枯草芽孢杆菌实验报告

微生物技术综合实验

年级： 13级生物工程（专升本）班级： 2013011201 学号： 1301014026 姓名：徐红贞

指导老师：凤霞教授

日期：二零一三十月五号

目录

1实验目的及原理 (1)

1.1实验目的 (1)

1.2实验原理 (1)

2实验材料 (1)

2.1实验仪器 (1)

2.2实验试剂 (1)

2.3培养基 (2)

2.3.1 生长培养基 (2)

2.3.2鉴定培养基 (2)

2.3.3摇瓶培养基 (2)

3试验方法 (2)

3.1仪器的准备 (2)

3.2培养基的配置 (2)

3.3初步筛选及鉴定 (2)

3.3.1采集土样 (3)

3.3.2富集培养 (3)

3.3.3稀释分离、纯化 (3)

3.3.4初筛 (3)

3.4复筛及鉴定 (4)

3.4.1革兰染色 (4)

3.5酶活力的测定 (4)

3.5.1摇瓶培养 (4)

3.5.2酶液稀释 (4)

3.5.3酶液测定 (4)

4结果分析 (5)

4.1平板涂布分离 (5)

4.2平板划线分离 (5)

4.3初筛 (5)

4.4复筛 (5)

4.5摇瓶培养 (6)

4.6酶活力测定 (6)

5参考资料 (7)

6附录 (8)

微生物上游技术综合实验

枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定

1.实验目的及原理

1.1实验目的

（1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。

（2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。

（3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。

（4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。

（5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。

1.2实验原理

选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断培养物中是否有产淀粉酶微生物及产淀粉酶的能力。

2. 实验材料

2.1实验仪器

无菌玻璃涂棒无菌移液管接种环无菌培养皿土样电子天平三角瓶烧杯试管酒精灯擦镜纸载玻片吸水纸恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅玻璃珠显微镜无菌铲胶头滴管记号笔试管架棉塞牛皮纸报纸细绳无菌纸袋电炉搪瓷缸分光光度计恒温水浴锅白瓷皿等。

2.2 实验试剂

○1碘液储备液：称取22.0g碘化钾溶于约300mL水中，加入11.0g碘，搅拌溶液，移入500mL容量瓶，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每月配制一次）。

○2碘液使用液：称取20.0g碘化钾，溶于约300mL水中，移入500mL容量瓶中，准

枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定

确加入2.00mL碘液储备液，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每天配制一次）。

○320g/L可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉于250mL烧杯中，用少量水调成糊状，在搅拌下加入约80mL沸水，继续加热煮沸至透明（20min），冷却后用水定容至100mL（此溶液需当天配制，存放冰箱备用）

○4pH6.0磷酸缓冲溶液：称取磷酸氢二钠45.23g，柠檬酸8.07g，用水溶解定容至1000mL，配好后用酸度计校正其pH至6.0

○50.1mol/L盐酸溶液：量取9.4mL浓盐酸，用水稀释定容至1000mL。

草酸铵结晶紫番红碘液 95%酒精无菌水香柏油吸水纸擦镜纸

2.3 培养基

2.3.1 斜面培养基

牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g琼脂 15~20g，自来水1000ml，pH 7.2~7.4

2.3.2鉴定培养基

可溶性淀粉20g, 硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g, 氯化钠0.5g, 硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20 g, 自来水1000ml，校正pH至7.2～7.4,

2.3.3摇瓶培养基

玉米粉2g，黄豆饼粉1.5g，氯化钙0.02g，硫酸镁0.02g，氯化钠0.25g，磷酸氢二钾0.2g，磷酸氢二钠0.2g，柠檬酸钠0.2g，硫酸铵0.075g,(溶解后加)，校正pH值7.0

3.实验方法

3.1仪器的准备

①准备试管若干支，洗净晾干，其中7支各装9毫升蒸馏水（或自来水），上塞，10支一捆121度高压灭菌20-30分钟。

②培养皿若干个并洗净晾干，每5个一包，高压灭菌。

③移液管洗净塞上脱脂棉，用报纸条包好、捆扎高压灭菌。

④准备一个三角瓶装入自来水300-400毫升，上棉塞并用纸包好高压灭菌。

3.2培养基的配置

按各培养基配方配置培养基，并将生长培养基分装6支试管，上棉塞，放入大烧杯中待灭菌。其余的培养基分装入三角瓶，上棉塞，包扎灭菌。

微生物上游技术综合实验

3.3初步筛选及鉴定

3.3.1采集土样

用无菌铲铲去表层5-10厘米，用无菌器具规采取50-100克，装入无菌纸袋中并记录采集的时间、地点及植被情况等等。

3.3.2富集培养

将采集的土样称取5克，放入装有45毫升无菌水的三角瓶中，放入恒温振荡培养箱中于37度下培养10-20分钟。

3.3.3稀释分离、纯化

取装有9毫升无菌水试管5支，用记号笔编上10-2 、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7取已稀释成10-1土壤液，振荡后静置30秒，用无菌的移液管吸取1毫升土壤悬液加入10-2的无菌水试管中，并在试管轻轻反复吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法从10-2的试管中吸取1毫升稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释为10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。并做9个平板，每个稀释度做3个。

用一支新的无菌移液管，由低浓度开始（10-3,10-4,10-5），从各试管土壤稀释液中各吸取1ml，对号注入生长培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃棒涂匀，每个浓度做三个平板（重复），倒置于37℃温箱中培养24到48小时。

