粉防己碱对小鼠肺成纤维细胞的凋亡及Caspase_3蛋白的影响
Chin J Clin Pharmacol
531
Vol .32No .6March 2016（Serial No .212
）
粉防己碱对小鼠肺成纤维细胞的凋亡及Caspase －3蛋白的影响
Effects of tetrandrine on apoptosis and Caspase －3protein expression in mouse lung fibroblast
收稿日期：2015－12－09
修回日期：2015－12－24
基金项目：河北省教育厅科学技术研究基金资
助项目（2006139）作者简介：梁晓飞（1985－），女，硕士研究生，主要从事临床流行病研究通信作者：肖永红，教授，硕士生导师
Tel ：（0315）7836576E －mail ：kycxyh@https://www.sodocs.net/doc/7d13212616.html,
梁晓飞，王铭，肖永红
（华北理工大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室，河北
唐山063000）
LIANG Xiao －fei ，WANG Ming ，XIAO Yong －hong
（Department of Epidemiology and Health Statistic ，College of Public Health ，North China University of Science and Technolo-gy ，Tangshan 063000，Hebei Province ，China ）
摘要：目的研究粉防己碱对小鼠肺成纤维细胞（L929）凋亡及凋亡蛋白
Caspase －3表达的影响。方法
液氮冻存的小鼠肺成纤维细胞株，于37?、
50mL ·L －1CO 2孵育箱中复苏传代培养，同步化后，将细胞分为4组：空白组，加入
等剂量的无血清、无双抗ＲPMI1640培养基继续培养；3个剂量（2.5，5.0，7.5mg ·L －1）粉防己碱组，加入无血清、无双抗ＲPMI1640培养基稀释粉防己碱到浓度为2.5，5.0，7.5mg ·L －1，完全培养基继续培养。作用24h 后收集细胞，透射电子显微镜观察细胞形态变化，流式细胞术检测细胞凋亡，免疫细胞化学法检测
Caspase －3蛋白表达水平。结果与空白组比较，粉防己碱组凋亡细胞显著增
多，细胞数目减少。与空白组凋亡率（5.32?0.50）%比较，3个剂量粉防己碱细胞凋亡率［
（7.00?0.48）%，（9.66?0.76）%，（20.36?1.11）%］明显增加（P ＜0.05）。随着粉防己碱浓度的增加，Caspase －3蛋白的表达亦明显增加（P ＜0.05）。结论
粉防己碱促进小鼠肺成纤维细胞凋亡，增加Caspase －3蛋白
的表达，从而抑制肺纤维化。
关键词：粉防己碱；肺成纤维细胞；凋亡；Caspase －3蛋白DOI ：10.13699/https://www.sodocs.net/doc/7d13212616.html,ki.1001－6821.2016.06.017中图分类号：Ｒ974；Ｒ285.5
文献标志码：A
文章编号：1001－6821（2016）06－0531－03
Abstract ：Objective To explore the effect of tetrandrine （Tet ）on the apoptosis expression of and Caspase －3protein in mouse lung fibroblast cells （L929）.Methods
Lung fibroblast cells （L929）lines were incuba-
ted in 50mL ·L －1CO 2cells incubtion box at 37?for passage cul-ture.Fibroblast cells were divided into four group ：blank group and diffe-rent does Tet （2.5，5.0，7.5mg ·L －1）groups which were cultured in Ｒoswell Park Memorial Institute1640medium without fetal bovine serum ，penicilin and streptomycin.The cells were collected after 24h ，then mor-phological changes of the cells were observed under the transmission elec-tron microscope.The cell apoptosis was detected by the flow cytometry．And the expression levels of Caspase －3protein were examined with
immunohistochemistry method.Ｒesults The apoptotic cells increased
while the number of cells decreased in different Tet concentrationgs group ，when compared with the blank group.There were significant diffe-rent in the apoptotic cells compared with blank groups （P ＜0.05）.The apoptosis rate of blank group were （5.32?0.50）%，different does of Tet were （7.00?0.48）%，（9.66?0.76）%，（20.36?1.11）%.There was significant different in the Caspase －3expression among the different
532中国临床药理学杂志
第32卷第6期2016年3月（总第212期）
groups（P＜0.05），and as Tet dosage increased，the expression of Caspase－3protein increased（P＜0.05）.
Conclusion Tet can promote the apoptosis of mouse lung fibroblast cells and increase the expression of Caspase－3 protein so that the lung fibroblast was inhibited.
