢叶酸还原酶的必要性：真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。

二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸

DHF f 细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存，不需要

补救！

DHFR 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。胸

苷和次黄嘌呤，

DHFR-细胞可通过补救合成途径维持生长。

② 胸苷和次黄嘌呤补救

无四氢叶酸提供甲基，dNTP 合成受阻时，胸苷和次黄嘌呤分别补救：

（2）选择过程 ① 宿主细胞

DHF 艮田胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长） ② 无核苷酸的培养基

透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。

③ 氨甲喋啉“加压” 添加少量氨甲喋啉抑制内源性 DHFR 勺补救作用，可提高选择。

④ 载体标记

DHFF 基因。只有转入DHFF 基因的细胞才能生存。

15、报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。 16、几种常用的报告基因 (1) 大肠杆菌的 3 -D-葡萄糖醛酸糖苷酶 (B -D-glucuronidase , GUS ;

(2)

细菌和萤火虫的荧光素酶 (luciferase , luc )；

(3) 水母绿色荧光蛋白( GFP 基因 (Green Fluoresce nt Protein )。

17、 DNA 序列测定的方法 (1) 化学降解法测序

原理：一个末端标记的 DNA 片段在4组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或某一类碱基。造成碱基的特异性切割，由此产生的一系列具有不同长度的 DNA 寡聚核苷酸链，经凝胶电泳分离

和检测，读出核苷酸序列。 (2) 双脱氧链终止法测序

原理：(1) DNA 聚合酶在模板指导下，聚合酶不断将 dNTP 加到引物的3' -OH 末端，能利用单链的 DNA 作为模板合

成出准确的DNA 互补链；

(2)如果加入双脱氧三磷酸核苷 (ddNTP ),由于双脱氧核糖的 3'位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP 形成

磷酸二酯键，从而终止DNA 链的延长。即形成一种全部具有相同 5'-引物端和以ddNMF 残基为3'端结尾的一系列

长短不一片段的混合物。聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链

DNA 从而读取DNA 的核苷酸序列。

18、双脱氧终止法测序反应体系包括：

① DNA 聚合酶 ② 单链DNA 模板

③ 引物，通常由20-23个碱基构成，G+C=12 A+T=8到11, Tm=60-68C ，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构 Mg2+

④ 4 种 dNTP(dATP,dGTP,dCTF 和 dTTF) ⑤ 4 种 ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTF 和 ddTTF)

不能在无胸苷和次黄嘌呤的培养基中生存。当加入需要补救！

。需要胸苷和次黄嘌呤补救!

第六章外源基因的表达

1、外源基因的表达系统：基因工程的主要目的之一，就是要制备大量有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。得到了克隆的基因或cDNA后，按照正确的方向插入表达载体，连在启动子的后面，导入相应的宿主细胞，即可进行表达。在不同的表达系统中，其表达方式不尽相同。

2、外源基因的有效表达关键：起始转录。

3、mRNA的延伸与稳定性：

外源基因的有效表达的关键：保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在。

构建载体需考虑因素：

①避免非特异性终止，加入抗终止序列；②加入正常转录终止序列，减少DNA反向转录为反义mRNA的机会;

③选择受体菌Rnase缺失(原核)；④加入poly(A)的信号序列AAUAAA有利于mRNA的正确加工(真核)。

4、表达蛋白在细胞中的稳定性

几个方面考虑：①融合蛋白，外源蛋白与受体蛋白有良好的杂合构像；②分泌蛋白，外源蛋白能分泌到细胞周质

腔或直接分泌到培养基；③包涵体，外源蛋白以包涵体的形式存在与于受体细胞；④选择蛋白水解酶基因缺陷型的

受体系统

5、融合蛋白的优点：

①融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。②可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化。③原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白质。④目的蛋白溶解性好，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。

