WesternBlot实验步骤及注意事项(精)

western blot的实验步骤及注意事项

一、实验步骤

1. 缓冲液配制

(1 Transfor Buffer: 2.9g Glycine, 5.8gTris, 0.37g SDS（可不加）, 200ml Methanol （临用前加）,ddH2O to 1L

(210×TBS: 1 M Tris·HCl （pH 7.5）100 mL, 88 g NaCl, ddH2O to 1L

(3TBST: 1×TBS 中加入1/1000的Tween

(4封闭液：脱脂奶粉5%(w/v,用TBST 配制

2. SDS-PAGE

电泳电压：积层胶电泳电压80V 左右，分离胶电泳电压110V~120V

3. 免疫印迹

(1 SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳结束后，将胶放至转移缓冲液中浸泡15m in，切6张 Whatman 3mm滤纸和1张PVDF 膜，与凝胶大小相符合。将PVDF 膜事先用甲醇浸泡，再用转移缓冲液浸泡。

(2 将凝胶及PVDF 膜以“三明治”状(即3层滤纸、凝胶、PVDF 膜、3层滤纸

逐层铺于转印仪上，凝胶一面连接阴极，100 V转移40 min（根据转移蛋白的分子量确定转移时间）。

(3 将膜放入小盒中，加入5 mL封闭液，摇床上温育1 h。

(4 以1/1000的比例，加入5 μL 第一抗体，4 ℃温育过夜。

(5 TBST溶液洗膜10 min，轻倒，重复3次。

(6加入 5 mL TBST溶液，以1/2000的比例，加入2.5 μL 第二抗体，温育1 h。

(7 TBST溶液洗膜5min ，轻倒，重复3次。

(8加入2 mL显色底物温育3 min，将薄膜封入保鲜袋中，压平，尽可能不留空气，滤纸吸干显色底物。放入夹板中。

(9配制显影液和定影液。暗室操作：将X 光片放入夹板中，曝光5 s（根据荧光强度确定），然后放入显影液中，至出现明显的条带取出，水洗后放入定影液中，定影一段时间，取出用水冲洗干净。

二、注意事项

1. 在Western 实验中，通常有人采用TBS ，有人采用PBS ，能否有人解释一下二者在使用中的区别？

选择合适的缓冲液对于维持一定PH 值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS 的缓冲能力强于TBS （因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS 在PH7.0以下缓冲能力较弱（不过PBS 易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS ；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选

PBS 。

Western blot中使用TBS 和PBS 均可，只是要根据需要选择合适的浓度。

2. 没有注明可以用来做Western blot的一抗，可以用来做Western blot吗？

不一定, 因为有的抗体是识别线性表位的, 有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于western blotting，因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。

3. 做Western 每次只加一种一抗，请教有人同时加两种或者多种一抗的吗？

最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western 在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL 显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL

显色、压片、洗片。

4. Western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF 好还是NC 膜，能介绍一下膜的

选择吗？

PVDF 膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF ，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。都可以用丽春红染

色。具体使用还要参考相关文献。

5. 为什么出现了多条带, 每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律, 为什么? 是封闭时间不够吗, 请指教 .做WESTERN 必须要内参吗？

一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，抗体的特异性不强，目的蛋白经过处理后发生变化, 而内参的条带基本均匀一致. 这样才有说服力, 表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化. 所以严格意义上说, 内参是必须做的。

6. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？

可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白

质和NC 膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转

移膜，或使用小孔径的NC 膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。

7. DAB显色、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理是什么？

DAB 显色在辣根过氧化酶的作用能形成一种灰褐色的终末产物，该产物难溶于醇和其他有机溶剂，DAB 的氧化还能引起聚合作用，导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色中，酶将奈酚磷酸（底物）水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐（显色原）结合而产生有色的、不溶性偶氮染料。

8. 酶显色与荧光显色之间，各自的优缺点是什么？

免疫酶技术就是用酶(如辣根过氧化物酶标记已知抗体(或抗原，然后与组织标本在一定条件下反应，如果组织中含有相应抗原(或抗体，抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应，这样就可以识别出标本抗原(抗体分布的位置和性质，通过图像分析并可达到定量的目的。

