线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备方法-图文并茂
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备方法
Pipilulu
目录：
第一部分线栓模型制备理论及经验
1插线法局灶性脑缺血模型简介
2大鼠颈部及颅内动脉解剖及常用插线位置
3大鼠大脑中动脉阻断实验的总结和心得（zhuqing0506战友）
4 也谈大鼠MCAO模型的实验体会（bladeflyer战友）
5 我的做MCAO模型的一些体会（intelligentwang战友）
6 线栓法大鼠脑缺血再灌注模型（MCAO）制备技巧（ysf2k战友）第二部分线拴模型制作过程（雨后天晴战友）
第三部分灌注取脑（pipilulu战友）
第四部分 TTC染色（pipilulu战友）
前 言
相信不少神经内科的研究生都作过或将要作大鼠线栓模型，都有一个从查文
献了解方法到跟师兄、师姐学习再到自己体会摸索直至熟练的过程，在模型制作
的过程中可能的经历了从模型不成功的郁闷到熟练后成功的喜悦（我们是有这样
的感觉）。为了缩短各位将要作或刚开始作MCAO 模型的战友的摸索过程，提高模型制作的成功率，我们愿意将自己的经验与大家分享，相信各位战友看过后将对制作大鼠线栓模型有更深的认识，并以其为乐趣，同时欢迎各位熟练的战友与我们交流经验。
第一部分线栓模型制备理论及经验
⒈插线法局灶性脑缺血模型简介
八十年代Koizumi和Longa创用了不开颅的大鼠MCA可逆性脑梗塞模型，此后，应用插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的方法不断改进和完善，已渐趋成熟，目前该法已逐渐取代开颅法而成为最流行的方法。该模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。从ECA插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。
1994年Huang等[55]首次将线栓技术应用于小鼠局部永久性脑缺血模型。1997年Hara 等[56]将线栓技术改进后应用于小鼠局部暂时性脑缺血模型。此后不断有学者借助于显微技术和多功能生理监测手段建立小鼠局部线栓脑缺血模型[57,58]。国内蒋晓帆等[59]，王芙蓉等[60]也对该方法进行了研究。
线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。但线栓造模也并非完美无缺，存在着下列不足：①线栓造模过程是非直视下的手术，血流是否完全阻断不能即刻得知。②动物品系、体重、批次会影响结果。动物饲养条件好的单位所繁育的动物，可以使影响程度降低。③操作者的科研训练影响结果。严格的训练和足够例数的实践可以复制出稳定的结果。④血管破裂出血。操作不小心极易刺破血管或拔线栓时引起出血。轻柔、精细的操作可以减少血管破裂的发生。
2大鼠颈部及颅内动脉解剖及常用插线位置
3大鼠大脑中动脉阻断实验的总结和心得（来自zhuqing0506战友）
本人现在正在做线栓法大鼠大脑中动脉阻断实验（MCAO模型），这方面的资料我查了一些，这个实验我也作了一段时间，不敢说很专业了，不过现在基本上我能在15min左右完成手术，而且手术过程中不出一滴血，造模后缺血程度基本一致。虽然前面有很多前辈发了很多MCAO的很专业的贴子，不过我觉得比较凌乱，现在我把我的心得体会和以前的贴子的精华部分奉献给大家，希望这会对将要做这个实验的朋友有一丝的帮助。虽然做实验总会有郁闷的时候，不过风雨之后总会见到彩虹的，这可以也是我的心得体会。衷心祝福大家能把实验做的成功、完美！！！！
实验前准备
麻醉剂：水合氯醛（应较好的控制大鼠体温）
保温：60W白炙灯高度为37cm直接照射能使肛温保持在 37℃
栓线的制备：
1.取熔点为56℃的固体石蜡一块，在瓷杯中加热熔化。直径为o．24mm、长5cm的鱼线一端5mm长的一段，垂直在熔化的石蜡中迅速浸入并提起，立即凝固的一薄层石蜡可牢固地粘附在鱼线一端的表面，其直径为0.26mm。就这样，普通的鱼线即可变成规相一致头端
光滑圆钝的栓线。
2.在鱼线18mm的位置用涂改液标记一个白色点。
TTC的配制：用0.2mol/L磷酸缓冲液（PBS）配成2%TTC溶液（pH7.5）,避光保存。
体重与栓线直径：线栓直径0.24mm采用的SD大鼠，体重250-300g。
实验方法：
动物用10％水合氯醛（35mg/kg）腹腔注射麻醉。仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭ICA，然后近心端结扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部4mm处剪一小口，将拴线插入到ICA，这时用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。（不可过紧，否则近线困难，但松了又会出血。）用眼科镊轻推拴线，从血管分叉处开始算距离，当插入深度在18 mm时（一定要将血管放松至原来状态, 且保证标记点在分叉处,由于标记的是白色的所以很容易看的），紧紧系牢CCA远心端的细线，此时的关键是动作轻柔，不要使ICA有任何的牵拉，否则栓线会脱出ACA，可能会造成缺血失败。血管外的栓线不要留得过长，更不要缝在皮外，大鼠醒来后会自己拔出。缝合伤口，单笼饲养观察。如果需要再灌的话，就把拴线抽出即可，因为脑底有个动脉环，结扎一侧颈总动脉大脑不会缺血的。
注意事项：
1．分离时要层次清楚：正中剪开SD大鼠颈部皮肤，分离皮下结缔组织时会发现该组织与颈部两侧鼓泡腺体（很多人误认为那是甲状腺）结合紧密，因此不必分离过于太细，直接在正中两侧鼓泡腺体之间分离，这样能不接触胸锁乳突肌而直接暴露颈前颈群且不会损伤腺体造成过多出血。下一步是分开颈前肌群，这时候要注意用小钳子作撑开分离动作要在左右肌肉块之间而不是一块肌肉的肌纤维之间，虽然它们看起来很模糊，但这样能保证不会出现较多条索状细肌纤维条影响下一步颈内动脉的寻找与分离，并且能整块地向一侧牵开颈前肌群暴露颈动脉鞘。见到颈动脉鞘了则要注意细致分离迷走神经，若损伤则可能影响其呼吸而死亡的。
2.分离血管时，要尽量将血管剥离的干净些，这样在用眼科剪剪口时就不会误剪外膜（误剪的话再剪就很容易把口剪大了或者剪断了，要注意口子越小越好插线），且要剪一个斜行的切口（眼科剪与血管约成45度），这样在血液刚流出时仍能看上翻的断口管壁，这样即容易插入栓线且血管受得了插线时一定的牵拉。当然，切勿牵拉过猛，以免使血管发生痉挛，导致栓线不能顺利进入。
3.注意尽量不要损伤在颈内颈外分叉下的交感神经节。
4. 如果你用的是中长效麻醉剂，插线成功后，固定丝线，然后让其俯卧位，而且稍稍抬高其颈部，才能确保模型成功。
5. 栓线进入后颈内动脉后即可逐渐插入了，有时候很顺利一插到底，但有时候在中间就怎么也进不去了，这是因为在血管入颅穿过颅骨时有一个狭窄或者角度。因此，碰上这种明显阻力时，一定不能盲目向前使力插，越插栓线前端变形越进不去且容易损伤血管。这时候正确的作法是往外抽出较多栓线，也许会有一定的动脉血流出，不必慌，只要顺着血管走行调整一下进线角度轻柔的使劲，一般都能进去，反复试几次还不行最好换根栓线，很可能前端也经变形角度变了！颈内动脉的走向为内上方,可以用眼科镊夹住鱼线插,但进去后要注意,别太用力,要不血管就要破了
6. 栓线不能在血管里反复进退，否则及容易造成蛛网膜下腔出血，，而且很容易误解为模型成功，因为这时的神经功能改变也很明显，但并不是由于栓塞引起的
7. 进线时，使栓线有一定程度的弯曲，且只要保证栓线向屋顶方向弯曲，一般都能将线插如颅内，决不会进入翼腭A。
8. 术后一定要注意保暖。
9. 插入线拴要轻柔熟练，速度尽可能快，以避免时间长了血管内血栓形成。
10．手术后评分的主观因素很大，有用4分制和11分制的，我个人认为用4分制比较准些。其标准是：0分，无神经损伤症状; 1分，手术对侧前指不能完全伸展；2分，向手术对侧行走；3分，大鼠成追尾状运动。
11. 性激素对脑梗死面积有较大影响，应采用单一性别的动物进行实验。
舍去标准：
⑴栓线插入深度不足18 mm,且无明显神经功能缺损表现或症状很轻的大鼠
⑵蛛网膜下腔出血、MCA起始部或其附近的willis环动脉有凝血块的大鼠，因为这是出血性脑损伤或永久性脑缺血损伤，而非MCAO/Reperfusion损伤。
3）手术时出血较多，症状很重的动物。
死亡原因分析：
首先要找出死亡原因，解剖死亡大鼠的脑，先看是否有蛛网膜下腔出血，如有出血，表明死因是插线太深，以后注意插线深度；如无出血，则还要再看是否有严重的半球水肿，如水肿严重，则表明死因是脑缺血时间太重，需要缩短缺血时间；如既无出血，又无明显的脑水肿，那就要注意动物状态或生活环境是否太差。
附带的其他说明：
1..线拴法存在一定的死亡率。对于这情况我感觉比较头疼，也希望高手指点。
2. 模型成功率和评价指标是相关联的矛盾，手术后可根据动物的表现加以评分，确定模型是否成功，模型成功与否会对结果的评价带来影响。有可能你模型没成功，结果判断为是药物的作用效果。所以对手术后模型是否成功应该进行筛选的。另一方面，如果你做了预防给药，药效的作用也容易被认为是模型不成功，这也需要后边进行脑组织染色和组织血检查进行验证。脑组织检查时可剔除模型不成功以及SAH的个例。
故实验在手术后要进行行为学评分，试验结束时应对脑组织进行组织学检查或染色。TTC染色是采用的宏观标本染色，确定梗死面积可采用体积法或面积法，但最好用扫描仪将脑组织切片进行扫描，选择合适的软件统计梗死面积。
3.大鼠大脑中动脉永久性闭塞性脑缺血模型，梗死体积出现的最小时间点可能为2h，体积随时间进行性增大，至12h基本趋于稳定
4. 整个试验是很费动物的，存在15-30％的淘汰率（如果你做的好），但注意严格控制自己淘汰的动物（纪录具体情况）。
5. 除了刚才说的蛛网膜下腔出血外，还有一些老鼠肺出血明显，整个肺暗红，我也想不出原因，不知道是不是医学临床所说的脑肺综合症.
