山参_园参_西洋参和红参的超氧化物歧化酶活性比较_李红艳

表2 不同除内毒素方法

T ab 2 Differ ent metho ds of depyro genatio n

名称方法

热压灭菌法使用热压灭菌锅,在121 加热20min 。活性炭吸附法

加入溶剂量的0.2%和0.5%的活性炭,煮沸15m in,0.45 m 的微孔滤膜过滤。

微孔滤膜滤过法采用0.22 m 的微孔滤膜过滤。超滤法采用分子量1 105和3 104的超滤膜,4000r m in -1,离心15min 。

微波法

采用微波辐射,功率700W,工作时间120s 。

表3 除内毒素效率考察T ab 3 Effect of depy rog enation

方法名称

外加浓度

/EU mL -1

反应时

间/s RSD /%实测值/EU mL -1清除率/%

阳性对照10.04763.279.62热压灭菌法10.06850.83

3.8861.2

活性炭吸附0.2%10.0>3600>99.0活性炭吸附0.5%10.0>3600>99.0微孔滤膜10.05064.41

5.7242.8超滤3000010.010219.590.4795.3超滤10000010.09252.070.6693.4微波法10.0

535

3.03

2.3776.3

从实验结果上看,对除内毒素效果最好的是活性炭,在最低检测浓度为0.10EU m L -1的情况下,两个浓度都没有检测出内毒素,说明该方法对内毒素的清除率在99.0%以上;其次是超滤法,内毒素分子量在10 105,离心超滤后的内毒素清除率也达到了93%以上;在注射剂灭菌时常采用的热压灭菌法,对内毒素也有一定的清除作用。3 讨论

实验所用溶液全部采用细菌内毒素检查用水,目的在于避免含内毒素溶液可能对实验产生的干扰;由于细菌内毒素检查用水不会对实验有干扰,因此省略鲎试剂与内毒素反应的干扰试验。

由于该方法的灵敏度在50%~200%之间,在制作标准曲线时发现,相同条件下(鲎试剂、内毒素

工作标准品、细菌内毒素检查用水、仪器)某一具体浓度的成胶时间会有差别,时间差会达到甚至大于100s 。因此,建议在每次检测时都要随行标准曲线。

实验结果显示,活性炭吸附对内毒素的清除效果最好,在中药注射剂的生产过程中一般采用活性炭进行吸附内毒素和脱色;在基因工程中也用于疏水性较低的、低分子量蛋白质或多肽,在微酸性环境中吸附去除内毒素物质。不过要注意活性炭的用量,以免造成有效成分的损失,以及活性炭吸附内毒

素后的残留和安全性问题。此外广泛应用于血液透析以及蛋白类药物生产的超滤法对内毒素也有较好的清除率,但应注意选择适当分子量的滤膜,在有效去除内毒素的同时减少目的蛋白的损失。总之,在选择去除内毒素方法时,应根据所需除内毒素物质的性质以及有效成分的转移率,综合考察以筛选最佳除内毒素方法。

参考文献:

[1] Jiang Z,H ong Z,Guo W,et al .A s ynthetic peptid e derived

from bactericidal./permeability -increasing protein neu traliz es end otoxin in v itr o and in v iv o [J ].Int Im munopharmacol,2004,4(4):527-537.

[2] 焦炳华.分子内毒素学[M ].上海科学技术文献出版社,1995:

15.

[3] 劳海燕,林秋晓,杨敏,等.在线血液透析滤过液中细菌内毒素

定量法的研究[J].南方医科大学学报,2006,26(2):242-244.[4] 孔祥文.活性炭吸附蛋白质溶液中的内毒素物质的研究[J].中

国药学杂志,1999,34(6):407-409.

[5] 尹楠,李红阳,彭国平.超滤法去除中药注射液中的细菌内毒素

[J].中国医药工业杂志,2008,39(12):927-929.

[6] 卓仪,陈怡禄,孙晓蕾.动态浊度法测定复方毛冬青注射液中的细菌内毒素含量[J].中药新药与临床药理,2008,19(4):291-293.

[收稿日期]2009-12-17

[基金项目]国家科技支撑计划项目(编号:2007BAI 38B 02);国家自然科学基金项目(编号:30873371) [作者简介]李红艳,女,博士研究生,电话:0431-********,E -m ail:lhyw aiw @https://www.sodocs.net/doc/749031392.html, [通讯作者]赵雨,男,研究员,电话:0431-********,E -m ail:cnzhaoyu @https://www.sodocs.net/doc/749031392.html,

山参、园参、西洋参和红参的超氧化物歧化酶活性比较

李红艳,赵雨,刘宏,杨士慧,赵大庆 (长春中医药大学中医药与生物工程研发中心,吉林长春130117)

[摘要] 目的:对山参、园参、西洋参及红参水提取物进行超氧化物歧化酶(SOD)活性比较研究,为人参药材的质量评价和临床应用提供依据。方法:采用考马斯亮蓝法测定4种参水提取物中蛋白含量,采用改良的邻苯三酚自氧化法分别测定4种参的SOD 活力,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及NBT 显色法进行4种参的酶活显示。结果:山参、园参、西洋参的SO D 活力分别为109.642,16.048,7.612U mg -1,红参SOD 活力几乎为零。结论:4种参的SOD 活力不同,其中山参的酶活力最高。[关键词] 山参;园参;西洋参;红参;超氧化物歧化酶