免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断，但是荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法，对石蜡切片标本尤为适用，为免疫病理研究开辟了一条新途径，酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察，免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术，前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应，称为非标记抗体酶技术。

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

生理学实验报告教案

生医2012秋生理学实验报告 指导教师： 实验员： 学号： 联系方式：

实验一骨骼肌的观察及骨骼肌的单收缩与强直收缩 【目标要求】 1.掌握蛙类动物单毁髓的实验方法。 2.掌握坐骨神经-腓肠肌标本和坐骨神经干标本的制备方法。 3.学习肌肉收缩的记录方法。 4.观察与分析肌肉单收缩的三个时相，分析骨骼肌收缩形式与刺激频率之间的关系。 【基本原理】 蛙类动物的某些基本生命活动，如神经的生物电活动、肌肉收缩等与哺乳动物相似。其离体组织所需的生活条件比较简单，易于控制和掌握，而且动物来源丰富，因此在生理学实验中常用蟾蜍的坐骨神经—腓肠肌标本永和坐骨神经标本来观察组织的兴奋性、刺激与反应的规律以及骨骼肌收缩的特点等。 肌肉受到一次阈上刺激而产生的一次收缩为单收缩，其过程可分为三个时相，即潜伏期、缩短期与舒张期。肌肉收到连续的阈上刺激时，如果刺激间隔小于单收缩的时程，相邻两单收缩的时相会出现融合，表现为强直收缩现象。如果表现为每次收缩的开始发生在上次收缩的舒张期，称不完全强直收缩，如果表现为每次收缩的开始发生在上次收缩的缩短期，称完全强直收缩。躯体运动是以骨为杠杆，以关节为枢纽，由肌肉收缩产生动力完成的。 【材料与器械】 蟾蜍或蛙，蛙类手术器械（手术剪、手术镊、眼科剪、眼科镊、金冠剪、毁髓针、玻璃针、固定针），蛙板，玻璃板，锌铜弓，小烧杯，滴管，纱布，细棉线，任氏液。 BL-420生物机能实验系统（或其他生理记录仪），张力换能器。 【实验步骤】 1.双毁髓的方法 一手握蟾蜍，食指按压头部前端，拇指压住躯干背部，令其背部向上，头向前俯；另一手持毁髓针在左右耳后腺之间，背部的凹陷处将毁髓针垂直刺入，然后将针尖向前刺入颅腔，搅动以捣毁脑组织，此时的动物为单毁髓动物。彻底捣毁脊髓时，可见蟾蜍后肢突然蹬直，然后瘫软。如动物仍表现四肢肌肉紧张或活动自如，表明未毁坏脊髓，必须重新毁髓。 2.剥制后肢标本 将双毁髓的蟾蜍背面向上放在蛙板上，一手持手术镊轻轻提起两前肢之间背部的皮肤，另一手持手术剪横向剪开皮肤，暴露脊柱。用金冠剪横向剪断脊柱。一首持手术镊提起断开的脊柱后端，另一手用金冠剪沿脊柱两侧剪开体壁，再剪断下腹壁肌肉，使头部、前肢及内脏自然下垂，将其自腹后壁剪除。然后用蘸有任氏液的左手捏住断开的脊柱后端，右手向后方撕剥皮肤，将剥干净的后肢放入盛有任氏液的培养皿中。弃其头部、内脏及剥下的皮肤，清洗手及手术器械上的污物。 3.分离两后肢 左手托起去皮的标本，右手持金冠剪直接剪开耻骨联合，随后剪开两后肢相连的肌肉组

WB实验步骤

Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续

平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：

westernblot实验详细步骤(1)

Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分

2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h

（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二

常用运动生理学实验操作流程

常用运动生理学实验操作流程体育系运动人体科学实验中心

人体安静、运动时脉搏、血压的测定 [实验目的] 了解人体动脉血压测定的原理，学会人体在安静时和运动前后脉搏及血压的测定。 [实验原理] 血压的测定，最常用的是间接法。通过使用血压计在动脉外加压，根据血管音的变化测定血压。通常血液在血管内流动时并没有声音，如果对血管施加压力，使血管腔变窄而形成血液涡流时可发生血管音。当外加压力超过动脉血压的收缩压时，受压部位的血流完全被阻挡，此时在受压部位的远侧听不到声音。当外加压力低于收缩压而高于舒张压时，血液则可断续地通过受压部位使血流形成涡流而发出声音。当继续降低压力时，且外加压力等于舒张压时，受压部位的血流由断续流动恢复到持续流动，受压部位远侧的声音则由强变弱或突然消失。因此，动脉血流刚能发出声音时的最大外加压力相当于收缩压，而动脉内血流声音突变后消失时的外加压力则相当于舒张压。正常成人安静时心率约在60—-100次/分。心率常受年龄、性别、生理状况、训练水平、体力劳动及体育运动的影响。在实践中通过测定血压、心率可了解受检查者循环系统的功能，了解运动量、运动强度、运动训练对人的影响、运动后的恢复情况、运动的密度。 [实验对象] 人体 [实验器材]

血压计、听诊器、秒表、电子节拍器 [实验步骤] 一、安静时脉搏血压的测定 （一）脉搏的测定 1.扪诊法桡动脉扪诊法：在测试安静脉搏时较为方便。 颞浅动脉扪诊法：位于耳前部略偏上，颞浅动脉经过此处，适合于运动后。 心前区扪诊法：位于左心前区心尖部，适合于运动后。 颈动脉扪诊法：位于胸锁乳头肌前、下颌角下部。 2.器械法 听诊法：用听诊器在心前区直接听诊，计算心率。 心率遥测仪：可准确记录运动中和运动后心率。 （二）安静时动脉血压的测定。 1.将脉压带绑在被试者的上臂，其下缘应距肘关节上约2--3厘米，松紧以能放入一指为宜。 2.在肘窝内侧找到搏动点，将听诊器头紧贴肘窝肱动脉处。 3.把气球的气门旋紧打气，随脉压带内的压力升高，逐渐可以听到有节奏的“咚咚”声，继续打气等声音消失时再使压力升高20--30毫米汞柱或2--4千帕，然后旋开气门徐徐放气。 4.在放气时注意听有节奏的“咚咚”声响的第一声出现时，水银面所指示的压力即为收缩压。 5.继续放气，随压力逐渐下降，听到突然变声或声音消失时，水银面

Westernblot基本操作步骤

W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳

最详细的WesternBlot过程步骤详解

最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解

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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

生理学实验的注意事项

实验的注意事项 1、动物麻醉注意事项？ （1）正确选用药品、用药剂量及给药途径。 （2）静脉麻醉时，先将总量的1/3快速注入，使动物迅速渡过 兴奋期，余下2/3 缓慢注射，并观察动物状态及反应， 以准确判断麻醉深度。 （3）需补充麻醉药时，一次补量不超过总量的1/5 。 （4）麻醉中应随时保持呼吸道通畅，注意保温。 （5）在手术操作复杂、创伤大、实验时间较长或麻醉深度不 理想等情况下，可配合局部浸润麻醉或基础麻醉。 （6）实验中注意体液平衡，防止酸中毒及肺水肿的发生。 2、影响血液凝固因素注意事项？ 1 采血过程要尽量快，以减少计时误差，对比实验的采血时间要紧接着进行。 2 每支试管口径大小及采血量要相对一致，不可相差太大。 3 判断凝血的标准要一致，一般以倾斜试管达45°时试管内血液不见流动为准。 4液体石蜡不能加得过多，影响凝血时间观察 3、红细胞脆性实验注意事项？ 1试管要干净； 2 NaCL溶液配液要准确； 3 加入大小基本相同的一滴血液； 4 轻轻混匀，减少机械溶血机会； 5 静置时间不少于30min。中途不得人为振荡。观察结果时动作尽量要轻，且在光线明亮处进行4、血红蛋白测定注意事项？ （1）血红蛋白吸管和比色管要清洁； （2）吸取血液要准确，避免起泡； （3）滴加蒸馏水时逐滴进行，防止一次加入过多； （4）酸化时间不能少于10min； （5）在自然光下比色。 5、心肌特性实验注意事项？ 1.破坏蛙的大脑和脊髓要彻底。 2.经常给心脏滴加任氏液，以保持心脏适宜的环境。 3.张力传感器与蛙心夹之间的丝线应保持适宜的紧张度，间距一般小于20cm 4.铜丝与心室接触良好的同时，还应尽量不让其阻碍心脏的自发收缩。