6．在颈内和颈外之间常常会有一个交通支，其位置也不太相同，一定要万分小心，我曾经因为不知有这个交通支而勿将其破坏，导致大鼠出血不止！
4 也谈大鼠MCAO模型的实验体会（来自bladeflyer战友）
我的课题是关于某药物对缺血性神经疾病的保护作用研究，因此对于动物脑缺血模型尤其是MCAO模型的制作不得不熟练掌握，于是有了大量郁闷的摸索与重复劳动，也有关于它的提高与体会，虽然前面有很多前辈对于MCAO的贴子已经很专业了，但我想也许自己也能有此微弱的闪光让后面的朋友们感到少许光明和温暖，哪怕只是一个愿望，呵呵！
关于大脑中动脉缺血模型，目前文献能查到的有三种制作方法，应用手术的方法和颈内动脉注射ET-1的方法都不如线栓法流行，而我自己的实验也证明线栓法制作MCAO是效果稳定并可行的。下面谈谈我自己的一些体会，一家之言仅供参考：
一）关于实验大鼠的选择：前面我曾查到一篇贴子谈到了大鼠种系选择，而我自己作过
wester鼠和SD大鼠，感觉从解剖层次上看品系上差别并不是太大，或者说对于造模的影响还不如大鼠体重的选择。大鼠体重太轻，对于缺血及手术刺激的的耐受能力差容易死亡；而大鼠体重太大，适应能力是强了，但造模的效果却让人不放心，因为要考虑其血管相对于直径相同的栓线和相同的插入深度来说显得稍粗，造成血管堵塞不完全而造模缺乏一致性的问题。经过一些摸索，最后定在大鼠体重在220—280mg之间，感觉不错，造模后用TTC染色观察梗死面积基本相当。
二）关于栓线的选择：我查到的文献谈到插入的栓线时一般都只会笼统提一句…鱼线或者…尼龙线，而对于栓线直径则有一定出入，还有文献谈到对于尼龙线头进行灼烧以保证栓线顶端不刺伤血管的处理。在实际的摸索中我强烈地感觉到其实这栓线的选择是造模成败的关键，我先用的直径0.24mm的尼龙线，并灼烧线头，发现这并不是个好方案，很难掌握灼烧的火候，线头常常太大不易进入并且该直径相对于上面提到的大鼠显得太粗，于是我又试了不同的鱼线，最后我选择了直径0.22mm的火牌进口鱼线，其韧性比较合适插线，线头没有特殊处理只是剪线时注意不要剪得明显太尖，最后取脑后观察几乎未见明显血管损伤出血。
三）关于操作技功：实际上造模的困难主要在于操作时分离与插线过程中的熟练程度不够，因此最根本的办法是多作几只老鼠，呵呵，所以我认为技巧都是相对的。
1．分离时要层次清楚：正中剪开SD大鼠颈部皮肤，分离皮下结缔组织时会发现该组织与颈部两侧鼓泡腺体（很多人误认为那是甲状腺）结合紧密，因此不必分离过于太细，直接在正中两侧鼓泡腺体之间分离，这样能不接触胸锁乳突肌而直接暴露颈前颈群且不会损伤腺体造成过多出血。下一步是分开颈前肌群，这时候要注意用小钳子作撑开分离动作要在左右肌肉块之间而不是一块肌肉的肌纤维之间，虽然它们看起来很模糊，但这样能保证不会出现较多条索状细肌纤维条影响下一步颈内动脉的寻找与分离，并且能整块地向一侧牵开颈前肌群暴露颈动脉鞘。见到颈动脉鞘了则要注意细致分离迷走神经，若损伤则可能影响其呼吸而死亡的。
2．插线血管的选择：目前存在两种插线法，一种是结扎颈外动脉从颈总动脉插线，另一种是结扎近端颈总动脉而从牵拉后的颈外动脉插线，我试过后者，颈外动脉常常极细牵拉后容易拉断又不好插线，因此我推荐前者，简单易行损伤小！那么，就须要在结扎颈外动脉时尽量靠近颈内外动脉血管分叉处，这样不仅能保证栓线不进入颈外动脉残端，并且可以让使线节成为一个分叉标志用于衡量进线深度时用。
3．血管的剪口大小：在颈内动脉血管上剪口是个细致活，剪口大小常常成为影响实验速度的一个重要因素，剪口太大时不仅血管容易断而且由于血管内血液流出太多使剪口处血管壁粘合在一起，根本找不到插入的开口；而过分小心使剪口太小刚血是看到出来了点但入口也找不到。我的经验是剪一个斜行的切口（眼科剪与血管约成45度），这样在血液刚流出时仍能看上翻的断口管壁，这样即容易插入栓线且血管受得了插线时一定的牵拉。
4．插线时动作轻柔：栓线进入后颈内动脉后即可逐渐插入了，有时候很顺利一插到底，但有时候在中间就怎么也进不去了，这是因为在血管入颅穿过颅骨时有一个狭窄或者角度。因此，碰上这种明显阻力时，一定不能盲目向前使力插，越插栓线前端变形越进不去且容易损伤血管。这时候正确的作法是往外抽出较多栓线，也许会有一定的动脉血流出，不必慌，只要顺着血管走行调整一下进线角度轻柔的使劲，一般都能进去，反复试几次还不行最好换根栓线，很可能前端也经变形角度变了！
四）．最后谈谈进线深度。查阅文献描述关于插入深度都写的18.5＋/1.5mm，其实这深度是要根据大鼠体重略作调整的！插线太深绝对是MCAO后大鼠死亡率高的主要原因，很多
是死于深插线后血管受刺激蛛网膜下腔出血。因此必须在造模前先将栓线作标志，我上在17mm和20mm处各用记号笔点上一个小白点，然后根据进线时手感控制深度的，一般在18mm左右，千万不能到了深度但没感觉到阻力就仍往里使劲送线，这样往往要遭遇惨重的后果的，呵呵！
谈到MCAO死亡率高，我曾解剖过好些个死鼠，除了刚才说的蛛网膜下腔出血外，还有一些老鼠肺出血明显，整个肺暗红，我也想不出原因，不知道是不是医学临床所说的脑肺综合症？后来作得熟练了（单只造模时间在10分钟左右），插线深度控制好了，死亡率一般能控制在20% 以下，也就没有注意肺出血了，不知道师兄师姐们有什么认识吗？
5 我的做MCAO模型的一些体会（来自intelligentwang战友）
关于做MCAO模型，我是走了很多弯路的，经历的打击也是无数，翻翻前辈们写的相关帖子，已经很专业了，我下面要说的只是一家之言，有些可能还比较幼稚甚至谬误，仅供刚刚接触此实验的师弟、师妹们参考，希望对你们有所帮助，不要再重蹈我的覆辙了，也非常欢迎师兄，师姐们不吝赐教！！
首先：关于大鼠品系的问题
在刚开始练手时,SD,WISTER,F344,（雌性、雄性）我都做过，综合来看：SD的颈部局解最棘手，它的结缔组织、肌肉间隙等较模糊而且联系的比较紧密，不容易分离，很费时；WI STER相对最容易，尤其是分离颈总动脉鞘时，简直势如破竹，熟练的话，25分钟就可以搞定（从手术开始到缝皮）；F344介于两者之间，不过感觉有时也很不好分。同一品系中雌性和雄性在局解上还是有一定区别的，雄性血运更丰富，更容易出血，而雌性只要不剪破甲状腺就几乎很少出血。
但是，直到我做了不少大鼠之后，一个师姐告诉我：做MCAO用SD！（55555555）所以，如果要做MCAO的师弟师妹们就不要拿什么大鼠就练什么大鼠了，最好一开始就锁定SD雄性大鼠，直到练熟为止，因为不同品系的大鼠局解总会有差异，而且个别部位手感差异还比较大，所以从开始练时就应该练以后实验用的大鼠。
第二：关于麻醉的问题
麻醉大鼠具体用药因各课题组的习惯不同可能有很多选择，我一直用的是“水合氯醛”(10 %)---0.75ml/250g,效果还可以，最大的好处是大鼠苏醒较快，麻醉时间基本上是2－2.5小时，正好做完手术不久。在这个方面，最大的体会是用量一定宁少勿多，先按照规定剂量注射，如果10数分钟过去大鼠依然活泼如常或者根本无法固定于鼠板上时，可以补加1/2规定剂量偏少一些，然后再稍等数分钟，做手术的过程中就尽量不要追加了，实在不行就随时准备一个乙醚棉球，另其短暂麻醉。最好不要多次0.1ml追加，“手术是治病的，麻醉是管命的”相信所有做过动物试验的人都有深刻体会！
第三：关于大鼠存活的问题！
这是最让人头痛的，每个新手上路时几乎都曾面对过大鼠接近100％死亡率的崩溃感受！我是绕了很大一个圈子才发现真正核心所在的（以我自己的感受）：那就是进线深度问题！通常文献上不管体重多少的大鼠总是千篇一律的说：18.5＋/-0.5mm，所以我就信了，而且往往意犹未尽唯恐大鼠不死似的再稍稍往里进那么一点点，结果可想而知：全死翘翘了！但我一直不知症结何在：无菌操作，肝素肌注，速尿灌胃都用上了，可总没有明显改观，直到有天我尝试缩短进线深度才依稀发现希望的曙光！我的做法是220g大鼠进16－18mm（从分叉处算起），从手感上就是感觉到线刚一突破颅孔再稍稍进一点就行了，然后严格控制进线深度。
在控制进线深度的前提下，再注意无菌操作，把做手术的器械泡在新洁耳灭溶液中消毒，尽量减少其他因素的干扰。
6 线栓法大鼠脑缺血再灌注模型（MCAO）制备技巧（来自ysf2k战友）