培养后，挑选10-5梯度上的单菌落进行平板划线分离，共划四个平板，并进行编号1、2、3号，于37℃倒置培养24h。

3.3.4初筛

透明圈实验

将疑枯草芽孢杆菌用平板划线法接种于鉴定培养基上，在37℃恒温培养箱中培养24-48h后，用胶头滴管将碘液直接滴于菌落周围，观察现象。阳性反应（淀粉被分解）菌落周围出现透明圈，呈紫色；阴性反应则无透明环，呈深蓝色。（透明圈的大小可初步判断该菌水解能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低）。

3.4复筛及鉴定

革兰氏染色：

（1）涂片：左手持培养皿，右手持接种环，用接种环从培养皿中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一滴无菌水于载玻片

枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定

中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。

（2）干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。

（3）固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。

（4）染色

○1初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗至流下的水无色为准。

○2媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗至流下的水无色为准。

○3脱色：将载玻片上的水用吸水纸吸干，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒，立即用水冲净酒精，至流下的水为无色为准。

○4复染：吸水纸吸干，后用番红液染1—2分钟，水洗至流下的水为无色为准。

（5）.镜检：干燥后，置显微镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

3.5酶活力的测定

3.5.1摇瓶培养

选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，将菌溶于5毫升无菌生理盐水中吸取此液体加入液体培养液中，30度摇瓶培养72小时。

3.5.2酶液稀释

取发酵液进行4000r/min 离心5分钟，取上清夜，用磷酸缓冲液稀释酶活力为65—70U/ml，便于准确测定。

3.5.3酶液测定

○1吸取20.00mL 20g/L可溶性淀粉溶液和5.00mLpH6.0磷酸缓冲溶液于大试管中，在60℃恒温水浴中预热平衡5min。

○2加入待测酶液1.00mL，立即摇匀并用秒表计时，准确反应5min。

○3立即用结晶干燥的吸管吸取上述反应液 1.00mL至预先盛有0.50mL 0.1mol/L HCl溶液和5.00mL碘液使用液的10mL具塞比色管中，摇匀。

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○4以0.50mL 0.1mol/LHCl溶液5.00mL碘液使用液和1.00mL磷酸缓冲溶液的混合

溶液做空白，于660nm波长下，用1cm比色皿迅速测定其吸光度，根据吸光度查附录“吸

光度与测试α-淀粉酶酶浓度对照表”，求得测试溶液的浓度C 。

4.结果分析

4.1平板涂布分离

经48h培养后，结果见表4-1

表4-1 平板涂布菌落状况

1 2 3 菌落形态

10-3 10-4 10-5菌体成片生长，有

3个单菌落

平板四周有菌生长

有杂菌生长充满平

板

菌体成片生长，有

1个单菌落

菌体充满整个平

板，无单菌落

有杂菌生长，并有

单菌落

菌落充满整个平

板，有5个单菌

落

有2个单菌落

有1个单菌落

有褶皱，表面光滑，

湿润呈圆形乳白色

经分析，由于操作不熟练导致10-4、10-5梯度有少量菌体生长，10-6梯度中菌体少且培养时为倒置培养从而导致无菌落生长。

4.2平板划线分离

挑选10-5梯度的菌落进行平板划线分离，经48h培养后，每平板最大菌落结果见表4-2

表4-2 平板划线菌落状况

1号2号3号4号

大小／cm 形态

0.5

表面光滑，

0.7

有褶皱呈

0.8

乳白色或

0.4

淡黄色圆形

经分析，由于菌体为野生菌而各自的生长能力不同，从而导致菌落大小不同。

4.3初筛

培养24h后，结果见表4-3

表4-3 透明圈大小

1号2号3号4号

枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定

透明圈大小／㎝ 1.9 2.2 2.6 2.0

经分析，菌落周伟产生透明圈，可判断该菌可以产生淀粉酶，由于菌体本身利用淀粉的能力不同，而导致透明圈直径各异。

4.4复筛

在显微镜下观察，发现菌体成杆状且呈现蓝紫色，初步判断其为杆菌且为阳性菌。

4.5摇瓶培养

培养52h后，用碘液检验，结果见表4-4

表4-4 24h碘液检验

1号2号3号4号

颜色深蓝色深蓝色焦糖色棕色

表4-5 72h碘液检验

1号2号3号4号

颜色深蓝色深蓝色棕黄色棕黄色

经分析，3号、4号摇瓶中的菌产生淀粉酶的能力较强，故对其进行淀粉酶活力测定。

4.6酶活力测定

在660nm波长下，吸光度见表4-6

表4-6 吸光度

1 2 3

吸光度﹙A﹚0.110 0.120 0.100

根据附录表可知，当吸光度为0.174时，相对应的酶浓度为4.329u/mL，当吸光度为0.214时，相对应的酶浓度为4.156u/mL，则其平均浓度为4.243 u/mL。

α-淀粉酶活力：

X=c×n=4.243×1=4.243 u/mL

式中：X——样品的酶活力，u/g(u/mL) ；

c——测试酶液平均浓度，u/mL；

n——样品的稀释倍数

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5.参考资料

[1]徐颖高产α-淀粉酶生产菌的筛选鉴定及其酶学性质研究[D]-大学2007

[2]雅琴.海魁.瑞雪α- 淀粉酶产生菌的分离筛选及酶学性质研究[J] -农业科学

2010(34)