WB操作步骤-自己整理

Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。

2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。

植物生理学实验课程

《植物生理学实验》课程大纲 一、课程概述 课程名称（中文）：植物生理学实验 （英文）：Plant Physiology Experiments 课程编号：18241054 课程学分：0.8 课程总学时：24 课程性质：专业基础课 前修课程：植物学、生物化学、植物生理学 二、课程内容简介 植物生理学是农林院校各相关专业的重要学科基础课，是学习相关后续课程的必要前提，也是进行农业科学研究和指导农业生产的重要手段和依据。本实验课程紧密结合理论课学习内容，加深学生对理论知识的理解。掌握植物生理学的实验技术、基本原理以及研究过程对了解植物生理学的基本理论是非常重要的。本大纲体现了植物生理学最实用的技术方法。实验内容上和农业生产实践相结合，加强学生服务三农的能力。实验手段和方法上，注重传统、经典技术理论与现代新兴技术的结合，提高学生对新技术、新知识的理解和应用能力。 三、实验目标与要求 植物生理学实验的基本目标旨在培养各专业、各层次学生有关植物生理学方面的基本研究方法和技能，包括基本操作技能的训练、独立工作能力的培养、实事求是的科学工作态度和严谨的工作作风的建立。开设植物生理学实验课程，不仅可以使学生加深对植物生理学基本原理、基础知识的理解，而且对培养学生分析问题、解决问题的能力和严谨的科学态度以及提高科研能力等都具有十分重要的作用。 要求学生实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期结果，操作关键步骤及注意事项；实验时要严肃认真专心操作，注意观察实验过程中出现的现象和结果；及时将实验结果如实记录下来；实验结束后，根据实验结果进行科学分析，完成实验报告。 四、学时分配 植物生理学实验课学时分配 实验项目名称学时实验类别备注 植物组织水势的测定3学时验证性 叶绿体色素的提取及定量测定3学时验证性 植物的溶液培养及缺素症状观察3学时验证性 植物呼吸强度的测定3学时设计性 红外CO2分析仪法测定植物呼吸速率3学时设计性选修 植物生长物质生理效应的测定3学时验证性 植物种子生活力的快速测定3学时验证性 1

WB实验步骤

蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶

4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。

生理学实验

实验三：影响神经冲动传导的因素观察 实验目的： 1．继续学习蟾蜍坐骨神经-腓神经标本制备方法，掌握坐骨神经标本的制备方法。 2．引导蟾蜍坐骨神经动作电位，并观察其基本波形（包括双相和单相动作电位）。 3．学习和掌握神经干动作电位传导速度测定的原理和方法。 4．设计改变细胞外液的某些因素会对动作电位在神经干上传导的速度产生何种影响？ 实验原理： 蛙类的一些基本生命活动和生理功能与恒温动物相似，若将蛙的神经-肌肉标本放在任氏液中，其兴奋性在几个小时内可保持不变。若给神经或肌肉一次适宜刺激，可在神经和肌肉上产生一个动作电位，肉眼可看到肌肉收缩和舒张一次，表明神经和肌肉产生了一次兴奋。在生理学实验中常利用 如果将两个引导电极置于正常完整的神经干表面，当神经干的一端兴奋之后，兴奋波会先后通过两个引导电极(r1r1’,图5坐骨神经干包括多种类型的神经纤维成分，因此记录到的动作电位是它们电位变化的总和，因此神经干动作电位是一种复合动作电位。由于各类神经纤维的兴奋阈值各不相同，所以记录到的动作电位幅值在一定范围内可随刺激强度的变化而改变，这一点不同于单根神经纤维的动作电位。