本人从事脑缺血的基础研究已有15年的历史，从93年开始研究栓线法大鼠MCAO模型，当时国内几乎还没人做这方面的工作，遇到困难无人可求。仅烧制栓线这一工作就耗了近6个月的时间，功夫不负有心人，我终于发明了一种制备栓线的设备，可以随心所欲控制光滑末端的大小，非常好用，模型的成功率、更死灶的稳定性得到极大改善。95年在成都召开的《第四届全国脑血管病会议》上作了大会发言，受到同行的极大关注，同行试用我制备的栓线后，都给与很高的评价。当时没有一点商业头脑，既没想到开发销售这种设备，也没想到将栓线商品化，仅是免费赠予同行好友，朋友们用得多了不好意思，非要给我点功夫费，推辞不下，也就接了，这反而刺激了我的商业意识。目前全国有20多家科研院所曾经或正在使用我制备的栓线，如中科院上海神经所、协和医科大学药物所、山东大学等。所用材料为市售尼龙线，但不管用什么线，没有一定技巧和设备是很难控制栓线的球端大小的。请体谅我先不作详细说明，因为我暂时还要靠卖鸡蛋的钱换来油盐酱醋，请各位就不要想买我的鸡或问鸡是如何生蛋的，你只要知道市场上现在有鸡蛋可买就行了（email:ysf2k@https://www.sodocs.net/doc/7e13973401.html,）。我会告诉大家这种“鸡蛋”是如何的有营养，请看附件图片1，如此光滑的末端，不仅大大减轻了插线对血管内皮的损伤，降低了刺穿血管的可能性，而且可以更严密的阻断从大脑前动脉供应的来自对侧的血流，更为可贵的是，因为球端直径为0.32mm，插线时可以非常方便的插到位（附件图片2）。用240-280g的大鼠，栓塞1h即可造成稳定的脑梗死。
0.24mm直径的栓线（光镜放大40倍）
如何避免栓线插入翼腭A
大鼠仰卧时，ICA从CCA分出后下行（向背侧）约5mm又分为两支A，即走向乳突泡（Mastoid bulla）的翼腭A和进入颅内的ICA的延伸部分。因为翼腭A的走向几乎和分支前的ICA走向相同，而ICA的延伸部分则是改向头侧走行，所以插线时会很自然的进入翼腭A，需反复拔插几次，碰巧后才能进入颅内，非常痛苦。最初我干脆将翼腭A也分离，然后夹闭或结扎翼腭A的起始部，结果是手术很难操作，效果也不理想。后来又改用另一方法，即在栓线将要插入翼腭A前，用镊子将ICA轻轻往头侧推一下，使ICA和其延长的分支成一直线，同时顺势插线，可很容易的进入颅内。随着经验值的增加，发现完全可以通过改进栓线形状达到目的，即使栓线有一定程度的弯曲，插线时只要保证栓线向操作者方向弯曲，闭着眼睛也能将线插如颅内，决不会进入翼腭A。如各位试用后感觉不错，请给与鼓励，最后我会告诉大家如何在10分钟内完成模型。
如何提高脑缺血的成功率！
经常有朋友向我诉苦，费九牛二虎之力，做了几个大鼠MCAO模型，第二天一看，个个活蹦乱跳，毫无脑缺血症状，当场晕。主要原因是栓线插入深度不够，即栓线的前端未进入大脑前动脉（ACA），拴线的粗细倒是次要的，0.20-0.26mm均可。因此，保证栓线进入ACA 并阻断对侧来的血流，而又不刺破血管是重中之重。
秘诀1：许多文献报道插入深度为18.5+-0.5mm（270g左右大鼠），如果按这一标准去做，而不考虑大鼠的个体差异，后果是缺血的程度参差不齐，很多大鼠会出现症状较轻，甚至无症状。我的建议是当插线近18mm（做上标记）时，注意手的感觉，轻缓推进，直至感觉到阻力为止（当遇到阻力后，再插线会见到线弯曲）。可能有人会说，把血管插破了也未感觉到阻力或线遇阻后的弯曲。一个原因是线太硬，另一主要原因是当栓线从血管切口插入后为防止血液从此处流出，需要结扎一条细线，这条线结扎的松紧程度很关键，应在不流血的情况下尽可能的松，这样你会发现进线时很轻松，一旦遇到阻力，就会感觉到。后者至关重要，请体会。
秘诀2：栓线一旦进入ACA，就要把上面提到的那根细线适度扎紧（“适度”很重要，会影响到再灌流时大鼠的生死存亡），此时的关键是动作轻柔，不要使ICA有任何的牵拉，否则栓线会脱出ACA，可能会造成缺血失败。血管外的栓线不要留得过长，更不要缝在皮外，大鼠醒来后会自己拔出。
第二部分线拴模型制作过程
（雨后天晴 战友）
1、实验器材（从左到右）：
第一行：干棉球、酒精棉球、10％水合氯醛＋注射器、碘伏＋棉签
第二行：三种不同粗细的鱼线（鱼线最好在2.0、2.5mm 处各用记号笔作好标记，便于观察进入距离）、弯盘内为手术器材
第三行：记号笔、自制拉钩（皮筋+曲别针＋大头针）
2 麻醉：
可用饮料瓶自制捕鼠器（适用于不敢手抓大鼠的），用于打麻药，根据大鼠的重量选择不同粗细的饮料瓶（太粗了大鼠可在瓶中回头）。
效果图
3 麻倒后绑在手术台上（皮筋是最好的选择）
4剪去颈前的鼠毛，碘氟消毒。
5切开皮肤（切开皮肤前最好将结扎动脉的线事先剪好）
6钝性分离皮下组织（大鼠腹侧可见事先剪好的结扎线）
7分离到气管前肌后，沿右侧胸锁乳突肌腱向下分离，见到颈动脉鞘后可上拉钩。
8分离动脉鞘
9分离出颈总、颈外、颈内动脉，结扎颈总、颈外动脉，注意中间那根线不要系紧，用来插鱼线时防止出血的。
10夹闭颈内动脉，用眼科剪将动脉剪一小口。
11插入鱼线，进入颈内动脉后按图中注释方法插（成功率在90％以上）。
说明：
（1）这一步鱼线选择是关键，根据大鼠重量（作的多了后根据动脉粗细就
可选择了）选鱼线。我们的经验是：250g 以下的选0.26mm 的线，250-300g 的 选0.26mm 蘸腊的或0.28 的都可以。
（2）如果遇到鱼线怎么也查不进去的情况，可让大鼠休息一会，换细点的
鱼线再试，这种情况不一定都是进到翼腭动脉了，我曾解剖过4 例这种情况的大 鼠，有三例都是在如颅的地方卡住了，可惜我们手里没有0.24mm 的鱼线。 （3）通过实践，我们认为结扎或夹闭翼腭动脉没有必要，按我们的方法，
熟练的话，从切开到缝合完毕也就是15 分钟，算上准备工作（如麻醉、消毒等） 半小时也可以搞定了，这样一上午两人作10 只大鼠不成问题。
（4）我们体会最好用蘸腊的鱼线作模型，好处是进线深度控制的好，不容
易出现蛛网膜下腔出血。我们曾试过0.26mm 的鱼线（不带腊）在250g 以下的
大鼠进入深度足有2.5cm。
12成功后结扎中间那根线，可见第一个标记距动脉分叉约2mm。
13 缝合
14缝好后用酒精棉球消毒皮肤缝合处
15缝好后的效果如图，外面的鱼线最后用记号笔涂黑，便于拔线时观察
16将大鼠放回笼内
17 2小时再灌（老鼠未醒最好，如果挣扎，最好用乙醚麻醉后再拔线，而且不要把线全拔出，以免出血）
18 醒后看效果，左爪不能伸展（完全醒后可见绕圈或追尾、倾倒），我们的体会，症状2-3分的死亡率高，1-2分的死亡率低，有的大鼠第二天或几天后可无明显症状，但取脑后还是有梗死灶的。
附：一般文献上的MCAO 制作方法＋评分标准
局灶性脑缺血再灌注模型的制备根据longa 提出的可逆性大脑中动脉闭塞(MCAo)线栓法并根据大鼠脑解剖结构图加以改进制作局灶性脑缺血再灌注模型,
以10%水合氯醛0.3ml/kg 腹腔麻醉,颈正中切口,暴露颈总动脉(CCA)、颈外动脉
(ECA)及翼腭动脉,将0.26mm 单丝尼龙鱼线头端0.5cm 用石蜡包被,并于20mm 长处标记,全部大鼠均通过右侧CCA 切口处插入,翼腭动脉短暂夹闭以防误插,栓线
长度自CCA 分叉处约18～20mm,根据动物体重而定,栓塞右侧大脑中动脉,然后
缝合皮肤,栓线尾端部分固定于皮肤上。缺血达到2h 后小心抽出栓线,即形成再灌
注。假手术对照只是不插入尼龙鱼线,其余步骤同手术组。在缺血期间及再灌注
后2h 保持体温在(37±0.5)℃。模型成功的标志为以大鼠手术麻醉清醒后出现左
侧肢体瘫痪,站立不稳,提尾时向一侧转圈为模型成功的判断标准。
神经功能缺失体征评分参考Longa 及Bederson 的5 分制法在动物麻醉清醒后24h 进行评分。0 分:无神经损伤症状;1 分:不能完全伸展对侧前爪;2 分:向对侧转圈;3 分:向对侧倾倒;4 分:不能自发行走,意识丧失。分值越高,说明动物行为
障碍越严重
第三部分灌注取脑
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型(MCAO)制备方法.pdf