Key words：tetrandrine；lung fibroblast cells；apoptotic；Caspase－3
肺成纤维细胞在肺纤维化形成过程中起着关键的作用，抑制其增殖、活化以及分化对肺纤维化的治疗都具有重要的临床意义［1］。粉防己碱具有良好的抗肺纤维化作用［2］。为此本实验用不同浓度粉防己碱研究其对小鼠肺成纤维细胞（L929）作用。
材料与方法
1材料
细胞小鼠肺成纤维细胞株L929细胞，由上海博谷生物公司提供。
药品与试剂粉防己碱（0.1mmol·L－1，pH6.6 6.7），购自美国Sigma公司。ＲPMI1640细胞培养液，购于美国GIBCO公司；兔抗小鼠Caspase－3多克隆抗体，购自北京博奥森公司；免疫细胞化学SP试剂盒，购自中杉金桥公司。
仪器318MC酶联免疫检测仪，上海精科公司产品；BX51荧光倒置显微镜与600透射电子显微镜，日本Olympus公司产品；ALTＲA TM流式细胞仪，美国贝克曼库尔特公司产品。
2实验方法
2.1细胞株、细胞培养、同步化及分组
L929细胞常规培养在含体积分数10%胎牛血清、100U·mL－1青霉素和链霉素的ＲPMI1640完全培养液中，于37?、50mL·L－1CO2培养箱中培养，每隔一天更换培养液，0.25%胰酶消化传代。
常规操作，细胞经无血清培养基作用24h，随机分为4组：空白组（加入培养基），3个剂量（2.5，5，7.5 mg·L－1）粉防己碱组，完全培养基继续培养24h。
2.2电镜观察细胞形态学特征［3］
按照文献方法，收集空白组和不同剂量粉防己碱组细胞，戊二醛固定，梯度丙酮脱水，树脂包埋，钻石切片机切片，醋酸铀，枸橼酸铅双染，透射电镜观察并拍摄。
2.3Annexin V/PI双染法流式细胞仪测细胞凋亡［4］
参照文献方法，收集不同处理后的细胞，重悬细胞，调整细胞浓度为1?107个·mL－1，取细胞1mL，以4?、2000r·min－1离心10min，弃上清，用预冷的PBS洗涤细胞，再次重悬细胞。取50μL，加入AnnexinV－FITC5μL和PI5μL，轻轻混合，室温避光孵育15min。于1h内用流式细胞仪检测。
2.4免疫细胞化学检测Caspase－3蛋白表达［5］
将对数生长期细胞种植于六孔板中，经不同浓度粉防己碱作用24h后，用免疫细胞化学法检测Caspase－3蛋白表达，一抗浓度为1?300，实验步骤按照参考文献操作，以PBS代替一抗作为阴性对照。阳性细胞判断：以胞浆出现淡黄色至棕黄色为阳性。200倍视野下每片随机取6个视野，用Image－pro plus 图像分析系统，进行显微定量分析，并计算每张免疫组化上Caspase－3蛋白平均灰度值。
3统计学处理
用SPSS15.0软件进行统计学分析。数据用珋x?s 表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用Dunnett t 法检验。
结果
1透射电镜观察到L929细胞形态改变
对照组，细胞生长良好，细胞体积大，周围有树枝状的伪足，胞质丰富，细胞核呈椭圆形，有明显的核仁，线粒体形态良好，偶尔可见分裂期细胞，凋亡细胞少见（图1A）。不同浓度粉防己碱组，细胞数量较对照组明显减少，凋亡细胞明显增多，表现为核形不规则，细胞质皱缩，染色深暗，界限清楚，细胞皱缩，体积变小，呈多边形细胞，线粒体崩解成空泡状（图1B）；核膜表面凸凹不平，胞浆内空泡增多，核染色质固缩边聚，核膜消失，核碎裂（图1C、D）。
2流式细胞仪测得细胞凋亡率
空白组凋亡率为（5.32?0.50）%；而3个剂量粉防己碱组的细胞凋亡率分别为（7.00?0.48）%，（9.66?0.76）%，（20.36?1.11）%，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。随着剂量增大，粉防己碱组凋亡率明显增加（P＜0.05）。
3免疫细胞化学测得L929细胞Caspase－3蛋白的表达
空白组，胞浆几乎不着色（2A）。各剂量粉防己碱组，细胞出现淡黄色至棕黄色，随着粉防己碱浓度的增加，黄色逐渐加深（图2B、C、D）。
与对照组相比，5.0，7.5mg·L－1粉防己碱组的Caspase－3蛋白表达明显增强（P＜0.05），
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7.5mg ·L －1粉防己碱的组Caspase －3蛋白表达最高（P ＜0.05），见表1
。
图1透射电镜下粉防己碱作用L929细胞形态特征变化（?5000）
Figure 1
Morphologic features changes of L929cells treated with tetrandrin （Tet ）by transmission electron micorscopy （?5000）
A ：Control group ；
B ，
C ，
D ：Low ，middle ，high dose of Tet
group
图2免疫细胞化学测得各组细胞中Caspase －3蛋白的表达（?200）
Figure 2
Effect of tetrandrin on Caspase －3in L929cells were detedted by immunohistochemistry method （?200）
A ：Control group ；
B ，
C ，
D ：Low ，middle ，high dose of Tet group
表1免疫细胞化学法测得L929细胞中Caspase －3蛋白的灰
度值（珋x ?s ，n =6）Table 1
Effect of Tet randrin on Caspase －3in L929cells were
detedted by immunohistochemistry method （珋
x ?s ，n =6）Group Dose （mg ·L －1）
Gray value Blank 0.03?0.01Tetrandrine －L 2.50.07?0.10Tetrandrine －M 5.00.15?0.01*
#Tetrandrine －H
7.50.22?0.04*
#□
Compared with control group ，*P ＜0.05；Compared with 2.5mg ·L －1tetran-drine group ，#P ＜0.05；Compared with 5mg ·L －1tetrandrine group ，□
P ＜0.05
讨论
本实验结果证实，
粉防止碱可促进肺成纤维细胞凋亡。粉防己碱可使宫颈癌细胞HeLa 、乳腺癌细胞MCF －7、肝癌细胞HepG2的细胞核缩小、核内异染色质明显增多、凋亡小体，诱导癌细胞发生凋亡，粉防己
碱还可使成纤维细胞发生凋亡形态变化［6］。
本研究发现，粉防己碱能促进小鼠肺成纤维细胞
凋亡，并且凋亡率随着用药浓度的增大而增大，表明Tet 具有促进成纤维细胞凋亡的作用。粉防己碱在矽肺的治疗具有良好的临床疗效［7］
。本实验结果显示，粉防己碱促进凋亡蛋白Caspase －3的表达，可进一步促进小鼠肺成纤维细胞凋亡。本研究只对粉防己碱影
响的成纤维细胞凋亡和凋亡执行蛋白Caspase －3表达两方面进行了初步探讨。有关粉防己碱诱导肺成纤维细胞凋亡通过何种路径，将进行进一步深入研究。
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权菊香）
细胞周期和细胞凋亡类基因
细胞周期和细胞凋亡类基因 G0 G1 转变(G0 to G1 transition) 1: mdm4 G1/S 特异转录，有丝分裂细胞周 期(G1/S-specific transcription in mitotic cell cycl e) 1: gfi1 G1/S 转变, 有丝分裂细胞周 期(G1/S transition of mitotic cell cycle) 19: bca t1 ccnd1 ccne1 cdc34 cdc7 cdca5 cdk4 cdkn3 cul1 c ul2 cul3 cul4a cul5 gspt1 lats2 pml ppp6c rcc1 sk p2 G1/S 转变检控 点(G1/S transition checkpoint) 4: dlg1 hus1 nbn p ura G1 期(G1 phase) 2: cdc42 rb1 G1 期, 有丝分裂细胞周 期(G1 phase of mitotic cell cycle) 10: anapc2 cd c23 cdk6 cdkn1c dnaja2 e2f1 map3k11 taf1 taf1l tbr g4