动作电位在神经纤维上的传导有一定的速度。不同类型的神经纤维动作电位传导速度各不相同。蛙类坐骨神经干中以Aα类纤维为主，传导速度(V)大约为35～40 m/s。测-腓肠肌标本的制备，但无需保留股骨和腓肠肌。坐骨神经干要求尽可能长些。在脊椎附近将神经主干结扎，剪断。提起线头剪去神经干的所有分支和结缔组织，到达腘窝后，可继续分离出腓神经或胫神经，在靠近趾部剪断神经。将制备好的神经标本浸泡在任氏液中数分钟，待其兴奋性稳定后开始实验。 3．仪器及标本的连结 （1）用浸有任氏液的棉球擦拭神经标本屏蔽盒上的电极，标本盒内放置一块湿润的滤纸片，以防标本干燥。用滤纸片吸去标本上过多的任氏液，将其平搭在屏蔽盒的刺激电极、接地电极和引导电极上，并且使其近中端置于刺激电极上，远中，频率8～16 Hz，波宽0.1～0.2 ms，强度根据标本兴奋性而定，由小增大(一般可选2V)。示波器灵敏度0.1～0.5 V/cm，扫描速度1～2 ms/cm。外触发输入接刺激器的触发输出端。触发选择置于外触发同步。开启电子刺激器时，调节触发电平旋钮，使示波器扫描与刺激输出同步。将扫描线调至荧光屏中间。 （3）若使用计算机生物信号采集处理系统进行实验则参照图5.5-2连接仪器。两对记录电极分别连接到CH1、CH2通道，刺激电极连接到刺激输出。打开计算机，启动生物信号采集处理系统，进入“神经干动作电位”模拟实验菜单。 4．观测和测定双相值时的阈刺激。 （2）增大刺激强度的过程中，伪迹和动作电位均随之加大，但当强度加大到某一程度后(此刺激强度称为最大刺激)，动作电位就不再增大，而伪迹仍随之加大。这是区别刺激伪迹与动作电位的可靠方法之一。

Western_Blot操作步骤

Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材：组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。

生理学实验的基本原则

一、生理学实验的基本原则 （一）生物系统 生物系统一般来说在各个方面都是非常复杂的，它常常是一个分层次的“多级”系统，而且它往往是非线性的、时变的(即参数值是随时间变化的)、多输入—多输出的，其中的各个部分相互交联非常复杂，有时还是非因果性和有源的。 由于生物系统的这种复杂性，我们在研究时必须注意下面几点，以减少这种复杂性。 首先，为了避免时变性，我们往往要求生物实验在尽可能短的时间内完成。因为时间一长，离体标本或急性实验的动物会死亡，或者由于缺氧及其他原因而机能已不正常。即使对于慢性实验的动物或正常动物，时间一长，由于疲劳和饥饿或其他原因，机能状态也会发生变化。因此在搜集生物系统的数据时，实验时间必须尽可能地短。这除了在实验操作和安排上应尽量紧凑之外，在实验设计及使用的手段上也必须加以考虑，这一点我们以后还要讲到。 其次，为了减少非线性的困难，我们往往企图在一定的条件下把系统“线性化”。例如采用“小信号技术”，即使刺激信号落在正常生理负荷范围内作振幅不大的变化，以避免生物系统一般都有的“阈值”和“饱和”等非线性效应。当然采用小信号技术之后，是否确已线性化了，最后还需看由此得到的实验结果是否和理论预期相一致。 最后，为了减少生物系统各级水平和各个部分之间的相互影响，我们往往要求把我们感兴趣的系统从其内外环境中孤立出来。要完全做到这一点常常是十分困难的。因为很难把生物体内的一个系统与另一个系统分得很清楚，例如人体内的血压系统就与呼吸系统密切相关，它还与内分泌系统、水代谢系统等也有一定的关系，此外大脑皮层这样的高级中枢还要对它进行制约。再者，在生物系统中如果把它的一个“部件”不顾一切地硬从其周围环境中孤立出来，常常会失去了它原先的正常特性，因此我们在孤立某个生物系统时，必须考虑到这种可能，对于由此得出的结论必须慎重对待。但是为了简化问题／孤立还是十分必要的，只是需要慎重罢了。除了外科手术这种对系统扰动很大的方法之外，为了把生物系统中的某个部件孤立出来，还常常采用药物使它在机能上孤立出来，例如用河豚毒素可以阻断神经元的脉冲发生机制，然而却不会影响其膜电位的变化，从而可以“切断”发放脉冲本身对膜电位的反馈回路，因而便于研究刺激和膜电位之间的关系。 当研究生物的感觉系统时，为了避免运动系统对它的影响，可以注射箭毒一类的药物以阻