[3]雅琴.海魁.孔令全α-淀粉酶产生菌的分离筛选与诱变选育[J] -畜牧与饲料科学

2010(9﹚

[4]雅琴.乌日娜.段耐酸性α-淀粉酶产生菌的发酵条件优化[J] -农业科学2010(35)

[5]卢福芝.钱丰.琴.劳斌淀粉酶产生菌的分离筛选[J] -学院学报2012(2)

[6]康成产酶芽孢杆菌的筛选、鉴定及对肉鸡的微生态效应研究[D] -农业大学2009

[7]建军淀粉酶产生菌的筛选及α-淀粉酶在米曲霉中的同源表达[D]-师大学2009

[8]力高淀粉酶蛋白酶活力枯草芽孢杆菌的选育及酶基因阳性克隆的筛选[D]-农业大学2009

枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定

附录：

吸光度与测试α-淀粉酶酶浓度对照表

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枯草芽孢杆菌-MBS发酵工艺设计

课程设计 姓名： 学院：生命科学学院 系别：生物工程 班级： 学号： 指导教师： 日期：2011年4 月 19日～5月31日

在畜禽养殖中使用益生菌不仅可避免长期使用抗生素所引起的肠道微生态平衡被破坏、产生耐药性及药物残留等问题 ,还能提高动物的生产性能和免疫力。枯草芽孢杆菌能改善肠道微生态环境 ,促进动物生长和提高抗病力 ,而且分泌各种消化酶类 (如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等 ) ,促进养分的消化、吸收 ,更重要的是枯草芽孢杆菌在不利环境条件下能形成芽孢 ,在饲料制粒、贮存及胃酸环境中仍能保持较高活性。因此 ,枯草芽孢杆菌比其他有益微生物有着更多的优点而得到广泛的研究和应用。试验选择在实际畜禽饲养生产中效果较好的 1株枯草芽孢杆菌 - MBS为研究对象 ,对其成长条件及培养基成分进行优化 ,为标准化生产提供依据。 利用实验获得的最优条件依次在摇瓶中及一级种子罐中扩大培养，发酵罐中扩大培养以获得所需菌体。所得菌体经过进一步的加工处理得到菌剂等产物，以获得经济效益。 本设计为单批次液体发酵1吨枯草芽孢杆菌-MBS的发酵工艺设计，通过设计得出实际生产所需的设备及其规格要求，各理论的配比系数等参数，旨在应用到实际生产当中去。

设计任务书 (3) 1 设计题目：单批次液体发酵1吨枯草芽孢杆菌-MBS的发酵工艺设计 (3) 2 基本工艺流程： (3) 3 设计依据： (3) 4 设计结果： (3) 设计正文 (3) 1枯草芽孢杆菌简介 (3) 1.1生理特性 (3) 1.2作用机理 (3) 1.3应用范围 (3) 2设计依据 (4) 2.1基本发酵工艺流程 (4) 2.2总体发酵规模 (4) 2.3发酵工艺设计理论参数与及工艺环节参数的选择原则 (4) 3 发酵工艺流程与设备流程设计 (5) 3.1工艺环节参数推算过程 (5) 3.1.1接种量及装液系数 (5) 3.2工艺流程简图 (5) 3.3设备选型推算过程 (5) 3.3.1种子罐及发酵罐 (5) 3.3.2蒸汽发生器 (6) 3.3.3空气压缩机 (6) 3.3.4冷冻干燥机 (6) 3.4实际设计的发酵工艺参数汇总表1 (6) 3.5实际确定的发酵设备选型推算结果参数汇总表2 (6) 3.6设备流程简图 (6) 4 发酵最优条件简述 (7) 5 设备汇总图表 (8) 5.1 (8) 5.2 (8) 6 参考文献 (9)

浅谈枯草芽孢杆菌(参考内容)

浅谈枯草芽孢杆菌 1. 抗生作用 抗生作用是指拈抗微生物通过产生代谢产物在低浓度下就能够对病原微生物的生长和代谢产生抑制作用，从而来影响病原微生物的生存和活动。近半个世纪以来，人们从枯草芽孢杆菌不同菌株的代谢产物中分离纯化了多种有效的抗菌物质。 2 溶菌作用 枯草芽孢杆菌的溶菌作用主要表现在是通过吸附在病原菌的菌丝上，并随着菌丝生长而生长，而后产生溶菌物质造成原生质泄露使得菌丝体断裂；或者是产生抗菌物质通过溶解病原菌孢子的细胞壁或细胞膜，致使细胞壁穿孔、畸形等现象从而抑制孢子萌发。 3 诱导植物产生抗性及促进植物生长 诱导植物产生抗性作用是指枯草芽孢杆菌不但能够抑制植

物病原菌，而且还能够诱发植物自身抗病机制从而增强植物的抗病性能的作用。什么是PGPR国际上把土壤中能促进植物生长的根际自生细菌通称为植物促生根圈细菌(Plant growth promoting rhizobaceria)，简称为PGPR。 其中以枯草芽孢杆菌的抗逆性最强、功能最多、适应性最广、效果最稳定。枯草芽孢杆菌能够产生类似细胞分裂素、植物生长激素的物质，促进植物的生长使植物抵抗病原菌的侵害。 4保护环境。 枯草芽孢杆菌大量应用于生物肥料。当作用于作物或土壤时，能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料效应。目前，微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用。提高农作物产品品质和食品安全等方面表现出了不可替代的作用。