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备 前言 相信不少神经内科的研究生都作过或将要作大鼠线栓模型，都有一个从查文献了解方法到跟师兄、师姐学习再到自己体会摸索直至熟练的过程，在模型制作的过程中可能的经历了从模型不成功的郁闷到熟练后成功的喜悦（我们是有这样的感觉）。为了缩短各位将要作或刚开始作MCAO模型的战友的摸索过程，提高模型制作的成功率，我们愿意将自己的经验与大家分享，相信各位战友看过后将对制作大鼠线栓模型有更深的认识，并以其为乐趣，同时欢迎各位熟练的战友与我们交流经验。 第一部分线栓模型制备理论及经验 ⒈ 插线法局灶性脑缺血模型简介 八十年代 Koizumi 和 Longa 创用了不开颅的大鼠 MCA 可逆性脑梗塞模型，此后，应用插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的方法不断改进和完善，已渐趋成熟，目前该法已逐渐取代开颅法而成为最流行的方法。该模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。从 ECA 插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到 大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。 1994 年 Huang 等[55]首次将线栓技术应用于小鼠局部永久性脑缺血模型。1997 年 Hara 等[56]将线栓技术改进后应用于小鼠局部暂时性脑缺血模型。此后不断有学者借助于显微技术和多功能生理监测手段建立小鼠局部线栓脑缺血模型[57,58]。国内蒋晓帆等[59]，王芙蓉等[60] 也对该方法进行了研究。线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元 对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。但线栓造模也并非完美无缺，存在着下列不足：①线栓造模过程是非直视下的手术，血流是否完全阻断不能即刻得知。②动物品系、体重、批次会影响结果。动物饲养条件好的单位所繁育的动物，可以使影响程度降低。③操作者的科研训练影响结果。严格的训练和足够例数的实践可以复制出稳定的结果。④血管破裂出血。操作不小心极易刺破血管或拔线栓时引起出血。轻柔、精细的操作可以减少血管破裂的发生。
影响尿生成的因素和肾缺血再灌注损伤
影响尿生成的因素和肾缺血再灌注损伤第一作者：XXX 学号专业 第二作者：XXX 学号专业 单位：南方医科大学第二临床医学院 地址：广州市广州大道北1838号 [摘要]尿生成包括肾小球的滤过作用、肾小管与集合管的重吸收和分泌作用。影响肾小球滤过的因素包括滤过膜的面积和通透性、有效滤过压、肾小球毛细血管压、血浆胶体渗透压、肾小囊内压、肾血流量（自身调节）。影响肾小管与集合管的重吸收和分泌作用包括小管液中溶质的浓度、肾小球滤过率（管球平衡）、影响肾小管上皮细胞对水对通透性和离子的重吸收作用的体液因子和药物。 [关键词]尿生成肾缺血再灌注 肾是机体主要的排泄器官之一，探究影响肾泌尿功能的因素有助于利尿药等干预肾脏功能药物的研发；肾缺血再灌注损伤是临床上常见的病理过程，在肾脏手术、肾移植和体外震波碎石等过程中，均可发生不同程度的再灌注损伤，它是急性肾衰最常见的原因，因此探究肾的缺血再灌注这一病理现象具有重要意义。肾缺血再灌注时，内生肌酐清除率（Ccr）明显降低，肾功能受损.本实验通过复制肾脏缺血再灌注损伤的模型，对肾脏缺血再灌注损伤后血肌酐和尿肌酐的含量，以及内生肌酐清除率（Ccr）进行测定，来探究肾脏的缺血再灌注损伤。 1材料与实验动物 主要试剂20%乌拉坦，0.2%肝素，生理盐水，20%葡萄糖溶液，蒸馏水，速尿剂，肌酐测定试剂（含试剂一、试剂三、试剂四）。 仪器医用计算机记录系统（PcLab）及计算机，家兔手术台，哺乳动物手术器械，动脉 静脉输尿管插管，压力换能器，三通管，注射器，兔绳，纱布，剪刀，分光光度计，恒温水浴箱，试管，微量加样枪带枪头，称重称。
实验动物家兔一只，体重2.4kg，由南方医科大学提供 实验前准备 家兔称重2.4kg，用20%乌拉坦12.0ml耳缘静脉麻醉，麻醉后将家兔仰卧位固定在兔台上。家兔颈部备皮，沿甲状软骨下正中剪开皮肤，分离右侧颈总静脉并从右侧颈总静脉插入静脉导管。动脉插管用肝素充盈，分离左侧颈总动脉并左侧颈总动脉插管，连接压力换能器用于记录平均动脉压ABP。家兔耻骨下联合备皮后沿前正中线剪开皮肤，找到输尿管并进行输尿管插管并用有刻度的试管收集尿液。 实验方法 研究尿生成过程影响因素：静脉推注37℃，30ml生理盐水，用有刻度的试管收 集尿液并计算注射后每分钟尿量（ml/分钟）；一段时间后静脉输入37℃，10ml 20%葡萄糖溶液，用有刻度的试管收集尿液并计算注射后每分钟尿量。收集的尿液待测尿肌酐含量。 肾缺血再灌注损伤的实验：将家兔换成右侧卧位，游离左肾动脉，用动脉夹夹 闭，并观测平均动脉压和尿量变化，夹闭30min后观测平均动脉压和尿量变化。松开动脉夹，再灌注，同时静脉输入49ml 生理盐水加1ml速尿，再灌注30min后取尿测定尿肌酐浓度，记录平均动脉压和尿量变化。收集尿液待测尿肌酐含量。 尿肌酐测定方法： 取样：取尿液10μl与2ml蒸馏水按1：200比例稀释。 加样如下： 尿肌酐测定加Array 样量表
心肌缺血再灌注损伤介绍和实验设计
心肌缺血再灌注损伤介绍和实验设计 Ⅰ.心肌缺血再灌注损伤： 它是指缺血心肌组织恢复血流灌注时，导致再灌注区心肌细胞及局部血管网显著的病理生理变化，这些变化共同作用可促使进一步的组织损伤。那这里的关键词就是缺血心肌组织。那为什么会产生缺血的心肌组织呢？这就与临床上的疾病有关了。一些心脏疾病，比如急性心肌梗死、冠心病等他们会使心脏发生缺血的症状，其基本的生理过程就是心肌缺血。 Ⅱ.心肌缺血的危害： 心肌缺血：指单位时间内的冠脉血流量减少，供给组织的氧量也减少，缺血必定存在缺氧表明缺血缺氧。心肌缺血比单纯性心肌缺氧无血流障碍要严重，因为前者除了缺氧的影响之外，缺血组织也不能获得足够的营养物质又不能及时清除各种代谢产物带来的有害影响。 一、心肌缺血的原因主要分为两种情况：1是冠脉血流量的绝对不足。这种情况是由自身疾病产生的，主要包括冠状动脉阻塞，冠状动脉痉挛。2是冠脉血流量的相对不足：包括供氧降低或耗氧增加，比如高原高空或通风不良的矿井吸入氧减少；肺通气或换气功能障碍，可致血氧含量降低红细胞数量和血红蛋白含量减少等。 二、缺血对心肌的危害主要包括以下几个方面：1是心肌收缩能力降低。2是导致心肌舒张功能降低。3是心肌组织的血流动力学发生改变，比如说血流的阻力增加等。4是心肌电生理的变化，比如说静息点位降低，传导速度减慢；室颤阈降低等。5是导致心肌形态学的改变。当然还有其他的危害，在这里就不一一列举了。 由于心肌缺血存在这么多的危害，临床上针对这一疾病采取了再灌注治疗方法，但随之而来的又是另外一个临床问题：缺血再灌注损伤。 下面具体介绍一下心肌缺血再灌注损伤。心肌缺血再灌注损伤英文缩写为MIRI，最早由詹宁斯等于1960年提出，发现其临床表现为再灌注心律失常、心肌顿抑、心肌能量代谢障碍等现象。随后又有学者在临床手术中也证实了这一观点，发现在冠脉搭桥术完成后，心肌坏死进一步加重的现象。接着布朗沃尔德教
机能实验 肾缺血再灌注
影响尿生成的因素和肾缺血再灌注损伤 （南方医科大学广州51０515） 【摘要】目的探究影响肾泌尿功能的因素,探究肾缺血后再灌注对肾的损伤现象。方法静脉分别补充3７℃的生理盐水和20%的高渗葡萄糖，观测平均动脉压,尿量;结扎左肾动脉，一段时间后松开动脉夹再灌注，观测平均动脉压,尿量，血肌酐和尿肌酐含量，计算内生肌酐清除率(Ｃｃr)。结果补充37℃的生理盐水和20％的高渗葡萄糖尿生成量增加,缺血再灌注后血肌酐浓度增高，尿肌酐浓度降低,内生肌酐清除率(Cｃｒ）明显降低。结论增加血容量,肾滤过血液增多,尿生成增加;注射高渗溶液增加肾小管内原尿浓度,尿生成量增加;缺血再灌注后肾排泄能力降低,肾的功能受损。 【关键词】尿生成；肾缺血再灌注损伤；尿肌酐；内生肌酐清除率 肾是机体主要的排泄器官之一,探究影响肾泌尿功能的因素有助于利尿药等干预肾脏功能药物的研发；肾缺血再灌注（Ｉscheｍｉc reｐeｒfｕsion,I/R)损伤是临床上常见的病理过程,在肾脏手术、肾移植和体外震波碎石等过程中，均可发生不同程度的再灌注损伤，它是急性肾衰最常见的原因,因此探究肾的缺血再灌注这一病理现象具有重要意义。肾缺血再灌注时,内生肌酐清除率（Ｃcｒ）明显降低,肾功能受损.本实验通过复制肾脏缺血再灌注损伤的模型，对肾脏缺血再灌注损伤后血肌酐和尿肌酐的含量,以及内生肌酐清除率(Cｃr)进行测定,来探究肾脏的缺血再灌注损伤。 1材料与方法 1．1实验材料 动物:家兔 器材:医用计算机记录系统,家兔手术台，哺乳动物手术器械，压力换能器,动脉静脉插管，三通管,注射器，兔绳，分光光度计，恒温水浴箱。 药品与试剂：20%乌拉坦，0.２%肝素,生理盐水，2０%葡萄糖溶液，速尿,肌酐测定试剂。 1．２探究影响尿生成的因素的方法[１] 家兔称重后用20%乌拉坦耳缘静脉麻醉，麻醉后将家兔仰卧位固定在兔台上。家兔颈部剪毛,沿甲状软骨下正中剪开皮肤５cm,分离右侧颈总静脉和左侧颈总动脉。从右侧颈总静脉插入静脉导管,左侧颈总动脉插管,连接压力换能器用于记录血压。将家兔换成右侧卧位，在左肋弓下缘两指处做一斜形切口，辨认输尿管并进行输尿管插管,用有刻度的试管收集尿液并计算每分钟尿量,取此时的尿液