生理学实验总结

实验一（1）反射弧的分析 实验目的：分析反射弧的组成，了解反射弧的完整性与反射活动的关系 实验对象：蟾蜍 实验方法： 1.制备脊蟾蜍。用刺蛙针于蟾蜍头部枕骨大孔处刺入颅腔将脑组织拆毁，保留脊髓，制成脊蟾蜍。 2.用铁夹夹住脊蟾蜍下颌，悬吊在铁支架上。 观察项目： 分析：对实验结果进行分析。 1、反射活动的实现需要感受器来感受外界刺激 2、反射活动的实现需要传入传出神经来传导兴奋 3、反射活动的实现需要反射中枢来信号分析并发出指令 4是反射，5是反应 反射：是在中枢神经系统的参与下，机体对刺激的规律性反应。完成反射活动必须有完整的反射弧。如排尿反射、排便反射。 反应：接受刺激后机体活动状态的改变。反应的表现形式：兴奋与抑制。如在除去脑、脊髓（及中枢神经系统）后刺激肌肉，肌肉依然有反应。 结论：在本实验中可得什么结论。 在中枢神经系统参与下机体对刺激发生的有适应意义的反应过程 称为反射。反射活动的结构基础是反射弧。反射弧由感受器、传入神经纤

维、反射中枢、传出神经纤维和效应器5个部分构成。反射弧的 结构和功能的完整性是实现反射活动的必要条件。反射弧的任何环节发生障碍或受到破坏，这一反射活动就将发生紊乱或不能出现。 实验一（2）阈强度的测定 实验目的：掌握阈强度的测定方法，阈强度与兴奋性的关系 实验方法：制备坐骨神经腓肠肌标本。 观察项目： 分析：什么是阈强度？与兴奋性有何关系？ 阈强度：在实际测量时，把刺激持续时间和强度对时间的变化率固定, 测量能使组织发生兴奋地最小刺激强度。它可以作为测量兴奋性大小的指标。 阈强度与兴奋性成反比关系。阈强度小，表示组织兴奋性高；阈强度大，则兴奋性低。 实验一（3）刺激与反应 实验目的：了解各种组织的反应形式。 实验对象：蟾蜍 实验方法： 1.破坏蟾蜍的脑和脊髓，将蟾蜍仰卧在蟾蜍板上，暴露心脏 分析实验结果 不同组织接受同一刺激会产生不同的反应。如心脏受到肾上腺素的 刺激时，表现为兴奋，而胃肠道平滑肌则表现为抑制。 相同组织接受不同刺激其反应也有所不同。如心脏受到肾上腺素的 刺激时，表现为兴奋，而受到乙酰胆碱的刺激时，贝y表现为抑制。