5 枯草芽孢杆菌对土壤中的菲与苯并芘的吸附及生物降解功能 土壤与其相连的水环境称为土壤-水环境系统，其中存在着大量的土壤固有微生物，并在表面存在生物膜，因为生物膜形成了隔离层，有机污染物在接触到支撑生物膜的固体基底之前，必须首先到达并且穿过这个隔离层，这样就强烈地改变矿物颗粒或基底的吸附行为，对吸附作用有重要的影响，近年的研究表明，由于受污染影响，导致土壤中含有多环芳烃（PAHs），沉积物中PAHs主要为原油污染以及工业或民用煤不完全燃烧所致，枯草芽孢杆菌对菲与苯并芘的吸附及生物降解研究，研究表明以枯草芽孢杆菌为接种微生物，对菲与苯并芘都可进行吸附或生物降解，48h液相PAHs浓度达到平衡时，微生物对菲消除了98％，对苯并芘消除85％；接种的样品48h吸附等温线均呈线形，能较好地符合线性方程；在接种微生物情况下，沉积物与土壤对菲和苯并芘吸附特征均发生较大变化，对菲的吸附量增大约35倍，而对苯并芘的吸附量却降低了2／3左右；未接种微生物的土壤和沉积物对菲解吸率为20％，接种的样品组为2.9％，而对苯并芘的解吸结果与菲相反，未接种

枯草芽孢杆菌试验方案

枯草芽孢杆菌浓度测定试验方案 一、材料准备 （1）实验仪器 培养皿、烧杯、天平、玻璃棒、移液枪（5ml 1ml 200ul）、枪头（黄、蓝）、电子天平、250ml锥形瓶、15ml试管、涂布棒、酒精灯、记号笔、封口膜、灭菌锅、漩涡震荡仪 （2）实验试剂 NA培养基： 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水、盐酸、氢氧化钠、无菌水 枯草芽孢杆菌（不同浓度梯度）：101、102、103、104、105 （3）培养基配方 牛肉膏（3g）、蛋白胨（5g）、琼脂（20g）、水（1000ml）、无菌水（100ml）、盐酸、氢氧化钠（调节PH7.0-7.2），121°C下灭菌30 min。 二、实验步骤 （1）制备菌液 称取1.0g枯草芽孢杆菌转移至灭菌试管中，用移液枪分别移取9ml无菌水至试管，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为①； 用移液枪从①中移取1ml混匀菌液至一新试管，用移液枪分别移取9ml 无菌水，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为②；同理，分别进行稀释，得到③-⑧; （2）进行涂板 向每个培养皿中倒入约12ml50℃左右的灭菌的NA培养基，排除气泡；

待培养基凝固后，用移液枪分别从①-⑧中吸取200ul菌液，加至已灭菌的培养皿中，用涂布棒进行均匀涂抹，并标记； 每个样品做两个处理，每个稀释度重复3次； 将密封后的培养皿倒置于36℃的恒温培养箱内培养18h—24h，观察记录实验结果。 （3）菌落计数 以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数： 当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个-300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数； 若有两个稀释度，其平均菌落数30个-300个之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比例小于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数； 若三个稀释度的平均菌落数大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数； 若三个稀释度的平均菌落数小于300个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。5.6若三个稀释度的平均菌落数不在30个-300个之间，则以最接近300个或30个的平均菌落数乘以稀释倍数。 （4）结果统计与计算 有效活菌总数按式（1）计算； A=B×C /D (1)

枯草芽孢杆菌的发酵

枯草芽孢杆菌的发酵学院：化工学院 专业：生物工程 班级：生物10-2 姓名：姜霞

摘要 枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的15种菌种之一,其已被越来越多地制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。通过摇床培养筛选出较适宜于枯草芽孢杆菌发酵的培养基配方，发酵培养基配方确定后，在摇床条件下，通过对温度、初始ｐＨ值、初始接种量、装液量、摇床转速等发酵条件的摸索，确定最佳发酵条件。在摇瓶条件下优化发酵培养基和发酵工艺后，采用发酵罐进行发酵培养，对枯草芽孢杆菌在液体发酵过程中的菌体数量、ｐＨ值、总糖含量和总氮含量四个因素随时间的变化进行了观察。 枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等 关键词：枯草芽孢杆菌生长发酵活菌数

枯草芽孢杆菌实验报告

微生物技术综合实验 年级：13级生物工程（专升本）班级：2013011201 学号：1301014026 姓名：徐红贞 指导老师：刘凤霞教授 日期：二零一三十月五号

目录 1实验目的及原理 (1) 1.1实验目的 (1) 1.2实验原理 (1) 2实验材料 (1) 2.1实验仪器 (1) 2.2实验试剂 (1) 2.3培养基 (2) 2.3.1 生长培养基 (2) 2.3.2鉴定培养基 (2) 2.3.3摇瓶培养基 (2) 3试验方法 (2) 3.1仪器的准备 (2) 3.2培养基的配置 (2) 3.3初步筛选及鉴定 (2) 3.3.1采集土样 (3) 3.3.2富集培养 (3) 3.3.3稀释分离、纯化 (3) 3.3.4初筛 (3) 3.4复筛及鉴定 (4) 3.4.1革兰染色 (4) 3.5酶活力的测定 (4) 3.5.1摇瓶培养 (4) 3.5.2酶液稀释 (4) 3.5.3酶液测定 (4) 4结果分析 (5) 4.1平板涂布分离 (5) 4.2平板划线分离 (5) 4.3初筛 (5) 4.4复筛 (5) 4.5摇瓶培养 (6) 4.6酶活力测定 (6) 5参考资料 (7) 6附录 (8)