G1 特异转录，有丝分裂细胞周 期(G1-specific transcription in mitotic cell cycle) 1: gfi1b G2/M转变, 有丝分裂细胞周 期(G2/M transition of mitotic cell cycle) 10: ana pc10 anapc4 anapc5 birc5 ccnb1 cdk2 dnm2 khdrbs1 l ats1 tpd52l1 G2/M转变DNA 损伤检控 点(G2/M transition DNA damage check-point) 1: brsk 1 G2 期, 有丝分裂细胞周 期(G2 phase of mitotic cell cycle) 4: cenpf ches 1 gtse1 kpna2 M期(M phase) 2: ilf3 rb1 M期, 有丝分裂细胞周 期(M phase of mitotic cell cycle) 4: cdc25b dlg7 mphosph6 mphosph9 M期特异微管过 程(M phase specific microtubule process) 1: kpna2
细胞培养发展历史
1856年，实现红豆杉细胞培养生产紫杉醇的突破。 1885年，Roux温生理盐水培育鸡胚组织； 1887年，培养皿（英文：Petri dish）由在德国生物学家罗伯特·科赫手下工作的细菌学家朱利斯·理查德·佩特里（Julius Richard Petri，1852－1921）于1887年设计，故也称为“佩特里皿”。是一种用于细胞培养的实验室器皿，由一个平面圆盘状的底和一个盖组成，一般用玻璃或塑料制成。 1902年，植物细胞培养是在植物组织培养技术基础上发展起来的。1902年Haberlandt 确定了植物的单个细胞内存在其生命体的全部能力(全能性)，使成为植物组织培养的开端。 其后，为了实现分裂组织的无限生长，对外植体的选择及培养基等方面进行了探索。 1906年，Beebe和Ewing用盖片悬滴培养法，以动物血清做培养基，培养狗淋巴细胞存活了72 小时。现代细胞培养是从Harrison(1907)和Carrel(1912)两人开始的。Harrison参考前人经验，创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法。 1907年，哈里森(Harrison)在无菌条件下用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。 1910-1912年，Carrel采用无菌操作、更新培养基、传代，完善了悬滴培养法； 1912年，Haberlandt的学生Kotte和美国的Robins在根尖培养中获得了组织培养的成功。Kotte采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各种氨基酸的培养基。 1915年，昆虫细胞培养的鼻祖是德国人forhardBendict（1878—1958），发表了有关昆虫细胞培养的第一篇文章。 1923年，Carral设计创立了卡氏瓶培养法，用此法可根据需要随时更换培养液，既有利于组织不断生长，又可以运用不同种类的营养液培养不同的细胞，极大地推动了当时组织培养研究。 在培养基方面，Earle在1948年设计了含有碳酸氢钠等盐类的Earle氏盐溶液，Hank’s在1949年设计了Hank’s氏盐溶液。 Earle、Dulbecco等于1943年创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞系；1948年Sanford创建单细胞分离培养法，获L-细胞纯系。 1948年，体外细胞毒性试验细胞毒性实验它是利用体外细胞培养的方法，测定细胞溶解，抵制细胞生长的毒性作用来评价生物材料的潜在细胞毒性。 1948年，RosenBluth等首次报道利用鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物，开始了细胞毒性试验评价生物材料的生物相容性的研究与应用工作。 1950年，Enders及其同事发表了第一篇关于在培养细胞中生长病毒的报告，开拓了以动物病毒为研究对象的新领域。作为大规模细胞培养，Copsik等人成功的进行了有关仓鼠肾细胞（BHK）的悬浮培养。
成纤维细胞原代培养
利用组织块可以成功地培养得到原代培养的人皮肤真皮成纤维细胞。培养中应该注意以下事项： ①一般皮肤主要取白手术过程中切除的部分组织，方法似外科取断层皮片手术操作，但组织一般2—3cm 即可，注意取材时不要用碘酒消毒．此外，不要切取太厚，要尽量去除皮下组织，如果皮下脂肪太厚会影响组织块的贴壁，不易于日后细胞的游出． ②尽量去除表皮，如有表皮未被完全剔除，则可能造成表皮细胞竞争生长，最为常见的为角质形成细胞的污染，它可以和成纤维细胞共同生长．虽说在今后的传代培养时可通过细胞纯化方法适当去除，但这种混和生长状态会对后续实验产生影响．所以，一旦发现细胞污染，应立即停止实验，重新培养． ③在剪切组织块时要注意保持组织块湿润，可向其表面滴加几滴培养液，要始终保持其成湿润状态，这一点要特别注意而且十分重要．剪切时要掌握好时间，尽量在短时间内完成． ④组织块在最初贴壁时不是很牢固，所以开始加液不应太多，以刚刚浸没组织块为易，特别要注意，在最初几天时要减少移动培养瓶次数，避免过多晃动而造成组织块脱壁，最好在开始3 d内不换液．⑤文献报告成纤维细胞培养多在CO 培养箱内进行，培养箱内环境为CO 浓度50 ml／L，湿度95％，培养瓶为开放式．因其湿度，温度及氧气与人体内实际情况较为接近，所以适合成纤维细胞的成长．但开放式培养的同时也增加了细胞培养污染的机率，所以，可以根据
自己实验室的条件选用合适的培养方法，如半开放式和充气后密闭瓶口，其效果也十分理想．但同时要密切观察培养液的pH变化，以保持适宜的酸碱度． ⑥细胞培养失败的最常见原因是污染，其中以微生物污染最常见，污染一旦明确，多数将无法救治，应尽快弃之，以防止污染扩大，影响其他细胞．因此，应在各个阶段严格遵守无菌操作原则，把好每一关口，尽可能禁止其他污染的物品进入操作环节，以避免造成时间、人力、物力的浪费．
大规模细胞培养技术
大规模细胞培养技术简介 大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。 所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。 在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。 随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70 年代以来，细胞培养用生物
小鼠成纤维细胞原代培养.docx
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养 一.实验目的 1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。 2 ?熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。 3?了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。 二.实验原理 自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物 理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。 如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。 细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传 代培养。 1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化 培养法。 组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶 中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。组织块培养法操作过程简 便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。 消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。该方法主要使用生物化学手段将 较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接 松散、相互分离，细胞失去与间质的连接，活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团的悬液，分散的细胞易与外界进行新陈代谢互动，在短时间内即可贴壁生长成片。胰蛋白酶