脑缺血再灌注损伤机制及治疗进展
脑缺血再灌注损伤机制及治疗进展 西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科710004 薛荣亮 脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury,CIR）。 脑缺血再灌注损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关。急性局灶性脑缺血引起的缺血中心区死亡以细胞坏死为主，目前认识的比较清楚，即脑缺血后5-7分钟内，细胞能量耗竭，K+通道受阻，膜电位降低，神经末梢释放谷氨酸，通过兴奋谷氨酸受体（包括NMDA 、AMPA和KA 受体）致使细胞膜上的Ca2+通道开放，引起Ca2+超载，高Ca2+可激活NOS，使NO和氧自由基的形成增加，引发脂质过氧化，引起膜结构和DNA的损伤；Ca2+还可活化各种酶类，加剧细胞损伤和能量障碍，引发缺血级联反应，结果细胞水肿、细胞膜破裂，细胞内酶和炎性介质释放，引起细胞坏死。 近年来认识到半暗带区域于再灌注数天后出现了迟发性神经元死亡(DND)，DND常出现在缺血再灌注后2-4日，主要发生在海马、纹状体及皮质区域，DND需要数日时间、有新蛋白质合成的、需要消耗能量的、为无水肿的细胞自杀过程，称之为细胞凋亡(PCD)。脑缺血再灌注损伤既包括急性细胞坏死也包括细胞凋亡，对于DND的确切机制目前仍不清楚，尚需进一步深入研究。 现对脑缺血再灌注损伤机制的研究进展及保护措施简述如下：1．基因活化 脑缺血再灌注损伤后可出现大量基因表达，大约有374种基因出现
变化，绝大多数基因与凋亡有关，其中57种基因的蛋白表达是缺血前的 1.7倍，而34种基因的表达量出现下降，均发生在4小时到72小时, 包括蛋白质合成，基因突变，促凋亡基因，抑凋亡基因和损伤反应基因变化等，这些基因的相互作用最终决定了DND的发生。 2．兴奋性氨基酸毒性 兴奋性氨基酸毒性是指EAA受体活化而引起的神经元死亡，是脑缺血性损伤的重要触发物和介导物。EAA可活化胞内信号转导通路，触发缺血后致炎基因表达。CA1区神经细胞分布着大量的EAA受体，而抑制性氨基酸受体分布很小，这就为缺血后的兴奋性毒性提供了基础。另外，CA1区较CA3区对缺血损伤敏感是由于其兴奋性氨基酸受体的类型不同，CA1区以NMDA受体为主，CA3区以KA受体为主，而KA 受体对缺血敏感性较差，可能是造成DND发生的重要原因。 3．自由基及脂质过氧化 脑缺血再灌注期间产生大量自由基。其有害作用可概括为：①作用于多价不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化。②诱导DNA、RNA、多糖和氨基酸等大分子物质交联，交联后的大分子则失去原来的活性或功能降低。③促使多糖分子聚合和降解。自由基可广泛攻击富含不饱和脂肪酸的神经膜与血管，引发脂质过氧化瀑布效应(oxygen burst)，蛋白质变性，多核苷酸链断裂，碱基重新修饰，细胞结构的完整性破坏，膜的通透性、离子转运、膜屏障功能均受到严重影响，从而导致细胞死亡。自由基还能导致EAA释放增加，促使脑缺血后DND发生。 4．热休克蛋白表达紊乱 热休克蛋白是在多种应激原的作用下生成的分子量为7-200KD的
心肌缺血再灌注
大鼠心肌缺血/再灌注损伤 【实验目的】 1.复制大鼠在体与离体心肌缺血/再灌注损伤模型； 2.观察缺血/再灌注过程中心功能的变化 【实验动物】成年Wistar 大鼠（体重200－300g） 【仪器药品】 电子天平，肾形盘，动物呼吸机，BL-420F记录装置，眼科开睑器，微血管钳，组织镊，眼科镊，组织剪，眼科剪，眼科止血钳，止血钳，动脉夹，眼科缝合针，1号及00缝合线。Langedroff灌流装置。 20%乌拉坦，1ml注射器，5ml 注射器，纱布块 实验1 在体模型 【实验步骤】 1.实验采用体重200-300ｇ健康雄性Wistar大鼠，20%乌拉坦腹腔注射麻醉（0.5ml/100g）； 2.颈胸部备皮及手术，分离气管及右侧颈总动脉 3.气管插管连接呼吸机（呼吸肌参数：潮气量9ml，呼吸比=3:2，呼吸频率55~60） 4.经右侧颈总动脉逆行插管至左心室, 再经BL-420F软件输入计算机,（一通道描记心 电，（右上黄、右下黑、左下红）二通道描记心室内压，三通道描记微分）持续监测心脏左心室内压力及心电的变化情况 5. 沿胸骨左侧剪开2，3肋骨，开睑器开胸暴露心脏；寻找冠状动脉左前降支，穿线备 用; 6.采用结扎5min后再放开5min两次,造成缺血预处置；采用结扎30mim再放开30min 复制缺血/再灌注模型； 思考题： 1.如何判定缺血模型复制成功 2.如何判定有再灌注损伤发生
实验2 离体模型 【实验步骤】 (1) 大鼠称重，腹腔注射20%乌拉坦（0.5ml/100g）麻醉，仰卧固定于鼠板，上腹部及前胸部剪毛。 (2) 舌下/阴茎背静脉注入1%肝素（0.05ml/100g）后，切开胸腹部皮肤，用剪刀横行剪开腹腔，向上剪断隔膜，沿两侧肋骨向上平行剪开，翻起前胸壁，把心脏及胸膈周围的结缔组织拨到一侧，充分暴露心脏。 (3) 用镊子提起心脏根部，暴露出主动脉和肺动脉，在距主动脉起始部0.5cm处用手术剪切断血管，迅速取出心脏至于4℃生理盐水平皿中使之停搏。 (4) 经主动脉将心脏悬挂在灌流装置上，用丝线结扎固定，打开灌流液行逆向灌流，待心脏恢复自主跳动，小心减去心脏周围附着组织。 (5)用眼科剪剪去左心耳，通过左心耳经房室瓣插入左心室一乳胶球囊，球囊连接一个内充生理盐水的导管，导管经三通管和换能器与BL-420F连接。 (6) 在BL-420F仪的监测下，通过向球囊内注入一定量的生理盐水是左心室的舒张末压调整在0~10mmHg之间。 (7)连接心电导线，心尖、右心耳和地线，一通道设置记录， (8) 预灌流10~20分钟，观察心率，二通道记录心室内压、三通道取微分记录±dp/dtmax 等心动指标，同时描记ECG，待上述各指标平衡后开始以下实验。 心肌缺血-再灌注损伤 (1) 心脏用正常灌流液预灌流15分钟后完全停灌40分钟，然后恢复灌流20分钟，观察心脏在正常，停灌初期和再灌期的心功能变化。 (2) 分别收集正常灌流时，再灌流后3分钟时的心脏冠脉流出液1ml，测定其中乳酸脱氢酶的活性。 思考题： 1.如何判定缺血模型复制成功 2.如何判定有再灌注损伤发生
小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型
小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型 缺血再灌注损伤(IRI)是器官移植、休克、动脉搭桥术后等普遍存在的问题。肾脏是发生IRI极为常见的器官之一，尤其肾移植，不可避免的要经历一定程度的IRI,肾脏缺血再灌损伤是急性肾衰的常见原因。对麻醉动物的肾动脉进行阻断和再通后，可引起肾脏缺血再灌注损伤。在缺血再灌注过程中，钙超载、线粒体能量合成障碍、氧自由基的增多等因素导致肾小管内皮细胞脱落，肾脏组织结构的破坏进而使肾脏功能发生障碍。 1.实验动物 SPF级Balb/C小鼠，雄性，周龄为4w~6w，体重为20g~22g。 2.实验分组： 实验分组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组，每组15只动物。 3.模型周期 24h、72h 4.建模方法 1. 选取20-22g左右小鼠，术前禁食12h，自由饮水。 2. 3％戊巴比妥钠(80mg／kg)腹腔注射麻醉,小鼠背部去毛，消毒备皮。 3. 在背部脊椎旁0.5cm、肋骨下缘0.5cm处剪开皮肤及肌肉，可见到肾脏,小心分离出两侧肾脏的肾动脉，迅速用动脉夹夹闭两侧肾动脉。 4. 缺血45min后松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况。 5. 分两层缝合开口,待小鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，定期观察小鼠状态及死亡情况并做好记录。 6. 对照组不做缺血处理，其他操作相同。 7. 分别取再灌注0h、3h、6h、12h、24h、72h六个时间点取材。麻醉小鼠，摘眼球取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。同时取左肾组织留作病理标本，右肾组织分生标本。 5.模型的评价 1 血清生化指标检测： 取各时间点（0h、1h、3h、6h、12h、24h、72h)血清，检测血清BUN（尿素氮）和Scr（血肌酐）水平,评估肾功能。