微生物上游技术综合实验 枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定 1.实验目的及原理 1.1实验目的 （1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。 （2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。 （3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。 （4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。 （5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 1.2实验原理 选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断培养物中是否有产淀粉酶微生物及产淀粉酶的能力。 2. 实验材料 2.1实验仪器 无菌玻璃涂棒无菌移液管接种环无菌培养皿土样电子天平三角瓶烧杯试管酒精灯擦镜纸载玻片吸水纸恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅玻璃珠显微镜无菌铲胶头滴管记号笔试管架棉塞牛皮纸报纸细绳无菌纸袋电炉搪瓷缸分光光度计恒温水浴锅白瓷皿等。 2.2 实验试剂 ○1碘液储备液：称取22.0g碘化钾溶于约300mL水中，加入11.0g碘，搅拌溶液，移入500mL容量瓶，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每月配制一次）。 ○2碘液使用液：称取20.0g碘化钾，溶于约300mL水中，移入500mL容量瓶中，

枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化

枯草芽孢杆菌发酵培养基优化 作者姓名 专业 指导教师姓名 专业技术职务

目录 摘要 (1) ABSTRACT (2) 第一章绪论 (3) 1.1枯草芽孢杆菌简介 (3) 1.2枯草芽孢杆菌的应用 (3) 1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 (3) 1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 (3) 1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 (4) 1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (4) 1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用 (4) 1.2.6枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材 料 (5) 1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用 (5) 1.3 国内外的研究现状与发展趋势 (6) 1.4研究的思路、目的及意义 (7) 第二章材料与方法 (7) 2.1实验材料 (7) 2.1.1 菌株鉴定 (7) 2.1.2 培养基 (7)

2.1.3 主要设备 (8) 2.2 培养基的优化 (9) 2.2.1 培养方法 (9) 2.2.2实验流程 (9) 2.2.3实验方法 (10) 2.2.4正交试验 (11) 第三章结果和分析 (11) 3.1 鉴定结果如下 (11) 3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果 (16) 3.3 pH变化曲线（以G18为例） (19) 3.4 实验总结 (25) 致谢 (27)

摘要 枯草芽孢杆菌是主要的饲用益生菌菌株，本论文以两株枯草芽孢杆菌G18和G21培养的延滞期和倍增时间为评价指标，通过三角瓶摇床培养，进行了两因素三水平的正交试验，对发酵培养基主要组分进行了优化，豆粕处理的蛋白酶加量2u/g 豆粕、5u/g豆粕、10u/g豆粕和玉米浆添加量0.5%、1.0% 、1.5% 做两个因素三水平的正交实验，研究表明：G18最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。[关键词] 枯草芽孢杆菌培养基优化正交试验

枯草芽孢杆菌产淀粉酶试验要点

枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验 化学与生命科学学院 摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。 关键词：枯草芽孢杆菌，α-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。 实验材料和方法 一、实验材料： （一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658） （二）培养基： 1、种子培养液 葡萄糖 1% Tryptone(胰蛋白胨)：1%, Yeast Extract(酵母提取物)：0.5%, NaCl(氯化钠)：1% 调pH7.2 若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。 2、产淀粉酶发酵培养液 玉米粉 2 .0 % 黄豆饼粉1 .5% CaCl 2 0 .02 % MgSO4 0 .02% NaCl 0 .25% K2HPO4 0 .2% 柠檬酸钠0 .2% 硫酸铵0 .075% Na2HPO4 0 .2 % 调节pH 值7 .0

微生物生理生化反应实验报告

山东大学实验报告2012年 12 月 4日 姓名系年级 2011级生科2班组别四 科目微生物学实验题目微生物的生理生化反应 微生物的生理生化反应 一、【实验目的】 1. 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌坚定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5. 了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、【实验仪器与试剂】 菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌培养基：培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄 糖蛋白胨水培养基； 试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、 仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管 三、【实验原理】 1.在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种 微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。 2.淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质 分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 3.油脂的水解：在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说 明此中菌可产生分解油脂的酶。 4.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数 细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气. 例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 5.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并 非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测

枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选

枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选 ========= （+++++农业与生物技术学院++ 111111） 摘要：本实验通过福林试剂法检测枯草芽孢杆菌中碱性蛋白酶的活性，旨在筛选出培养枯草芽孢杆菌时的最优碳源和掌握培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制，为今后进一步提高枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶提供可靠地参考数据。 关键词：酶活、最优碳源、碱性蛋白酶。 引言：碱性蛋白酶是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为9～11,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,除可催化蛋白质水解为氨基酸外,在有机溶剂中还可催化多肽的合成[1]。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用,吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究[2]。微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,同时易于实现工业化生产[3]。而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力,有较大耐热性且有一定的酯酶活力[4]。枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株,具有产蛋白酶量大,耐高温、高碱等特点,因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点[5]。我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高,但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂,并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口