(整理)凋亡相关的基因和蛋白
细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。在胚胎发育阶段通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞，保证了胚胎的正常发育；在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康。和细胞增殖一样细胞凋亡也是受基因调控的精确过程，在这一节我们就细胞凋亡的分子机理作简要的介绍。 细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase、一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。 一、凋亡相关的基因和蛋白 细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。 1．Caspase家族 Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。它们均有以下特点：①酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性；②总是在天冬氨酸之后切断底物，所以命名为caspase（cysteine aspartate-specific protease），方便起见本文称之为凋亡酶； ③都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。 最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因[1]是ICE，即：白介素-1 β转换酶（Interleukin-1 β-converting enzyme）基因，因该酶能将白介素前体切割为活性分子，故名。通过cDNA杂交和查找基因组数据库，在人类细胞中已发现11个ICE同源物[2]，分为2个亚族（subgroup）：ICE亚族和CED-3家族（图15-6），前者参与炎症反应，后者参与细胞凋亡，又分为两类：一类为执行者（executioner或effector），如caspase-3、6、7，
原代培养中成纤维细胞的抑制
成纤维型细胞：在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3 厘米个 长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。 培养细胞的纯化 【我是小米2】培养细胞的纯化： 1、自然纯化 即利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增值潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞。有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法，自然纯化建立细胞系。 2、人工纯化 （1）酶消化法 在消化培养细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代培养和培养早期这种差别尤为明显，因而可以利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。 （2）机械划除法 原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。 （3）反复贴壁法 成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约 10－30min完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。 （4）克隆法 采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，选择出所需要的克隆。 （5）培养及限定方法 某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则无法生长，可以利用这种技术来纯化细胞。
（6）流式分选 brdu 【sxtyzyq2】除了Brdu能用于抑制成纤维细胞的生长，便宜易买到的 【snany】阿糖孢苷效果不是特别理想 【cl1202】我在SD大鼠胃粘膜壁细胞原代培养的文献中看到的：成纤维细胞大量生长是壁细胞分离培养失败的常见原因。培养基中加入血清会刺激成纤维细胞而抑制壁细胞生长，对壁细胞可能还有一定的毒性作用。为了减少成纤维细胞的生长，先加入含有胎牛血清（100ml/L）的培养液，时差贴壁30-45分钟，除去成纤维细胞，然后再换用无血清的培养液进行培养。不知道你有没有用？试试吧。 【sxtyzyq2】买sigma公司的brdu然后把它配成终浓度为1 mmol/l然后1ml 培养液中加入5微升就可抑制成纤维细胞 【gfeng8078】我是养心肌原代，也需要抑制成纤维细胞，请问各位大侠，5-brdu 用多大的浓度？ 【cheerfulness】养心肌原代最初24h培养液中加入终浓度为0.1mmol/L的brdu 【gfeng8078】你是怎么样达到0.1mmol/L的浓度呀，由于有培养液的存在，加了Brdu进去，自然就稀释了？我想把Brdu溶解于DMEM中然后一起抽滤，可是有报道说这对Brdu的药效有影响 【jiangbin1230】请问用组织块贴壁法能培养出肠的成纤维细胞吗？我试过很多次了，一个皿就只有零散的一二十个成纤维细胞，都是柱状上皮细胞，是否由于正常组织太少不能培养出啊？能帮帮忙吗？ 【sdf771214】请问成纤维细胞的帖壁时间一般是多少?我养的是内皮细胞,如何时差帖壁啊? 【victoh】不同来源的成纤维细胞在不同培养支撑介质上的贴壁时间应该是不一样的，此外也还受到其他一些因素的影响，至于上皮细胞，其本身种类就更加复杂了 上皮细胞 【warmbull】我现在正在做的培养，但发现有几瓶细胞可能是被成纤维细胞（长梭形、透明细胞）污染了，后来成纤维细胞抑制了色素上皮细胞的生长。现在又出现了这种情况，请问各位大侠，有什么办法可以除去杂细胞？还有，我养的色素上皮细胞生长增殖很缓慢，有的甚至慢慢萎缩，会是什么原因呢？
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI法)
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI法) 产品简介： Leagene细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一种采用经典的碘化丙啶染色(PI staining)方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种可以嵌合到双链DNA和RNA的碱基对中与直接和的荧光染料，无碱基特异性。碘化丙啶与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被Propidium Iodide染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。 碘化丙啶染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组DNA片断在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。 细胞凋亡时，流式细胞检测可呈现亚二倍体核型的特征，根据光散射的特点，PI染色可以区分细胞凋亡和细胞坏死的细胞峰型。细胞凋亡时，出现凋亡细胞皱缩、染色质浓缩、核碎裂，产生凋亡小体，使细胞的前向光散射低于正常。在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对侧向光散射的能力增加或没有变化。在细胞凋亡的晚期，前向和侧向光散射的信号均降低。细胞坏死时细胞多表现为细胞肿胀，因此前向光散射高于正常，对侧向光散射高于正常。 Leagene Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit经常用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测，亦可用于区分细胞凋亡和细胞坏死。该试剂盒检测细胞含量范围一般为0.1～1×106之间。 主要成分：