6、分泌蛋白的优点：

①目的蛋白稳定性高；②目的蛋白易于分离；③目的蛋白末端完整。

7、包涵体形式的优点：

①能简化外源基因表达产物的分离操作；②能在一定程度上保持表达产物的结构稳定

8、启动子：能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的DNA序列。

9、启动子的分离：①随机克隆法；②聚合酶保护法；③过滤膜结合法；④PCR扩增法

10、随机克隆法：

①选用适当的核酸内切酶消化切割的染色体DNA分子；②接着将切割产生的DNA限制片段与一种无启动子的质粒

载体重组，使克隆的片段恰好插入在紧邻报告基因（galK）的上游位置；③随后把此重组混合物转化给大肠杆菌寄

主细胞，构成质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。

11、增强子：远离转录起始点数千个碱基的能增强启动子转录活性的DNA顺式作用元件，对转录有增强作用，约为100?200bp,有单拷贝或多拷贝。

特征：

①双向性；②重复序列；③无位置特定性；④特异性（组织）；⑤功能不受基因来源影响

12、终止子：转录启动后，RNA酶沿DNA链移动，持续合成RNA链，直到遇到转录终止信号。

13、原核表达系统的注意事项：

①外源基因不能带有内含子。②必须用cDNA，不能直接用真核基因组DNA。③必须利用原核细胞的调控原件（启

动子等）。④防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。

14、外源蛋白在大肠杆菌中的表达：

①细胞质中表达：

优点：易于分离；免受蛋白酶降解；蛋白质没有活性，不损害寄主细胞

缺点：蛋白质的终产量偏低，蛋白质种类多，纯化复杂；蛋白质的生产成本比较昂贵；空间结构错误，一般无生物

学活性；蛋白质修饰的环境不利于二硫键的形成。

②周质中表达：

优缺点：周质中蛋白质种类比较少，目标蛋白质的纯化就比较简单；蛋白质酶解的程度不甚严重；促进了二硫键

的形成及蛋白质的折叠作用（氧化环境）；蛋白质的N—末端结构真实；信号肽并非总是有助于蛋白质的转运；有可能形成包涵体。

③胞外表达：

优缺点：蛋白质的酶解作用程度低；分泌到胞外的蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；蛋白质N-末端的结构真实，增进了蛋白质的折叠作用；外源真核蛋白质，通常是不会分泌到胞外培养基中去的；分泌在胞外培养基中的蛋白质

相当稀释，目标蛋白质的纯化过程复杂。

15、高效表达目的基因的策略：

①优化表达载体的设计；② 增加mRNA的拷贝数和稳定性；③提高表达产物的稳定性；④优化发酵过程。

16、酵母表达系统优点：

①表达调控机制较清楚；②有翻译后的加工修饰系统；③可分泌外源蛋白到培养基中，易纯化；④酵母不含毒素，

安全性高；⑤大规模发酵工艺简单，成本低。

17、酵母表达系统缺点：

①表达量普遍低；②常发生质粒丢失；③重组蛋白常常超糖基化；④分泌困难。

18、表达载体组成：

①启动子；②终止子；③ T-DNA;④选择标记基因与报告基因。

19、选择标记基因：能在转化体中有效表达并易于检测或定量分析。

20、报告基因：报告和识别作用，它的表达产物对植物细胞无毒性，可反映外源基因在植物细胞中的转译水平。

基因工程实验报告

基因工程实验报告、

小麦GAPDH截短体的重组与表达摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。关键字：小麦基因；载体；感受态前言基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。（一）实验过程

1.实验部分流程：

2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存

基因工程应用实例及基因工程前景展望

基因工程应用实例及基因工程前景展望高一（6）陈韬 1、什么是基因工程（又称基因拼接技术和DNA重组技术）？是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。 2、原理？基因重组：通过将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，从而使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的——DNA 提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种。 3、应用？（1）农牧业、食品工业运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。

（2）环境保护基因工程做成的DNA 探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。利用基因工程培育的指示生物能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。（3）医药卫生 1.基因工程药品的生产： ⑴基因工程胰岛素 ⑵基因工程干扰素 ⑶其它基因工程药物 2.基因诊断与基因治疗： ◆SCID 的基因工程治疗 1. 转基因鱼 2. 转基因牛 3.转黄瓜抗青枯病基因的甜椒 4.转鱼抗寒基因的番茄 5.转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯 6.不会引起过敏的转基因大豆 7.超级动物 8.特殊动物 9.抗虫棉

基因工程实验(答案)

——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结）答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的）答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义）答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解； ②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75）答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31）答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq

基因工程简答题总结

基因工程原理复习题思考题 5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。） 6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。 7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案） 1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。 2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 3、足够多的载体和插入片段是最重要的。 4、平端的连接对于离子浓度很敏感 5、尽可能缩小连接反应的体积 6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好 8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1）大肠杆菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶 5）修饰过的T7 DNA聚合酶 6）逆转录酶 7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统 1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？