Removed_大鼠急性心肌缺血模型制备详细图解
模型的背景，心肌缺血模型分全心缺血和左心室缺血两种，全心缺血主要靠注射药物（如异丙肾上腺素等），左心室缺血主要靠手术对动物的冠状动脉左降支进行紧扎实现。由于左心室缺血对临床的意义更大，所以研究心肌缺血药物时这个模型是必须的。 （1）术前12小时给动物禁食 （2）将动物注射10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉后固定在手术台上 （3）用笔型静脉置留针进行气管插管，插好后可用手术刀柄靠近气管，如果见气雾，就证明成功，连接动物呼吸机，参数为：呼吸频率85；呼吸比1：1；潮气量为18ml （4）胸部被毛、酒精棉消毒，在胸部左侧3~4肋间剪开皮肤，如图1 （5）分离肌肉露出肋骨，切口位置有两块肌肉，胸浅肌和胸深肌，注意按照肌肉的纹路分离可以避免将肌肉扯烂，如图2
（6）在第三根肋骨下用止血钳将肌肉分离开，然后左手用止血钳挑住肋骨，右手持剪刀剪开第三根肋骨，如图3
（7）用止血钳将剪断的肋骨夹住掰开，放入开睑器，用止血钳剥离心包膜，如图4
（8）用止血钳将胸腺（心脏上面白的像脂肪一样的东西）夹住拉出，如图5 （9）在左心耳与肺动脉圆锥间穿6~0号线，拉紧丝线，形成心肌缺血，观察线扎紧的部位上下大约2mm范围的心肌是发白色的，如图6
（10）闭合胸腔，注意将胸腔内的空气挤出（这点非常关键，这个模型最容易失败导致大鼠死亡的就是这个地方），对肌肉和皮进行缝合，挤空气的手法如图7
（11）结扎术后6小时可进行TTC染色：将大鼠脱颈处死，打开胸腔，将心脏剪下，用生理盐水将心脏清洗干净并排出心脏内的淤血，沿冠状沟将心房切除留下心室，用刀片将心脏切成1mm厚的切片，放入0.1%的TTC磷酸盐缓冲液（pH 7.4）37℃水浴7~10分钟，取出切片用生理盐水冲洗数次，观察结果。非梗死区因脱氢酶还原TTC而呈红色，梗死区因脱氢酶流失而呈白色，将梗死区和非梗死区分离并分别称重，梗死范围以梗死心肌占缺血心肌重量的百分比表示。下图是染色的结果，图8 结扎位置，梗死的地方其实肉眼大致能看出，和其他地方相比发白，图9：
肾缺血再灌注损伤大鼠模型具体步骤及说明
肾缺血再灌注损伤大鼠模型具体步骤及说明 ?原型物种人 ?来源缺血再灌注，双侧肾动脉夹闭法 ?模式动物品系SD大鼠，SPF级，雄性，体重220g~250g ?实验分组随机分组：对照组，模型组，阳性药物组，受试药物组，15只每组 ?实验周期24h or 72h ?建模方法1. 选取250g左右大鼠，术前禁食12h，自由饮水。 2. 15％水合氯醛(350mg／kg)腹腔注射麻醉,大鼠背部去毛，消毒备 皮。 3. 在背部脊椎旁1cm、肋骨下缘1cm处剪开皮肤及肌肉，可见到肾脏, 小心分离出两侧肾脏的肾动脉，迅速用动脉夹夹闭两侧肾动脉。 4. 缺血60min后松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况。 5. 分两层缝合开口，待大鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲 养，定期观察大鼠状态及死亡情况并做好记录。 6. 对照组不做缺血处理，其他操作相同。 7. 分别取再灌注0h、3h、6h、12h、24h、72h六个时间点取材。麻 醉大鼠，下腔静脉取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。同时取左肾组织留作病理标本，右肾组织分生标本。 ?应用疾病模型
1. 血清生化指标检测： 取各时间点（0h、1h、3h、6h、12h、24h、72h)血清，检测血清BUN（尿素氮）和Scr（血肌酐）水平,评估肾功能。 2. 肾系数检测 摘取双侧肾脏后，生理盐水冲洗，称重计算肾系数。 肾系数=双侧肾重（mg）/体重（g） 3. 肾小管坏死的评分 每张切片×200 倍镜下取外髓质部10 个视野，按0 = 正常，1 = 轻微损伤(受损肾小管< 5%) ，2= 轻度损伤(受损肾小管5 %～25 %) ，3 = 中度损伤(受损肾小管25 %～75 %) ，4 = 重度损伤(受损肾小管> 75 %) 作半定量分析并计算其均值，作为肾小管坏死的评分指数 4％多聚甲醛溶液固定48h。常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋。石蜡切片进行HE染色和PAS染色。 对照组大鼠肾小球、肾小管及肾间质结构基本正常。在模型组，随着再灌注时间的延长呈现不同程度的肾脏病理改变，可见肾小管上皮细胞浑浊肿胀，出现水样或空泡变性，刷状缘消失，部分肾小管上皮细胞凝固性坏死、脱落，腔内可见管型，并可见间质水肿，间质内灶性炎症细胞浸润，肾小球病变不明显。
大鼠脑缺血模型及缺血再灌注模型.docx
大鼠全脑缺血模型制备方法评价 二血管阻断法阻断双侧颈总动脉（ common该法手术简便易于操作，成功 carotid artery ， CCA ）率高。 加动脉放血造成低血压而形缺点：仅形成不完全脑缺血， 成前脑缺血。若单纯结扎造成的低血压严重干扰其 双侧 CCA 而不降低血压，则他器官的血供及实验结果；不 难以使脑血流量（ cerebral能在动物清醒状态下进 blood flow ， CBF ）降低至缺行，无法进行神经行为学的观 血和能量代谢紊乱的程度。察。因此，该模型对探讨 缺血性脑损伤的发病机制、评 价抗脑缺血药物的疗效 更有价值。 颅内加压法小脑延池内注入人工脑脊液， 使颅内压升高超过 动脉血压 2.7~9.3 kPa （ 1 kPa ≈0.133 mmHg ），同时给予 神经节阻滞剂三甲噻方，防止 颅内高压反射性引起高 血压。 颈部加压法麻醉动物，颈部套一止血带， 加压至 80~93 kPa，减 少脑血流量，造成脑缺血。 断头法断头造成全脑不可逆缺血，取 下脑组织冰冻贮存， 常用于生化和代谢分析。 低氧法结扎单侧 CCA 合并全脑缺 氧， PaO2 维持在 2.8 kPa。 由于脑部不是真正的缺血，采 用这一模型得到的结论 不适用于脑缺血，但可比较缺 氧与脑血流量减少引起 效应的不同。 胸内血管夹闭法开胸，夹闭左侧 CCA 、头臂 干、左侧锁骨下动脉，造 成全脑缺血。
大鼠局灶性脑缺血模型制备方法 栓塞法颈动脉注射血凝块栓复制栓 塞性脑卒中模型的 方法过去只用在中型体积动 物，现已在大鼠中应用。 Kudo 等［ 12］采用 <100 μ m 的同源血凝块栓悬液，注 入 CCA ，在颈外动脉（external carotid artery ， ECA ）的颈内 动脉（ internal carotid artery ， ICA ）开口处置一可逆性插 管，栓子则由 ICA 进入 MCA ， 导致同侧大脑皮层、海马、 深层灰质结构的梗塞。也有人 用碳素颗粒、花生四烯酸 钠作为栓塞剂制成脑梗塞模 型。评价 适于血栓形成过程的研究和 溶栓治疗 的观察，尤其是用人血凝块 栓塞法更具有应有价值。缺 点：①由于栓子的随机性，无法预测梗塞部位及大小；②侧支循环的影响使组织缺 血程度不一，不利于组织 定量分析。 开颅法Tamura 等［ 13］采用颞下部开颅法闭塞 MCA ，实验条件 开颅，分离近端 MCA ，电较恒定， 凝或用手术丝线结扎 MCA ，缺血效果可靠，是迄今应用最 造成脑梗塞，是目前公认广泛的经典性局灶脑缺 的标准 MCA 闭塞模型，以大血模型。缺点：需要开颅，创 脑皮层、尾状核缺血最明伤性大，闭塞血管后无法 显。进一步改进此方法，可通进行再灌性损伤研究。 过降低动脉血压以减少 伴行血管远近端分支对梗塞 区的血供，增大梗塞面积。其 中，Kader 改进电凝方法，闭 塞 MCA 所有可见分支， 梗塞效果好； Chen［ 14］等 采取鼻缝旁入路，制作了远端 MCA 合并同侧 CCA 永久性 闭塞，对侧 CCA 暂时性闭 塞模型。 光化学法曾报道， Watson 等首次建立此法适于研究抗血小板、抗血 了光化学法诱导脑皮栓形成 层梗塞的动物模型。立体定位药物和血管内皮细胞保护剂 仪固定大鼠头部，暴露颅的疗效；此种模型无须开 骨，尾静脉注射光敏材料荧光颅，动物存活时间长，适于慢 素，用 560 nm 波长的特性脑缺血研究；皮层梗塞 定光源照射局部头颅，光线透部位可任意选择，为皮层功能 过颅骨与血管内的染料定位研究提供了条件。缺 接触，激发光化学反应，引起点：与人类常见的脑栓塞存在