成纤维细胞
成纤维细胞 科技名词定义 中文名称：成纤维细胞 英文名称：fibroblast 定义： 普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。分泌前胶原、纤连蛋白和胶 原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 疏松结缔组织中的成纤维细胞 成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的 间充质细胞(mesenchymalcell) 分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚， 多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁
大而明显。根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成 和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维 细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分 重要的作用。 目录 细胞的功能活动状态划分 来源 特征 创伤修复 分离培养 原代培养 展望 展开 编辑本段 细胞的功能活动状态划分
根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌 活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核 小着色深，核仁不明显，细胞质少。此二型细胞可互相转化。[1] 编辑本段 来源 成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平 细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。 成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（proalphapolypeptidechain ），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen ）。前 胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞 外。在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶 原分子（tropocollagen ）。许多原胶原分子成行平行排列，结合成具 有周期性横纹的胶原原纤维。由胶原原纤维互相结合形成胶原纤维。 编辑本段 特征 成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细 胞(mesenchymalcell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维 细胞(fibrocyte)的
心脏成纤维细胞原代细胞培养
乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养 一、实验动物 1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。 二、试剂及配制 高糖DMEM(gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。 培养液:DMEM培养基：FBS：双抗100：10：1（45ml：5ml：0.5ml） 酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH7.2 ～7.4)稀释,配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ 型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH7.2～7.4) 中,配成0.1%的胶原酶消化液。0.1%胰蛋白酶及 01%Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。 三、实验仪器 超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机?? 四、组织消化和分离细胞 1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。 用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。 2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。用眼科虹膜剪在剑 突处正中线 稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部 , 取 出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。 3、将鼠心脏全部取出后 , 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清 洗3次, 去除血污。 4、将心脏剪成约1mm×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪 刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。 5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍,37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器 ,60r/min 搅拌 10min, 吸管轻轻吹打组织块 1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。 6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。 五、培养细胞 1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后,1200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。
(完整word版)细胞凋亡过程