生物选修3专题1 基因工程知识点复习学案

专题1 基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过________________________，赋予生物以 _____________________，创造出______________________________________。基因工程是在____________上进行设计和施工的，又叫做__________________。 1. （1 （2 （3 2. (1)两种DNA ②区别：E· (2)与DNA 酸二酯键。 3. （1 （2 _____________________的双链___________DNA （3）其它载体： _________________________________ (二)基因工程的基本操作程序第一步：__________________________ 1.目的基因是指： ______________________________________________________ 。 2.目的基因可采取_______________-获得，也可以用_____________________。人工合成目的基因的常用方法有________________和_________________。 3.PCR技术扩增目的基因（1）原理：_____________________ 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是________________，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 _______________。此方法的受体细胞多是 ____________。将目的基因导入微生物细胞：★原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是 ____________，其转化方法是：先用 ________处理细

基因工程总结

简述Southern blot,northern blot,western blot的原理，比较它们的不同. 答：Southern Blot 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。DNA => 琼脂糖电泳=> 印迹转移=> 预杂交=> 杂交（变性探针）=> 洗膜=> 放射自显影或显色Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 mRNA提取=> 甲醛变性电泳=> 印迹转移=> 预杂交=> 杂交（变性探针）=> 洗膜=> 放射自显影或化学发光 Western Blot 与 Southern Blot或 Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。不同：所用于分析的对象不同。 Northern杂交用于分析RNA； Southern杂交用于分析DNA； Western杂交用于分析蛋白质。转基因动物与转基因植物的产生有什么不同？答：技术原理相同，用转基因技术将具体特殊经济价格的外源基因导入动植物体内，不但表达出人类所需要的优良性状（如抗虫，抗病，抗除草剂，抗倒伏，产肉，产蛋量高）,还可以通过蛋白质重新组合得到新的品种。但是，对动物和植物进行目的基因导入的方法不同。动物一般采用显微注射法将带有目的基因的病毒注入细胞；而植物一般采用农杆菌转化法或基因枪法将目的基因导入受体细胞。

基因工程技术笔记整理

基因工程技术：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造出新的生物类型。质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中，它具有自主的复制和转录系统。质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝。质粒的不相容性：利用共同复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共存。从细胞中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。溶菌酶：破坏菌体细胞壁；SDS和Triton X-100：使细胞膜裂解。染色体DNA通常用于构建基因组文库和Southern杂交等。基因组DNA的提取植物基因组DNA提取：提取缓冲液（Tris.Cl—保持pH,EDTA,NaCl,SDS），氯仿/戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNA，异丙醇—沉淀DNA（提染色体），TE（Tris.Cl,EDTA）--溶解DNA，RNase—保存液，降解RNA，NaAC—加盐，70%乙醇—漂洗。细菌基因组DNA提取：SDS，蛋白酶K，氯仿：异戊醇（24：1）-- 沉淀DNA，苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）-- 抽提，70%乙醇—漂洗，TE,NaCl—调节离子强度，RNase A，CTAB/NaCl 溶液—CTAB--一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，异丙醇/无水乙醇—沉淀上清液。总RNA制备 mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。仪器—玻璃器皿：200℃烘2h，塑料器皿：DEPC水液处理—所有器皿最后硅烷化处理。 RNA酶抑制剂：DEPC--强烈但不彻底，与氨水溶液混合会产生致癌物；异硫氰酸胍--最有效，使RNA酶失活；其他--RNA酶蛋白抑制剂（RNasin）SDS, 尿素等。细胞内总RNA制备方法：异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。（均先将组织在液氮中研磨成粉末）异硫氰酸胍热苯酚法：异硫氰酸胍(GIT)与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT与十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)作用使蛋白质变性。酚/SDS法：用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质，用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA 和其它不纯物。 Trizol法：Trizol试剂（含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等）。 mRNA提取制备mRNA原理：分离的总RNA 可利用mRNA3’端含有poly(A)的特点，用oligo(dT)纤维素柱分离，当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。然后经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。（上样buffer和洗脱buffer）。溶液中无盐时要沉淀RNA，必须加盐NaAC。琼脂糖凝胶电泳 DNA凝胶电泳：琼脂糖-- 分离DNA片段大小范围广；聚丙烯酰胺-- 小片段，分辨力高。

基因工程基本过程

基因工程基本过程基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA 技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为"克隆"）和行使正常功能（称之为"表达"），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA 结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。主要过程有为四步：一．获得目的基因有多种方法可获得目得基因 1.构建cDNA文库分离目的基因过程：（1）从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA的第一条链。（2）以第一条链为模板，以反转录酶或DNA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二条链。（3）在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。