生理学实验总结

生理学实验总结 实验一（1）反射弧的分析 实验目的：分析反射弧的组成，了解反射弧的完整性与反射活动的关系实验对象：蟾蜍实验方法： 1. 2. 观察项目： 制备脊蟾蜍。用刺蛙针于蟾蜍头部枕骨大孔处刺入颅腔将脑组织拆毁，保留脊髓，制成脊蟾蜍。用铁夹夹住脊蟾蜍下颌，悬吊在铁支架上。 1、反射活动的实现需要感受器来感受外界刺激 2、反射活动的实现需要传入传出神经来传导兴奋 3、反射活动的实现需要反射中枢来信号分析并发出指令 4是反射，5是反应 反射：是在中枢神经系统的参与下，机体对刺激的规律性反应。完成反射活动必须有完整的反射弧。如排尿反射、排便反射。反应：接受刺激后机体活动状态的改变。反应的表现形式：兴奋与抑制。如在除去脑、脊髓（及中枢神经系统）后刺激肌肉，肌肉依然有反应。结论：在本实验中可得什么结论。 在中枢神经系统参与下机体对刺激发生的有适应意义的反应过程称为反射。反射活动的结构基础是反射弧。反射弧由感受器、传入神经纤维、反射中枢、传出神经纤维和效应器5个部分构成。反射弧的结构和功能的完整性是实现反射活动的必要条件。反射弧的任何环节发生障碍或受到破坏，这一反射活动就将发生紊乱或不能出现。 实验一（2）阈强度的测定 实验目的：掌握阈强度的测定方法，阈强度与兴奋性的关系实验方法：制备坐骨神经腓肠肌标本。观察项目： 分析：什么是阈强度？与兴奋性有何关系？ 阈强度：在实际测量时，把刺激持续时间和强度对时间的变化率固定，测量能使组织发生兴奋地最小刺激强度。它可以作为 测量兴奋性大小的指标。 阈强度与兴奋性成反比关系。阈强度小，表示组织兴奋性高；阈强度大，则兴奋性低。 实验一（3）刺激与反应 实验目的：了解各种组织的反应形式。实验对象：蟾蜍实验方法： 1. 破坏蟾蜍的脑和脊髓，将蟾蜍仰卧在蟾蜍板上，暴露心脏。观察项目及结果 分析实验结果 不同组织接受同一刺激会产生不同的反应。如心脏受到肾上腺素的刺激时，表现为兴奋，而胃肠道平滑肌则表现为抑制。 相同组织接受不同刺激其反应也有所不同。如心脏受到肾上腺素的刺激时，表现为兴奋，而受到乙酰胆碱的刺激时，则表现为抑制。 结论 实验三（1）蟾蜍心兴奋传导系统分析 实验目的：利用结扎的方法，分析蛙心起搏点及兴奋传导的顺序。实验对象：蟾蜍 实验方法： 1. 暴露蛙心：用刺蛙针破坏蛙的脑和脊髓，将蛙背位固定于蛙板上，剪开胸部皮肤及胸骨，剪开心包膜，显露心脏。 2. 辨别蛙心静脉窦、心房、心室三部分及窦房沟、房室沟的结构和位置。

新手Western blot步骤及注意事项

WesternBlot操作步骤及注意事项 【原理】 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 【试剂及配制】 1、SDS-PAGE试剂：见试剂盒说明书。 2、电泳缓冲液 Tris（分子量121.14） 3.03g 甘氨酸（分子量75.07） 18.77g SDS 1g 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X电泳缓冲液进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X10倍，蒸馏水定容至1000ml）。电泳缓冲液使用2~3次后推荐更换。 3、转膜缓冲液 湿转法 48mmol/L Tris 2.375g 39mmol/L甘氨酸11.25g 0.0375%SDS 0.375g 加少部分蒸馏水溶解 20%甲醇200ml 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X转膜缓冲液（不含甲醇）进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X5倍，蒸馏水定容至500ml，或按10倍用量定容至1000ml等；用时取100ml，加入200ml 甲醇再加蒸馏水稀释至1000ml）。使用转膜缓冲液时注意室内通风。转膜缓冲液用于转膜一次后，建议更换新转移缓冲液，旧转移缓冲液可用于转膜前浸泡物品。 4、TBS缓冲液 1mol/LTris·HCl（pH7.5）10ml NaCl 8.8g 蒸馏水定容至1000ml 配制后室温保存，可配制成10XTBS缓冲液，使用时稀释10倍。 5、TBST缓冲液（洗膜液） 20%Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，现配现用，因含Tris缓冲液，其PH易受空气中二氧化碳影响，此外注意使用时不要直接接触到皮肤，其有致癌作用。