最新1建立全脑缺血再灌注动物模型的实验研究进展汇总
1建立全脑缺血再灌注动物模型的实验研 究进展
医学院检验系，广东广州510182;2.广州医学院第一附属医院，广东广州510120) 【关键词】全脑缺血再灌注动物模型实验研究进展 心脏骤停(CA)是急诊医学常见的急症之一，因其居高不下的致死率及致残率给社会和家庭造成严重威胁，所以心肺脑复苏是现代医学研究的热点课题。心搏骤停是指心跳及呼吸突然停止，血液循环终止。由于脑细胞对缺氧十分敏感，循环停止4～6 min脑组织即可出现不可逆性损害[1]。面对突如其来的心脏骤停，目前最有效的治疗方法是心肺复苏。但是即使复苏后，心脏恢复了搏动，但脑功能的恢复是心肺复苏成功的关键。一般心脏停止搏动，脑缺血、缺氧立即发生，如超过4～6 min就可以出现不可逆的大脑损害。心脏停搏时间长，如>8 min以上，大脑功能很难恢复，成功率极小。有学者研究认为，心脏停搏后，约50%左右患者死于中枢神经系统损害，即脑死亡。即使心、肺复苏成功，生命保留，仍约有20%～50%左右存在着不同程度的脑功能障碍，成为植物状态(植物人)或痴残等[2]。 在成功进行心肺复苏后有20%～40%的患者遗留下永久性神经损害[3]。鉴于脑保护和脑复苏的重要性，近年来对缺血性脑损伤的机制进行了大量的研究，脑是一个血流量大、代谢旺盛的器官，其功能几乎全靠葡萄糖的氧化代谢。心脏骤停后引起的脑损害的病理生理主要是缺血缺氧性脑损伤以及自主循环恢复后的大脑缺血再灌注损伤，其中涉及兴奋性氨基酸的神经毒性、钙离子稳态失调、神经元凋亡等机制[4]。所以心肺复苏的最终目的是脑复苏。 大量研究旨在寻找可减轻或预防脑缺血再灌注损伤的方法或药物，并且已经在动物模型上获得一定成功，但是这些方法和药物很少能成功用于临床。缺血预处理对心脏和神经系统缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，但是在临床实践中预处理只适用于缺血再灌注可预期的情况。尽快恢复灌注是减轻缺血导致的损伤和行为障碍的最有效方法，然而再灌注也可能加重损伤。在再灌注早期，大量活性氧自由基的产生和钙超载导致了缺血再灌注损伤。所以近年来围绕心肺脑复苏的保护机制及其方法成为专家学者们研究的热门，而建立有效、稳定的全脑缺血再灌注模型是实验研究的基础。 针对建立全脑缺血再灌注模型的实验方法有多种，包括：二血管阻断加低血压法、四血管阻断法、三血管阻断法、颈动脉负压分流法。国内文献报道用四血管阻断法比较多[5]，国外四血管阻断法、二血管阻断加低血压法均有应用及报道，但更偏向于后者[6]。对比不同建模方法在实验过程中所显露出的特性，分析并总结各自的优缺点。选择能较好地建立大鼠全脑缺血再灌注模型的方法，为脑复苏的深入研究提供良好的实验基础。本文将从实验的可操作性、成功率、发展前景等方面对各类建模方法进行综述。 1制作全脑缺血再灌注动物模型及效果的判定 1.1全脑缺血再灌注模型模拟心搏骤停
大鼠心缺血再灌注实验设计
题目：不同药物对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用 目的：观察抑制氧自由基生成药物（5-甲酰尿嘧啶）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 观察钙离子拮抗剂（硝苯地平）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 观察抗脂质过氧化制剂（维生素C或维生素E）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 原理：多数情况下，缺血后再灌注可使组织器官功能得到恢复，损伤的结构得到修复，患者病情好转康复；但有时缺血后再灌注．不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤。 心缺血再灌注损伤是指心肌缺血后再灌注期间导致的心机细胞损害，其损害程度较心肌缺血本身严重，常表现为心肌细胞收缩功能减弱和心室顺应性改变，出现心律失常，心功能低下等现象。 心肌缺血再灌注损伤与氧自由基产生增多、钙超载、及白细胞的作用有关。 抑制氧自由基生成药（黄嘌呤氧化酶抑制剂——5-甲酰尿嘧啶）具有抑制氧自由基生 成的作用，减少氧自由基生成。钙离子拮抗剂（硝苯地平）可以阻断钙的慢通道，使细胞外钙的内流减少，从而降低胞浆钙离子，可起到减少MIRI的作用。抗脂质过氧化制剂（维生素C或维生素E）可以阻断脂质过氧化可1）抗白细胞粘附;（2）保护内皮功能;（3）抗血小板粘附、聚集及脱颗粒反应。有研究证实外源性维生素E可增加心肌梗死后大鼠血浆、心脏的维生素E含量，改善心功能，并减少大鼠的再灌注心律失常。 实验对象：大鼠4只，120-200g，体格健康雌雄不限。 器材和药品：手术刀，动脉夹4个，棉线，剪子，镊子2把，玻璃分针2个，注射器及针头2个，动脉插管器械，BL-420生物机能实验系统 药品：20%氨基甲酸乙酯0.5ml/g，5-甲酰尿嘧啶注射液，硝苯地平注射液，维生素C或维生素E注射液，肝素。 方法步骤：1、大鼠心再灌注损伤再灌注模型的制备 （1）取大鼠，称重，用20%氨基甲酸乙酯0.5ml/g腹腔注射麻醉，仰卧位固定。 （2）1%肝素0.2ml/100g从尾静脉注射。 （3）前胸，上腹部剪毛，沿肋缘下剪开腹前壁皮肤皮下筋膜，肌肉，纵向剪开胸前壁和横向剪开胸前壁暴露心脏。 （4）经主动脉插管 （5）找到左冠状动脉用动脉夹夹闭1分钟。打开动脉夹，血液重新供应，用BL-420实验技能系统记录，观察心律心室内压等的改变。
大鼠脑缺血模型研究进展
文章编号:1001-6910(2002)05-0060-03?中医药研究进展? 大鼠脑缺血模型研究进展 王 军综述,陈国华审校 (河南省中医药研究院,河南郑州450004) 摘 要:脑缺血实验动物是研究缺血性脑血管病不可缺少的工具,大鼠为最常见的实验动物。文章就常用大鼠脑缺血动物模型制作方法、影响因素及优缺点作一综述。 关键词:脑缺血 动物模型,动物大鼠 综述 中图分类号:R25512 文献标识码:A 由于临床研究的种种限制,脑缺血动物模型已成为研究脑血管病损伤机理和防治措施不可缺少的工具。多数学者更倾向于选用大鼠复制脑缺血模型,主要由于:①大鼠脑血管解剖特点比较接近人类;②有关大鼠生理、生化、形态及药理等方面的实验资料比较丰富,有利于进行研究和比较;②价格低廉,可进行较大量重复实验;④纯种鼠属近亲交配,品种相对一致,脑血管解剖和生理机能变异较小;⑤大脑体积小,有利于进行固定染色及病理组织学观察[1]。 1 全脑缺血模型 1.1 二血管阻断缺血模型 阻断双侧颈总动脉(CC A)加动脉放血造成低血压而形成前脑缺血。单纯结扎双侧CC A而不降低血压,则不足以使脑血流量(C BF)降低至缺血和能量代谢紊乱的程度。该模型是20世纪70年代由Ekolof和N ordstrom建立并用以研究不完全性脑缺血对能量代射的影响[2,3]。优点:手术简单,失败率低。缺点:仅形成不完全性脑缺血,由于全身低血压严重干扰其它脏器的血供及实验结果。模型不能在清醒动物进行,无法进行神经行为的观察。 1.2 四动脉阻断全脑缺血模型 即双侧CC A和双侧椎动脉阻断,由Pulsinelli于1979年建立[4]。首先在麻醉状态下,经颈腹侧切口,在双CC A放入套扣并外置备用,经背正中切口在第一颈椎翼状孔下电凝双侧椎动脉。24小时后,清醒状态下经外置套扣关闭双侧CC A而形成全脑缺血,并可在一定时间放开而实现再灌流。优点:可同时在动物麻醉和清醒两种状态下进行,并能进行再灌注实验。