（4）接头或衔接子连接。（5）凝胶过滤分离cDNA。（6）通过核酸探针法或免疫反应法从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。 2.人工化学合成法适于已知的核苷酸序列且校小的ＤＮＡ片断合成，常用方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。过程：先用以上方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡核苷短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形较长的ＤＮＡ片段，再用连接酶连接成完整的基因。 3.利用PCR技术直接扩增目的基因 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物，类似于DNA的天然复制过程，用ＰＣＲ法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。二．载体的选择与制备 1.载体的选择（以质粒为例） ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。 (6)应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别 (7)应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。 (8)应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，且所产生的mRNA较为稳定。 (9)所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。 2.制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。

基因工程知识点总结归纳更新版

基因工程绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单

基因工程复习笔记

第一章一、电泳电泳(eletrophorosis) :带电荷的分子在电场中以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动.移动速度称为电泳迁移率。影响因素：1 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 2. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 3当电场强度一定,电泳介质相同,电荷相同的分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状(构型)。 4分子形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。指示剂：溴酚蓝（Bb）：常用指示剂。分子量670，分子筛效应小，近似于自由电泳，呈蓝紫色。二甲苯青(Xc)：分子量554.6，呈蓝色，迁移速度比Bb慢。染料：溴化乙锭（EB） 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳优点：比琼脂糖凝胶的分辨率高的多；回收DNA样品纯度高，无色透明，韧性好，银染的凝胶干燥后可长期保存；能装载的DNA量大，达每孔10μgDNA。 2 、SDS-PAGE 原理：SDS是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上相同密度负电荷。SDS与蛋白质结合使蛋白质构象改变，成为形状近似雪茄状的长椭圆棒，SDS-蛋白质复合物短轴相同，而长轴与蛋白质的分子量成正比。

蛋白质-SDS复合物电泳的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒的长度，即蛋白质分子量有关。二、PCR技术定义：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，以DNA为模板，在引物、dNTPs、Taq酶的作用下，经变性－退货－延伸反复循环，使某个基因在体外特异性地扩增。 PCR法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR 扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。影响因素：（1）Taq DNA聚合酶（具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但没有3’→5’外切酶活性因此不能修复错误的碱基配对）。（2）引物（primer）一般引物设计为长15—30bp；位置与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA；引物的碱基组成：尽可能提高G+C含量，避免连续相同碱基排列或内部回文序列，避免形成引物二聚体。（3）引物的Tm值：实际复性温度选择低于Tm值5 oC。（4）dNTPs 含量适中（5）Mg 2+ 的浓度（6)对照实验三、PCR技术的扩展：反向PCR：不对称PCR：差异显示PCR。反向PCR 原理：扩增两个引物外侧的未知序列，使引物的外侧序列“转变” 成内侧序列。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，

分子生物学实验心得体会

关于分子生物学实验的体会梁慧媛（生技01 级）不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。分子生物学实验心得体会刘东强（生科01 级）分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值刘佳凝（生技01 级）一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我

生物实训实验报告

生物实训实验报告篇一：细胞生物学实验社会实践报告建立一个动物细胞培养室与植物细胞培养室所需的条件与社会价值无菌环境是细胞离体培养的最基本条件，所以构建一个细胞培养室需要保证工作环境不受微生物和其他有害物质污染，并且干燥无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室。一、基础实验室配置 ⑴消毒间：消毒间主要为了处理实验器材以及实验材料，营造一个无菌的试验环境，一般消毒间会配备超净实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉、酸缸等。 ⑵无菌操作间：一般由缓冲间和操作间两部分组成。缓冲间在外侧，多用于实验之前的准备，例如：更衣，准备实验材料，处理实验数据等，可放置电冰箱,冷藏器及消毒好的无菌物品等。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱,离心机,倒置显微镜等。工作人员进入操作间一定要消毒并更衣。（3）培养基配制间：主要用于配置细胞培养所用的培养基。主要包括冰箱、天平、微波炉、pH计、培养基分装器、

药品柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。（4）培养室：用于培养细胞，放置以接种的培养基等。为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。（5）洗涤间：主要用于清洗实验之后的用具。除配置水槽外，还需配置洗液皿、落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等，有需求的还可以配置洗瓶机。以上基础设施若实验室条件不够，可将消毒间，培养基配制间，洗涤间合并一起，但注意实验室卫生以及仪器摆放，房间要保持清洁，明亮。二、辅助实验室细胞学鉴定室：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相系统等。生化分析室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分