生理学实验的一般操作方法

生理学实验的一般操作方法 一．生理学实验方法概述 生理学实验一般可分为急性实验法和慢性实验法两大类。 １．急性实验法 是在无痛条件下剖开动物身体，对某一两个器官进行实验观察。实验过程不能太长，试验后将动物处死。它又可分为两种： （１）离体实验法 将要研究的器官或组织从活的或刚处死的动物上取出，置于接近正常生理条 件的人工环境中，以观察、研究其生理机能。如离体蛙心灌流等。 （２）在体实验法 动物在麻醉或毁坏脑或脊髓的状态下，用手术的方法暴露某一器官，观察、 研究其机能及变化规律。如心搏过程的观察、小肠运动的观察等。 ２．慢性实验法 在无菌条件下对健康动物进行手术，暴露要研究的器官或摘除、破坏某一器官，然 后在接近正常生活条件下，观察所暴露器官的某些功能、以及摘除或破坏某器官后 所产生的功能紊乱等。 二．实验动物的固定 在手术过程中，必须将麻醉动物进行固定，以限制动物的活动，保证实验或手术的利 进行。常用的固定方法有两种： １．背位固定法将动物的背部直接接触手术台的固定方法。在呼吸、循环、消化、泌尿等试验中均采用此法。 ２．腹部固定法将动物的腹部直接接触手术台的固定方法。这种固定法适用进行脑脊髓的实验。 三．实验动物的麻醉 为了使动物在实验过程中保持安静，不挣扎，必须对动物进行麻醉。麻醉的深浅可以从呼吸、某些反射的消失、肌肉的紧张程度和瞳孔的大小等加以判断。一般用夹捏后肢股部肌肉以观察其反应的简易方法了解动物的麻醉深度。 （一）常用麻醉药麻醉药可分为局部麻醉剂和全身麻醉剂两种。在生理实验中，常采用全身麻醉法，如挥发性的乙醚和非挥发性的巴比妥类、水合氯醛等。 （二）麻醉药的给药途径和方法非挥发性麻醉药的给药途径为注射给药法，主要有静脉、腹腔、肌肉、皮下和淋巴囊注射。 １. 静脉注射：兔的部位为耳缘静脉，兔耳的外缘血管为静脉，中央的血管为动脉。注射前，先剪去注射部位的被毛，用左手食指和中指夹住耳缘静脉近心端，使其充血，并用左拇指和无名指固定兔耳。用左手持注射器将针头顺血管方向刺入静脉，刺入 后再将左手食指和中指移至针头处，协同拇指将针头固定静脉内，便可缓缓注射。 如注射阻力过大或局部肿胀，说明针头未刺入血管，应拔出重新刺入。首次注射应 从静脉的远心端开始，以便进行反复注射。 ２. 腹腔注射：先剪去腹部的被毛，右手将注射器刺入下腹部腹白线稍外侧处，注射器与皮肤呈４５°夹角，若针尖通过腹肌后抵抗消失，应保持针头不动，轻轻注入麻 醉剂。腹腔注射应防止把针头刺入肠、肝、膀胱等内脏器官，因此针头刺入后须轻 轻回抽，如无肠内容物、尿液或血液被抽出，说明针头未刺入内脏。 ３. 肌肉注射：常用来麻醉禽类，注射部位多为胸肌或腓肠肌等肌肉较发达的部位。固定动物后，右手持注射器，使之与肌肉呈６０°夹角，一次刺入肌肉。注射完毕后 用手轻轻按摩注射部位，帮助药液吸收。