[中图分类号]R 966 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2010)14-1177-03

C omparison on the SO

D activities of wild ginseng,cultivated ginseng,american ginseng and red ginseng

LI H ong-yan,ZH AO Yu,LIU H o ng,YANG Sh-i hui,Zhao Da-qin(1.Center fo r N ew M edicine R esear ch of Chang-chun U niv ersity of T r aditio nal Chinese M edicine,Jilin Chang chun130117,China)

ABSTRAC T:OBJECTIV E T o co mpa re t he SOD activ ities of w ild ginseng,cultiv ated g inseng,american g inseng and red g in-seng.METHODS U sing Co omassie br illiant blue method to deter mine the protein concentr atio n,using improv ed pyr og allol au-to-ox idation method and N BT photo reduction metho d to deter mine the SOD activit y.RESULTS T he SO D activity of w ild g in-seng,cultivated g inseng and amer ican g inseng w as109.642U mg-1,16.048U mg-1and7.612U mg-1,r espectively.T he SO D activ itit y of r ed g inseng could no t be o bser ved.C ONC LUSION Wild g inseng has t he hig hest enzyme activ ity.

KEY WORDS:wild ginseng;cultivat ed g inseng;american g inseng;red g inseng;SOD

人参为五加科植物人参(P anax g inseng C A. Meyer.)的干燥根及根茎。野生者为 山参 ,栽培者为 园参 ,园参经蒸制后的干燥品称 红参 。西洋参为五加科植物西洋参(Panax quiquef olium L.)的根,均系栽培品,晒干或低温干燥。对山参、园参、西洋参和红参的药材性状、显微结构、理化性质、临床应用等方面的研究已有报道[1-5]。对人参超氧化物歧化酶(superox ide dism utase,SOD)的研究,自1992年侯冬岩关于 人参超氧化物歧化酶的研究 报道之后,一直没有学者进行比较系统的研究,对4种参进行SOD活力比较的研究亦未见报道。SOD是一种能清除生物体内产生的超氧阴离子自由基(O-2 )的金属蛋白酶类。该酶具有潜在药用价值,用于治疗各种疾病,如缺血再灌注损伤、血管病、炎症、衰老等,并且该酶又具有较高的催化活性和化学稳定性,可以被做为药剂学及临床研究的参考因素[6]。本实验对4种参水提取液进行蛋白含量和SOD活力比较研究,为进一步探讨4种参在抗氧化、抗衰老等方面的药理作用提供科学依据。

1 材料

UV mini-1240紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司);DYY-8C电泳仪(北京六一仪器厂);5年生山参,园参、西洋参及红参均购自于吉林省靖宇县,经长春中医药大学研发中心姜大成教授鉴定,山参(Radix et r hiz oma g inseng)、园参(Ra-dix et r hiz oma g inseng)和红参(Radix et rhiz oma ginseng r ubr a)均为五加科植物人参P anax gin-seng C A.M eyer.的干燥根及根茎;西洋参(R adix p anacis quinquef olii)为五加科植物西洋参(P anax quiquef olium L.)的干燥根;三羟甲基氨基甲烷(T ris,批号88S10F100),丙烯酰胺(批号74S10730),N-N甲叉双丙烯酰胺(批号88J10880)均为北京鼎国生物技术有限公司Genview分装产品;N,N,N ,N -四甲基乙二胺(TEM ED,美国Am resco公司,批号20070608);NBT(氮蓝四唑,德国Sigm a公司,批号N6876);Bradford蛋白质定量试剂盒(北京T iang en公司,批号080709)。

2 方法与结果

2.1 4种参水提取物的制备 取山参、园参、西洋参、红参各1根,磨粉,分别称取各参粉末1.4g,加入7mL10mmo l L-1T ris-H Cl(pH7.4)缓冲液, 4 浸提24h,10000r min-1离心10m in,上清液用0.45 m滤膜过滤,得4种参水提取液各5m L。分别取出1.5mL备测活和电泳,其余液体冷冻干燥。冻干品称质量,并折算成5mL水提液冻干品,记作水提物质量。结果见表1。

2.2 山参、园参、西洋参、红参水提取物蛋白含量测定

2.2.1 标准曲线绘制 采用Bradford法测定蛋白含量,即将0,10,20,30,40,50,60 L牛血清白蛋白(BSA)标准溶液(1g L-1)分别加入到ep管中,加入PBS缓冲液补足到150 L,混匀。从各管中依次取出15 L,加入285 L考马斯亮蓝染色液,混匀,室温放置5~10min。转置96孔板中,用酶标仪测定595nm 处的光密度值。以不含BSA的缓冲液的光密度值作为空白对照,以蛋白浓度[mg (15 L)-1]为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制标准曲线。