[6]。本实验通过碳源优化枯草芽孢杆菌发酵培养基和探究培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制,以期进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。 1.材料与方法 1.1菌株：枯草芽孢杆菌 1.2材料与试剂 酪氨酸、福林试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素、氯化钙、酵母浸粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、蛋白胨 1.3仪器与设备 恒温水浴锅、分光光度计、高速离心机、摇床、超净工作台、15L 发酵罐、PHS-25型酸度计、振荡培养箱、压力灭菌锅。 1.4 培养基 种子培养基(g/L)：胰蛋白栋5g/L、葡萄糖10g/L、酵母浸粉5g/L、K2HPO4 18g/L ,pH 值自然，121℃蒸气灭菌20min； 发酵培养基(g/L)：酵母浸粉10 g/L、糊精100 g/L、柠檬酸钠3 g/L、蔗糖20 g/L 、K2HPO4 18g/L 、CaCl2 3 g/L, pH 值自然，115℃与发酵罐一起进行实消，20min。 1.5方法 1.5.1 不同碳源对枯草芽孢杆菌的影响 1.5.1.1配制培养基（20mL/150mL） 准确秤取0.2g酵母浸粉、0.06g柠檬酸钠、0.2g磷酸氢二钾、0.06g 氯化钙5份分别加入0.6g蔗糖、0.6g麦芽糖、0.6g葡萄糖、1.1g乳

北京理工大学2005年《微生物学》期末试题

北京理工大学2005年《微生物学》期末试题 一、名词解释（每题3分，共计18分） 1、L型细菌 2、菌落 3、鉴别性培养基 4、发酵 5、基因突变 6、BOD5 二、填空题（每空1分，共计30分） 1、微生物学的奠基人是__________。 2、__________繁殖是放线菌的主要繁殖方式。 3、分生孢子梗状如扫帚是__________的重要分类特征。 4、病毒粒的基本结构是_______________。 5、烟草花叶病毒是________________对称体制的典型代表。 6、噬菌体的繁殖一般可分为五个阶段__________、__________、 _____________、_________和__________。 7、温和噬菌体的3种存在形式有____________、____________和游离态。 8、微生物的6大营养要素是______________、_____________、____________、____________、____________和水。 9、在营养物质运输中既消耗能量又需要载体的运输方式是__________________________。 10、按照对培养基成分的了解作分类，培养基可分为____________、_______________和 ______________。 11、筛选营养缺陷型的四个环节是____________、____________、____________和 ____________。 12、根据下图中五类对氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态，依次写出它们的 名称__________________、___________________、_________________、________________和________________。 三、判断题并改错（每题1分，共计5分，在括号内对的划“√”，错的划“×”） 1、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌属于单细胞生物，唾液链球菌和金黄色葡萄球菌属于多细胞生 物。（） 2、遗传型相同的个体在不同环境条件下会有不同的表现型。（） 3、低剂量照射紫外线，对微生物几乎没有影响，但以超过某一阈值剂量的紫外线照射，则 会导致微生物的基因突变。（） 4、一切好氧微生物都含有超氧化物歧化酶（SOD）。（） 5、一般认为各种抗性突变是通过适应而发生的，即由其所处的环境诱发出来的。（）

微生物鉴定常用的生理生化试验实验报告

山东大学实验报告2017年12月4日 ___________________________ 科目：微生物学实验题目：微生物鉴定常用的生理生化试验姓名：丁志康 一、目的要求 1.证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的 酶系统。 2.掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5.了解IMViC反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、基本原理 1、生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶只要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实；淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不在产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变成深红色，说明胞外存在着脂肪酶。 2、糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳糖、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳的等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨，指示剂（溴甲酚紫），倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 3、IMViC反应是吲哚试验、甲基红试验、伏-普试验和柠檬酸试验4个试验的首字母缩写。这四个实验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气杆菌，多用于水的细菌检查。 （1）吲哚试验：某些细菌有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸形成吲哚（靛基质），吲哚能与对二甲基氨基苯甲醛作用生成玫瑰吲哚而呈红色。 （2）甲基红试验：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解成为甲酸、乙酸、琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂可呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在5.4以上，加入甲基红指示剂呈橘黄色。本试验常与V-P试验一起使用，因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。 （3）伏-普（二乙酰）试验：某些细菌能发生如下转换：葡萄糖→丙酮酸（脱羧）→乙酰甲基甲醇→2，3—丁烯二醇，在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用产生粉

抗生素标记枯草芽孢杆菌实验

利福平标记枯草芽孢杆菌实验 1、实验材料 1.1试剂 利福平溶液：用95%乙醇配制10mg/mL的利福平溶液，配好后经0.22um无菌滤膜除菌。 1.2培养基 NA（牛肉膏蛋白胨培养基）培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1.0L，琼脂18.0g，pH7.0-7.2 200μg/mL利福平NA培养基：NA培养基经高温灭菌，冷却至50-55℃时加入利福平（1LNA培养基加入20mL10mg/mL利福平溶液）。 液体培养基为对应固体培养基不添加琼脂，其余成分一致。 2、抗生素标记试验 首先制备利福平浓度为100μg/mLNA平板，检测枯草芽孢杆菌天然抗药性。 根据天然抗药性检测结果，进行抗生素标记实验（杜立新等，2004），取纯化好的枯草芽孢杆菌单菌落接种到含有5ug/mL利福平NA液体培养基中，150r/min，28℃培养，待出现浑浊后稀释菌液，取三个不同浓度的稀释液100μL 加到含有相同浓度抗生素的NA细菌平板，涂匀，继代培养一次，待长出单菌落后转入下一高浓度的利福平NA培养基，依次经过利福平5、10、20、40、80、120、160、200ug/mLNA液体培养基诱导，直至筛选出能耐受的最高利福平浓度200ug/mL。筛选耐药枯草芽孢杆菌能否应用于研究，还必须验证其耐药的稳定性及拮抗性能。耐药稳定性试验参考吴春胜等（1994）方法。（1）将筛选的枯草芽孢杆菌在利福平含量依次升高的NA培养基上连续传代6次，观察其是否始终有菌落出现。（2）将筛选枯草芽孢杆菌接种至不含利福平NA培养基中，连续传代3-5次，然后将其涂布于含200μg/mL利福平的NA培养基上，观察其是否有菌落出现。（3）将抗药菌株置于4℃的低温中保藏2-3周，然后接种于含200μg/mL 利福平的NA液体培养基上进行培养，观察是否出现浑浊，并在含200μg/mL利福平的NA培养基上划线培养，观察其是否有菌落出现。