细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，比较清楚的通路主要有：1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡，我们以Fas -FasL为例：Fas是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，它与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤：首先配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物，这个复合物中包括带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD。Fas又称CD95，是由325个氨基酸组成的受体分子，Fas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，但FasL的表达却有其特点，通常只出现于活化的T细胞和NK细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够最有效地以凋亡途径置靶细胞于死地。Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域（DD,death domain）。三聚化的Fas和FasL结合后，使三个Fas分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白，它由两部分组成：C端（DD结构域）和N端（DED）部分。DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合，该蛋白再以DED连接另一个带有DED的后续成分，由此引起N段DED随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原发生同嗜性交联，聚合多个caspase8的分子，caspase8分子遂由单链酶原转成有活性的双链蛋白，进而引起随后的级联反应，即Caspases，后者作为酶原而被激活，引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。因而TNF诱导的细胞凋亡途径与此类似2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途径线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡诱导因子，如AIF，参与激活caspase。可见，细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。促凋亡因子能诱导细胞色素C 释放和凋亡小体的形成。很显然，细胞色素C从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途经也有细胞色素C从线粒体的释放。如对Fas应答的细胞中，一类细胞（type1）中含有足够的胱解酶8 （caspase8）可被死亡受体活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达Bcl-2并不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在另一类细胞（type2）如肝细胞中，Fas受体介导的胱解酶8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途经来放大，而Bid -- 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶8向线粒体传递的信使。尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，到目前为止，至少已有14种Caspase被发现，Caspase分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspase基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase家族一般具有以下特征：1)C端同源区存在半胱氨酸激活位点，此激活位点结构域为QACR/QG。2)通常以酶原的形式存在，相对分子质量29000-49000(29-49KD），在受到激活后其内部保守的天冬氨酸残基经水解形成大（P20）小（P10）两个亚单位，并进而形成两两组成的有活性的四聚体，其中，每个P20/P10异二聚体可来源于同一前体分子也可来源于两个不同的前体分子。3)末端具有一个小的或大的原结构域。参与诱导凋亡的Caspase分成两大类：启动酶（inititaor）和效应酶（effector）它们分别在死亡信号转导的上游和下游发挥作用。
一 人皮肤成纤维细胞培养
Ist. Nazionale Neurologico Carlo Besta Laboratory Procedures for Human Cell Culture August 2004 _______________________________________________________________ PRIMARY FIBROBLAST CULTURE FROM HUMAN SKIN BIOPSY This protocol describes the steps for obtaining a primary fibroblast cell line from human skin biopsies. Fibroblasts are derived directly from excised skin as explants; enzyme digestion by collagenase may help obtain cells in a shorter time. This protocol describes the different steps for obtaining a primary cell line from a skin biopsy. Equipment and materials ?Laminar flow hood ?CO2 incubator ?Inverted microscope ?Sterile surgical Instruments for microdissection ?BME fibroblast medium +2 or Mg+2 ?PBS 10x without Ca ?Collagenase type II (4mg/ml) ?Petri dishes 100 mm ?Pasteur pipettes 2 ?Culture flask, 25 cm ?15 ml sterile plastic tube BME Fibroblast medium BME 80 ml Foetal bovine serum 20 ml Penicillin-streptomycin solution 100x 1 ml Filter and store at +4°C, up to 1 month. The skin biopsy sample should be shaped as a diamond and about 5-10 mm in diameter. Collect the tissue sample in sterile BME fibroblast medium. Procedure 1 1.Rapidly wash the skin biopsy in PBS in a Petri dish, cut into small fragments and transfer these to a flask. https://www.sodocs.net/doc/7d13212616.html,ing a sterile Pasteur pipette with flame-rounded tip, distribute the small tissue fragments over the bottom surface of the culture flask. 3.Pass the flask rapidly and carefully through the Bunsen flame in order to evaporate the medium so that the minced tissue pieces adhere to the plastic surface, but so as not to heat-damage the minced tissue. Take care not to cook the tissue! 4.Carefully add BME medium for fibroblast growth, firmly close the lid of the flask and place in CO2 incubator. 5.The next day, slightly unscrew the lid of the flask so that the tissue can “breathe.” 6.Replace the culture medium after two days and, from this point on, replace it three times a week.