2.2.2 水提物蛋白含量测定 分别称取山参、园参、西洋参、红参水提取物各0.1g,加入PBS缓冲液配成100g L-1液体(可适当稀释)。各取15 L,按照上述Br adfo rd法测定蛋白浓度并计算蛋白含量。将所得蛋白含量与水提物质量的乘积记作蛋白质量。结果见表1。

从表1可以看出,4种参的水提取物以山参收率最高,红参次之,园参与西洋参较低;蛋白收率以园参最高,西洋参次之,山参较低,红参最低(几乎为零)。

表1 山参、园参、西洋参、红参蛋白收率

T ab 1 P rotein y ield o f wild g inseng ,cultiv ated ginseng,a -mer ican g inseng and r ed g inseng

类别

参粉质

量/g

水提物质量/g 水提物收率/%蛋白含量/%蛋白质量/g 蛋白收

率/%山参1.40000.465733.261.240.00580.41园参1.40030.283320.234.430.01260.90西洋参1.40020.275719.693.480.00970.69红参1.40020.342624.470.260.0008

0.06

2.3 山参、园参、西洋参、红参SOD 活力测定 采用

改良的邻苯三酚自氧化法[7]进行酶活力测定。以1mL 反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时所需的酶量定义为一个活力单位。在碱性条件下,邻苯三酚会发生自氧化,可根据SOD 抑制邻苯三酚自氧化能力测定SOD 活力。测活结果见表2。

表2 山参、园参、西洋参、红参SO D 活力

T ab 2 T he SO D act ivit y o f w ild ginseng,cultivated g in -seng,american ginseng and r ed g inseng.

类别体积/mL 单位活力/U mL -1总活力/U 比活/U mg -1

p rot 山参5127.184635.922109.642园参540.442202.21216.048西洋参514.76873.8417.612红参

5

11.204

56.019

从表2可以看出,4种参的SOD 活力各不相同,以山参最高。

2.4 山参、园参、西洋参水提取物的凝胶电泳及活性显示 采用PAGE 电泳,每孔上样20 L 。使用分离胶浓度7.5%,浓缩胶浓度2.5%。电泳结束后,胶片依次在2.45mmo l L -1NBT 和36mm ol L -1磷酸缓冲液(内含28m mol L -1TEM ED,2.8 10-2

,pH 7.8)中黑暗浸泡20min,于50mmo l L -1

磷酸缓冲液(内含0.1mm ol L -1EDT A,pH 7.8)中,4 8W 日光灯光照30min 。结果见图1

。

图1 山参、园参和西洋参的聚丙烯酰胺凝胶电泳a.西洋参;b.山参;c.园参

Fig 1 Non -denatu red polyacrylamid e gel electroph oresis of w ild gin -s eng,cultivated gins eng,american gin sen g and red ginseng a.american gins eng;b.w ild gins eng;c.cultivated gin sen g

经活性染色和光照后的凝胶,出现蓝色背景上有清晰透明的SOD 活性谱带且3种参的谱带位置相同(Rf 值相等),说明3种参所含SOD 分子量基本相同。3 讨论

山参和园参因生长环境不同,临床疗效有显著差异。本实验对山参和园参SOD 活力进行比较,结果表明,前者活力明显高于后者,这很有可能是导致山参补力大于园参的原因之一。

本实验结果表明,红参的蛋白含量和SOD 活力均明显低于园参,这说明人参在加热炮制过程中大部分蛋白变性,SOD 也很大程度失活。这将对人参的炮制加工工艺起到一定的借鉴作用。

西洋参与人参同为五加科人参属植物,二者均有补益、抗衰老等功效。本实验中西洋参的SOD 活力明显偏低,这揭示了二者抗衰老机制与物质基础可能存在很大差异。

根据电泳可以分离不同分子量的蛋白以及SOD 可以抑制NBT 光还原的特点,本实验对园参、山参和西洋参进行了凝胶电泳和活性显示。三者的谱带位置相同,表明3种参中SOD 分子量相等,这说明3种参的SOD 具有较高的同源性。

本实验针对生物大分子成分,对四者进行SOD 比较研究。结果提示,SOD 可以作为评价各种参补益及抗衰老作用的指标之一。

参考文献:

[1] 王莉.人参与西洋参的比较鉴别[J ].海峡药学,2007,19(4):

58-59.

[2] 陈燕.鲜人参、生晒参和红参的比较研究[J].海峡药学,2006,

18(4):137-139.

[3] 印敏芳.山参质量的经验鉴别[J ].中国药业,2006,15(9):56-57.

[4] 楼余淦,凌明,程存归,等.生晒山参、西洋参、红参和生晒参的

FTIR 图谱研究[J ].中草药,2003,34(7):665-667.

[5] 柳良燕.人参、西洋参功效比较及用法研究[J].实用医技杂志,2008,15(34):41-43.

[6] Anne Dees,Ach im Zahl,Ralph Puchta,e t al .Water Ex change

on seven -coordinate M n(II)com plex es w ith macrocyclic penta -dentate ligan ds:insight in th e mechanism of M n(II)SOD m-i metics[J].In organic Ch emis try,2007(46):211-217.

[7] GB/T 5009 171-2003.保健食品中超氧化物歧化酶(S OD)活性

的测定[s].413-414.

[收稿日期]2009-11-11