枯草芽孢杆菌发酵工艺2

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510320760.5(22)申请日 2015.06.11 C12N 1/20(2006.01)C12R 1/125(2006.01) (71)申请人山东西王糖业有限公司 地址256209 山东省滨州市邹平县韩店镇驻 地西王工业园电厂路南侧(72)发明人王棣 王居亮 李伟 杨荣玉 唐海静 夏颖颖(74)专利代理机构济南舜源专利事务所有限公 司 37205 代理人宋玉霞(54)发明名称 一种用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法(57)摘要 本发明提供一种以玉米淀粉生产过程中的副产品玉米粗蛋白粉为原料生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的生产方法，采用本方法在不添加其它碳源和氮源的条件下，单纯以玉米粗蛋白粉为营养源经过固态培养可以生产出活菌数为3000亿-5000亿/g 的枯草芽孢杆菌微生态制剂。生产过程不需要通压缩空气，不产生任何废水废气。减少了枯草芽孢杆菌微生态制剂的生产成本。且所得产品以玉米纤维低聚糖为载体具有益生元的功能提高了产品质量。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号CN 104988088 A (43)申请公布日2015.10.21 C N 104988088 A

1.一种用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，步骤如下： (1)取玉米粗蛋白粉移入固体发酵罐中，加水调到料水比为1：0.7-0.9，加氧化钙调pH 到6.0-7.0； (2)打开循环水使固体发酵罐温度上升到80-90℃后，通入蒸汽消毒30分钟； (3)待原料冷却到40℃-44℃后，加入物料干基重量1/9-1/10培养15h以后的种子液，固含量为5％； (4)维持30-40℃培养50-60h，24h后每隔6h搅拌一次物料； (5)培养到50-60h后，物料明显粘湿，有较浓的枯草芽孢杆菌特有气味，升温到44-56℃继续培养12-22h； (6)共计培养72h后移出物料，65-80℃烘干物料； (7)烘干物料水份到小于6％后，粉碎物料； (8)将粉碎的物料进行包装，取样检测产品质量。 2.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，料水比是指：物料干基质量即无水的物料质量。 3.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的种子液为将枯草芽孢杆菌菌种在液体培养基中通气搅拌培养15小时以后的液体培养基和菌种的混合物，所述的液体培养基为：葡萄糖5％w/w，玉米浆10％w/w,硫酸镁0.03％w/w,碳酸钙调pH到7.0，其余为黄河水，所述的玉米浆干基含量为26％。 4.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中，维持温度为33-38℃。 5.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(5)中，升温到45-50℃。 6.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(4)(5)中，发酵过程罐体与空气相通，有空气过滤器装置过滤掉空气中的杂菌。 7.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，得到的枯草芽孢杆菌微生态制剂，活菌数3000-5000亿/g。 8.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，采用的玉米粗蛋白粉的情况见表1， 表1 玉米粗蛋白粉指标 蛋白质％脂肪％纤维质％淀粉％灰分％木质素％水份％玉米皮1125412 2.612 粗蛋白10 2.41250 4.6—10 胚芽粕1825314 2.3— 。

第4章 微生物的生长

第4章微生物的生长 本章的学习目的与要求 ⑴掌握微生物生长的概念，个体生长与群体生长的关系。 ⑵掌握衡量微生物群体生长的指标，微生物生长量的测定方法。 ⑶了解微生物的群体生长规律和环境因素对微生物生长的影响。 1. 微生物生长 1.1微生物生长的概念 一个微生物细胞在合适的外界环境条件下，不断地吸收营养物质，并按其自身的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其重量、体积、密度或浓度作指标来衡量。所以： 个体生长→个体繁殖→群体生长 群体生长＝个体生长＋个体繁殖 这里需要强调的是，上述微生物生长的阶段性，对于单细胞微生物来说是不明显的，往往在个体生长的同时，伴随着个体的繁殖，这一特点，在细菌快速生长阶段尤为突出，有时在一个细胞中出现2或4个细胞核；除了特定的目的以外，在微生物的研究和应用中，只有群体的生长才有实际意义，因此，在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。这一点与研究高等生物时有所不同。 微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映，因此，生长繁殖情况就可作为研究各种生理、生化和遗传等问题的重要指标；同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病、霉腐微生物的防治，也都与它们的生长繁殖和抑制紧密相关。下面对微生物的生长繁殖及其控制的规律作较详细的介绍。 1.2微生物生长量的测定 既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定生长的方法也都直接地以此为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。 1.2.1 稀释平板菌落计数法 是一种最常用的活菌计数法。取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在其凝固前均匀混合，或涂布于已凝固的固体培养基平板上。在最适条件下培养后，从平板上（内）出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液的含菌数。在一个9cm直径的培养皿平板上，一般以出现50～500个菌落为宜。 这种方法在操作时，有较高的技术要求。其中最重要的是应使样品充分混匀，并让每支移液管只能接触一个稀释度的菌液。有人认为，对原菌液浓度为109个/mL的微生物来说，如果第一次稀释即采用10-4级（用10μL菌液至100mL无菌水中），第二次采用10-2级（吸1mL上述稀释液至100mL无菌水中），然后再吸此菌液0.2mL进行表面涂布和菌落计数，则所得的结果最为精确。其主要原因是，一般的吸管壁常因存在油脂而影响计数的精确度（有时误差竟高达15％）。这一稀释过程的示意图详见实验技术。