肺间质纤维化的护理
肺间质纤维化的护理 发表时间：2011-04-20T11:57:29.033Z 来源：《中外健康文摘》2011年第1期作者：陆春娟[导读] 间质性肺病或弥漫性肺实质疾病指容易形成肺脏气体交换单位炎性渗出，以致纤维化的疾病。 陆春娟 (黑龙江省海员总医院 150020) 【中图分类号】R473 【文献标识码】B 【文章编号】1672-5085 (2011)01-0352-02 【关键词】肺间质纤维化肺泡上皮细胞肺血管护理 间质性肺病(interstitial lung disease，ILD)或弥漫性肺实质疾病(diffuse parenchymal lung disease，DPLD)指一组容易形成肺脏气体交换单位炎性渗出，以致纤维化，并具有相似的临床表现、影像学改变及病理生理学特征的疾病。其病变累及范围常扩展到小气道，包括肺泡小管、呼吸性细支气管及终末细支气管，包括许多可引起肺部不同程度的炎症和纤维化的急性和慢性肺部疾病(200多种)。 (一)生活护理 1.为住院病人介绍病房环境，主管医生和护士，减轻其焦虑不安、紧张、恐惧心理。 2.为病人提供安静、舒适的休养环境，减少探视人员，避免交叉感染。 3.急性期绝对卧床休息，给予中流量吸氧3~5L/min，血氧饱和度维持在90%以上。疾病缓解期根据情况鼓励病人室内活动并间断吸氧。疾病恢复期如果体力允许指导病人进行室外活动。 4.缺氧导致机体能量消耗增加，因此为病人提供高蛋白、高热量、高纤维素、易消化的饮食，经常变换食谱，注意少食多餐。进餐时可以吸氧，避免进餐时气短而导致食欲下降。 (二)心理护理 由于本病多数呈慢性过程，预后不良。因此，病人在病情反复且逐渐加重的治疗过程中会产生恐惧、悲观、预感性悲哀等不良情绪反应，医护人员要主动与病人建立有效的沟通，并争取家属及单位对病人的支持，从而帮助他们树立信心，调整心态，积极配合治疗。 (三)治疗配合 1.病情观察 (1)注意咳嗽、咳痰情况。如果病人由干咳变为湿咳并伴有痰量增多、体温增加，常表示合并细菌感染，应指导病人正确留取痰培养标本并及时送检，以便指导用药。 (2)根据医嘱给予有效的抗生素，进行抗感染治疗。咳嗽频繁者不宜选用强力镇咳药，以免抑制呼吸中枢，影响排痰。 (3)气短加重者应告诫病人持续吸氧，以改善静息状态下的呼吸困难和活动后的喘息。 (4)重症病人应用心电监护，监测血氧饱和度，使血氧饱和度保持在90%以上，必要时进行动脉血气分析，观察有无二氧化碳潴留，以调整用氧。 2.对症护理 (1)咳嗽、咳痰明显的病人，应遵医嘱给予祛痰止咳药，用吉诺通时应嘱病人在饭前服用，使药物顺利到达小肠，与特异抗体结合发挥作用。服用止咳糖浆后不要再服用水冲服，并注意观察止咳祛痰药的疗效。 (2)发热病人如果体温低于37.5℃，多是由于非体液免疫反应所致，无须处理。超过39℃，要给予头置冰袋、温水擦浴等物理降温措施。 (3)病人出现胸闷、憋气、呼吸困难等呼吸衰竭症状时，应给予中流量吸氧3~5L/min，血氧饱和度维持在90%以上，必要时应用文丘里面罩给予病人高流量高浓度吸氧，如有二氧化碳潴留，则应给予持续低流量吸氧1~2L/min，注意气道湿化。对于重度呼吸衰竭的病人可应用机械通气治疗。 (四)用药护理 由于糖皮质激素具有抗炎、抑制免疫反应、减少肺泡巨嗜细胞数量、抑制其活化和细胞因子释放的作用，因此，在特发性肺间质纤维化早期肺泡炎阶段有一定的疗效作用。糖皮质激素药物治疗期间应注意以下事项： 1.严格按医嘱坚持服药，告诫病人切忌不要随意停药或减量，因为突然停药易造成病情反复，如要减药必须在医护人员的监护下进行。 2.激素治疗期间应进食含钙、含钾较高的食物，如牛奶、鱼、虾皮、橘子汁等，防止低钙低钾症。 3.长期服用激素可造成骨质疏松，应避免参加剧烈活动，否则易造成病理性骨折。 4.注意口腔护理，长期大量应用激素，易发生白色念珠菌感染，应每日刷牙2~3次，每日常规检查口腔黏膜，如已发生白色念珠菌感染可用氟康唑生理盐水涂抹。 5.用激素期间，由于机体抵抗力低，容易加重或诱发各种感染。因此，应严格无菌操作，尽量避免留置尿管等侵袭性操作。 6.严密观察激素的副作用，如满月脸、水牛背、水钠潴留、胃溃疡、高血压、糖尿病、精神症状、停药后反跳等，及时向病人做好解释工作，解除病人对激素的不安心理。 (五)健康教育 1.指导病人及家属识别与自身疾病有关的诱发因素，如避免吸烟、接触刺激性气体及减少呼吸道感染等易使本病反复发作及加重的因素。 2.为病人及家属讲解氧疗知识，使病人在出院后仍能继续进行吸氧治疗。 3.合理安排生活起居，注意休息，避免过度劳累。 4.鼓励病人进行呼吸锻炼，掌握活动的方法及原则。如做呼吸操、慢跑，以不感到疲劳、喘憋为宜。告诉病人如果出现胸闷、气短、呼吸困难、咳嗽、咳脓痰或伴有发热等症状时，应及时到门诊就诊。 参考文献 ［1］崔焱.护理学基础［M］.第5版.北京：人民卫生出版社，2005：128. ［2］汪函滋.实用重症临床护理学［M］.北京：人民卫生出版社，1998：67.