6.2基因工程及其应用教学设计案例.doc

6.2基因工程及其应用教学设计案例基因工程及其应用 --案例一、教学目标的确定课程标准中与本节内容相对应的具体内容标准是："关注转基因生物和转基因食品的安全性"，这也是本节要达成的主要教学目标。课程标准并未明确指出本章要讲述基因工程的内容，考虑到本章教材知识体系的完整性，以及学生达成上述目标所需要的知识基础，本节还将"简述基因工程的基本原理"，"举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用"作为教学目标。二、--思路第一课时--流程图如下。第二课时--流程图如下。三、教学实施的程序教师组织引导学生活动教学意图教师通过图片和音像资料展示基因工程产品，如种子、水果、疫苗或药物等，

引入课题。教师利用"问题探讨"，提出问题，组织学生讨论、交流看法。 ·为什么能把一种生物的基因"嫁接"到另一种生物上？ ·推测这种"嫁接"怎样才能实现？ ·这种"嫁接"对品种的改良有什么意义？教师小结：从杂交育种的局限性切入，人类可以利用基因工程技术按照自己的意愿直接定向改变生物。说明本节教学目标。教师肯定学生合理的想法，引发思考。 "你的想法很好，可是用什么样的方法才能实现你的设想呢？" 教师用类比的方法引导学生思考基因工程的大致步骤和所需要的工具：剪刀、针线、运载体等。并用问题启发学生："你能想像这种‘剪刀加浆糊’式的‘嫁接’工作在分子水平的操作，其难度会有多大吗？" 以ecor i为例，构建重组dna分子模型，体会基因的剪切、拼接、缝合的道理。教师交代清楚ecor i是已发现的500多种限制性内切酶中的一种，它是一种从细菌中发现的能在特定位置上切割dna分子的酶。它的特殊性在于，它在dna 分子内部"下剪刀"，专门识别dna分子中含有的"gaattc"这样的

专题一、基因工程知识点归纳

专题一基因工程一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。二【课时安排】2课时三【考纲知识梳理】第1节DNA重组技术的基本工具教材梳理：知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。注意：对本概念应从以下几个面理解：知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” （1）限制性切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。（2）限制性切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性切酶的切割式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体（2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。（3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸

二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意：比较有关的DNA酶（1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基（2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。（2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。（3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。基因进入受体细胞的载体──“分子运输车”的学习容，不能仅仅着眼于记住这几个条件，而应该深入思考每一个条件的涵，通过深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件才能充当载体。教材拓展：拓展点一限制酶所识别序列的特点限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱

基因工程实验报告(程庆佳,生物技术,20091070004)

大肠杆菌核糖核苷酸HII基因的克隆及其检测（基因工程实验报告）程庆佳（云南大学，生命科学学院，生物技术，20091070004）（班级：周二下午实验班; 组号:第八组; 老师：赖建华；同组员：顾聚）摘要：此次实验的目的是对大肠杆菌核糖核苷酸HII基因的克隆及其检测，其中的关键步骤包括了大肠杆菌基因DNA的提取，PCR扩增，DNA体外重组，感受态细胞的制备，重组DNA的转化，重组转化的检测等多种具有紧密连接性的实验，使学生可以掌握一套具有连贯性的实验过程，帮助学生塑造连贯试验的观念，从而得到更好地成长与进步。关键词：提取、扩增、重组、感受态细胞、转化、检测正文：此次实验的最终目的是要使学生连贯性的掌握本学期的实验，所以要求我们要熟悉每个实验的原理过程，以及实验结果的准确分析，只有这样才能保证实验最终结果的准确性，才能真正地掌握此次实验。 1、大肠杆菌基因组DNA的提取原理： DNA是一个环形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内。不同种属的生物，以及不同形式的细胞（如菌类、培养细胞、植物组织，动物组织）基因组提取的方法是不同的，但其基本原则是类似的，即既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K 的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA 分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。简要步骤：（1）、菌种活化：将菌落接种于LB培养基中，37度培养过夜（2）、取1ml菌液转入1.5ml离心管中，5000rpm离心1分钟，去上清。（3）、加入500ulTE，50ul 10% SDS，5ul蛋白酶K，混匀，55度，保温20min （4）、加入50ul，5M Nacl混匀，再加入50ul CTAB 提取液，混匀，65度，20min （5）、去蛋白：300ul的酚和氯仿，轻轻混匀，10000rpm，2min （6）、上清转入另一个干净的1.5ml离心管，加入等体积氯仿异戊醇，轻轻混匀，10000rpm，2min，上清转入干净的1.5ml离心管中（7）、加入1/10体积的醋酸钠，2倍体积的无水乙醇轻轻旋转小试管，可见絮状沉淀，即为染色体丝，10000qpm，3min收集沉淀（8）、弃上清，沉淀用500ul 75%乙醇洗涤两次（每次10000rpm离心1min）

基因工程总结

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