微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色

微生实验报告 姓名： xx 专业年级：2011级生物技术 学号：1032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔

径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种： 金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂： 草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚： 乙醇=7:3），xx柏油。 3、器材： 废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。 四、实验方法 （一）简单染色 1．涂片： 取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干： 让涂片自然晾干。 3．固定：

枯草芽孢杆菌分离及筛选实验方案

微生物设计性实验 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 分 离 及 筛 选 第二小组 组长：杨泽升 组员：王亭亭 叶宁 霍克

枯草芽孢杆菌的分离和筛选 1 实验目的 掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。 2 实验原理 枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。 3实验材料 3.1选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基， 配方： 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 可溶性淀粉10.0g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 调整pH至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。 3.2溶液或试剂 牛肉膏 1.25g 蛋白胨 2.5g 氯化钠 1.25g 可溶性淀粉 2.5g 琼脂 5g 碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克， 100毫升0.01NHCL。 3.4仪器或其他用品 平板培养皿 10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml 量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。 4 实验流程

环境工程微生物学期末考试试卷B卷

环境工程微生物学试卷 一、填空(每小题1分,共10分) 1. 蓝藻的营养类型为光能自养型。 2.大肠杆菌长为2.0μm,宽为0.5μm,其大小表示为0.5um*0.2um 。 3.水处理中活性污泥中的细菌采用对数生长时期的细胞。 4.革兰氏阳性菌细胞壁的主要成份为肽聚糖磷壁酸。 5.侵染寄主细胞后暂不引起细胞裂解的噬菌体称温和噬菌体。 6.微生物细胞的主要组成元素是 C H O N P S 。 7. 大肠杆菌个数可作为水的卫生细菌学检验指标。 8.用物理或化学方法杀死物品上大部分微生物的过程称消毒。 9. 加大接种量可控制少量污染菌的繁殖,是利用微生物间的拮抗关系。 10. 在放线菌发育过程中,吸收水分和营养的器官为营养菌丝。 二、单项选择(在每小题的四个备选答案中,选出一个正确的答案,并将其码写在题后的○内,每小题2分,共40分)。 1.组成病毒粒子核髓的化学物质是○c ①糖类②蛋白质③核酸④脂肪 2.常用于饮水消毒的消毒剂是○d ①石灰②CuSO4 1③KMnO4④漂白粉 3.以高糖培养酵母菌,其培养基类型为○a ①加富培养基②选择培养基③鉴别培养基④普通培养基 4. 酵母菌常用于酿酒工业中,其主要产物为○b ①乳酸②乙醇③丁酸④乙酸 5.属于细菌细胞基本结构的为○b ①荚膜②细胞壁③芽胞④鞭毛 6.酵母菌常用于酿酒工业中,其主要产物为○b ①乙酸②乙醇③乳酸④丙醇 7.土壤中三大类群微生物以数量多少排序为○c ①细菌＞放线菌＞真菌②细菌＞真菌＞放线菌③放线菌＞真菌＞细菌 ④真菌＞细菌＞放线菌

8.噬菌体属于病毒类别中的○a ①微生物病毒②昆虫病毒③植物病毒④动物病毒 9.常用消毒酒精的浓度的○B ①30% ②70% ③95% ④100% 10.制备培养基的最常用的凝固剂为○C①硅胶②明胶③琼脂④纤维素 11.沼气发酵的主要产物为○B ①CO2②CH4③NH3④H2S 12.酵母菌属于○微生物C ①好氧型②厌氧型③兼性厌氧型④微厌氧型 13.果汁、牛奶常用的灭菌方法为○A ①巴氏消毒②干热灭菌③间歇灭菌④高压蒸汽灭菌 14.加大接种量可控制少量污染菌的繁殖,是利用微生物间的○D ①互生关系②共生关系③竞争关系④拮抗关系 15. 以芽殖为主要繁殖方式的微生物是○B ①细菌②酵母菌③霉菌④病毒 16.干热灭菌法要求的温度和时间为○C ①105℃,2小时②121℃,30分钟③160℃,2小时④160℃,4小时 17.生鞭毛最多的菌属于○ ①螺旋菌②杆菌③球菌④假菌丝 18.微生物运输营养物质的主要方式○C ①被动扩散②促进扩散③主动运输④基团转位运转 19.在生物界分类中食用菌属于○B ①病毒界②真菌界③原核原生生物界④真核原生生物界 20.反硝化作用的最终产物○B ①NH3②HNO3③N2④HNO2 三、判断正误(认为正确的,在题后○内打"√";错误的打"×",并说明理由,不说明理由,该题无分。每小题2分,共10分) 1. 原核微生物的主要特征是细胞内无核○X 2. 细菌芽孢的生成是细菌繁殖的表现○X 3.细菌和放线菌最适的pH为中性-微碱性○对