中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用
中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用 苗景赟孙文改解红艳 (通用电气医疗集团 GE HC Life Sciences) 作为生物药物的“重磅炸弹”，大规模动物细胞培养生产治疗用单抗已成为生物制药发展的主导。Mabselect SuRe亲和层析结合Capto Adhere复合离子交换两步层析工艺已经成为抗体生产工艺的亮点，而中空纤维膜过滤技术是一种快速高效的膜分离技术，具有容尘量高、温和低剪切力、操作灵活、成本低、易于放大等优点，因此广泛应用于重组蛋白、疫苗等生物制药领域。通过将中空纤维膜过滤技术和下游两步层析工艺相结合，可以成功的迎接几十甚至上百公斤单抗生产所面临的挑战。 1.单抗的发展和面临的挑战 近年来，高密度细胞培养技术和大规模蛋白质生产纯化技术的不断进步，推动了治疗用抗体产业化的发展。和传统的基因工程蛋白药物相比，治疗用单抗具有一些不同的特点：(1) 高剂量 单抗的给药剂量较高，一般从数百毫克到克级，且给药方式多为静脉注射。因此，抗体的生产规模和产品质量都面临着巨大挑战。 为了满足日益增长的高剂量抗体药物需求，大规模细胞培养技术不断发展：细胞密度已达107 ~ 108 cell/ml；表达量从1~5g/L增加到>10g/L，甚至出现27g/L的表达量新高1；细胞培养规模从上千升增加到20,000升。这就要求开发一条高速、高载量的下游分离纯化工艺，以便能够快速处理上万升的培养液，并实现每批几十公斤甚至上百公斤抗体的生产。另外，高的给药剂量也对产品质量提出了更高的要求。为了保证药品安全，很多杂质成分必需降低到极低水平，如宿主DNA，内毒素等；潜在的病毒、泄漏的亲和配基以及抗体的聚集体也必须有效去除，这就要求采用更高效的分离纯化工艺，并对每步工艺去除各种杂质的能力进行深入研究。 (2) 易形成多种变体 抗体是一类结构比较复杂的大分子，比活和稳定性很大程度上取决于其翻译后修饰的程度，如糖基化、磷酸化等。在生产过程中会由于糖基化程度不同、蛋白酶作用、以及脱氨基和脱酰胺等化学反应而产生性质不同的多种抗体变体2；另外，氧化、聚集和片段化也是常见的降解途径。针对这些变体，在表达和纯化过程中选择参数 (如pH、盐浓度等) 时要充分考虑到抗体的稳定性；另外，应严格控制细胞培养的条件，如溶氧、渗透压等3；同时加快下游分离纯化的速度，最大程度避免抗体在纯化过程中产生变体，保证终产品的均一性和高比活，也有利于控制终产品的内毒素水平。 (3) 高附加值 作为多种癌症和抗排异的特效药，高纯度的治疗用抗体具有极高的市场价值。因此收率成为抗体生产过程中的重要考量指标。减少不必要的工艺步骤不仅可以提高收率，还能提高生产效率。
组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一--PI法
组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法 schoman 无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。主要操作步骤如下： 1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。 2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。 3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。 4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h。 5、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。 注意事项： 1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。如组织难以消化，可加入适量胶原酶。另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。 2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。 3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。 4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。 其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。在此不赘述。yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA 结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。 偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？ hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！ 用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。 核染色剂（核染料） yuanaiyu：用流式细胞仪测脑组织细胞悬液中细胞线粒体的膜电位，需先将细胞与细胞碎片区分开来，现考虑用一种亲细胞核的染料将细胞分选出来，已尝试用过PI，但pI分子量大，过分破坏细胞膜而影响了线粒体膜电位。请问有没有一种小分子的核染料，既能进入细胞核又对对细胞膜的影响很小？何处能买到？