缺点:操作复杂,且由于椎动脉与脊管前动脉间的交通支存在,个体差异较大,模型不稳定而需筛选。 1.3 三动脉阻断全脑缺血模型[5] 经麻醉动物颈正中切口,分离双侧CC A备用,剪去枕骨腹侧面部分颅骨,用5-0丝线结扎延髓腹侧面上的基底动脉,通过双侧CC A的关闭和开放实现全脑缺血再灌流。模型的成功与否可通过脑电图翻正反射进行验证。由于此模型成功率高,缺血指标的观察明确简单,可根据实验的需要,通过阻断CC A时间的长短控制脑缺血的程度等优点,已广泛用于脑缺血的药物及方法的研究。被认为是至今为止最理想的全脑缺血再灌流的动物模型。 2 局灶性脑缺血模型 由于大脑中动脉(MC A)是人群脑卒中的多发部位,因此,阻断MC A所造成的脑缺血模型被认为是一种理想的动物模型。 2.1 栓塞法 将无菌干燥研碎筛滤的血凝块[6]、碳素颗粒、塑料颗粒、花生四烯酸盐[7]及免脑粉[8]等作为栓塞剂,由颈外动脉(EC A)注入栓子后结扎EC A,开放CC A,栓子由颈内动脉(IC A)进入MC A,造成以MC A供血区脑组织损伤为主的缺血模型。但由于栓子的随机性,无法预测栓塞部位与大小,脑组织缺血不一,不利于神经症状和脑组织定量分析,且与人类卒中差异较大,使其应用受到限制。 2.2 栓线法 1985年K oizumi首次报道栓线法可逆性MC A闭塞动物模型,并在近年来不断得以完善[9,10]。由EC A插人4-0尼龙线进入IC A,阻断MC A起始端而导致局灶性脑缺血(MC AO)。通过提拉插线可造成再灌流损伤模型。优点:无需开颅,是目前唯一能观察再灌流损伤的急、慢性局灶性脑缺血模型。缺点:动物体重要求严格,该模型实质上也是一种栓塞性卒中,与人类常见卒中仍存在着差异。 2.3 光化学法 将大鼠头部固定于立体定位仪上,切开皮肤,暴露颅骨,静脉注射光敏材料虎红酸钠,用特定冷光源(500—600nm)照射切口处颅骨,光线透过颅骨与血管内的光敏物质接触,激发光化学反应而产生单线态氧,直接损伤血管内皮细胞而诱导血栓形成[11]。优点:不开颅,手术创伤小,动物易长时间存活,血栓形成过程与人类近似,适用于抗血小板、抗血栓及内皮细胞保护药物的急慢性动物实验研究。缺点:较早地导致终未动脉及微血管永久性闭塞,不利于扩血管及促进侧支循环作用的研究。 2.4 开颅法 在麻醉大鼠耳眼连线的中点垂直切开皮肤,分离颞肌,剪断颧弓,在颧弓根前方颅骨钻孔,于大脑上、下静脉间用11-0外科无创伤缝合线结扎MC A,造成MC A支配区局灶性脑缺血模型。自T amura等[12]1981年建立以来,一直受到同 ? 6 ?中医研究 2002年10月 第15卷 第5期 TC M Res.October2002V ol.15N o.5 收稿日期:2002-05-24
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型的制备
线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究 马贤德1孙宏伟1 柴纪严1 赵金茹1 （1 辽宁中医药大学，辽宁沈阳 110032；） 摘要①目的建立一种比较系统，操作简单，成功率高的大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注动物模型，达到只要读者根据本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型的目的。 ②方法成年健康雄性 SD大鼠40只，参照Longa法并适当改进建立MCAO模型20只，假手术组20只。本文将详细叙述手术过程以及再灌注时间点的合理选择。最后利用行为学测试、四氮唑(TTC)染色对模型成功与否进行判定。③结论线栓法是一种操作简单的制备MCAO 再灌注动物模型的方法，并且此方法的再灌注效果较为明显。 关键词动物模型；脑缺血；再灌注；线栓法 Establishment a model of rat ischemia-reperfusion injury with intraluminal suture Ma Xian-de1 Sun Hong-wei1 Chai Ji-yan1 Zhao Jin-ru1 (1.Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang, 110032) Abstract: Objective To establish a model of rat ischemia-reperfusion injury, in terms of the model, the operation will be simple, and the achievement ratio will be high. Methods: 40 Male Sprague-Dawley ( SD ) rats were separated into two groups randomly: 20 were model of rat ischemia-reperfusion injury based on Longa method, and the other 20 were sham-operated group. The process of the operation and the selection of different time point following ischemic-reperfusion were discussed in the paper. What’s more , the model was appraised by behavioral test and Triphenyl Tetrazolium Choloride（TTC）Staining. Conclusion: The operation of intraluminal suture method is very simple for the establishment of model of rat ischemia-reperfusion, what’s more, the effect of reperfusion is very obvious. Key words: Animal Model, ischemia, reperfusion, intraluminal suture 脑缺血再灌注动物模型是研究缺血性脑血管病的一条重要途径，因为脑缺血再灌注动物模型具有很好的重复性并能最大程度模拟人类缺血性卒中的发生。早在1986年，日本学者Koizumi发明了线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型。1995年，我国也出现了相关的报道。目前人们比较公认的是Longa等建立的大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注动物模型。国内一些学者对此方法又进行了改进，但仍存在一些问题，例如：手术操作过程复杂，实验动物死亡率较高，而模型成功率较低，并且在所发表的文章中普遍存在一个缺点，就是对该模型的制作过程描述得过于简单，读者往往不能按照此类文献完成模型的制备工作。本文旨在前人研究的基础上，建立一种操作简单，成功率高的 MCAO再灌注模型，并将此方法图文并茂的展现给读者，使读者只要根据本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型。 1 材料与方法 1.1 实验材料、动物及分组健康雄性SD大鼠40只，体重280-320g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。随机分为模型组和假手术组，每组20只。四氮唑红(TTC)染料，由沈阳市博尔美试剂公司提供。 1.2 栓塞线的制备栓塞线采用 2.5号钓鱼线，直径0.25-0.28mm。将其剪成4cm长，一端用细砂纸打磨成半球形（需在显微镜下筛选），再用记号笔分别在距打磨端0.6cm处、1.8cm
心肌缺血再灌注损伤的发病机制.
心肌缺血再灌注损伤的发病机制 摘要21世纪是PCI的时代，PCI的发展与推广降低了ST段(STEMI)及非ST抬高(NSTEMI)性心肌梗死患者死亡率[1,2]、缩小了梗死的面积[3]、改善了左室的收缩功能[1,4]，但是这种不断进步发展的PCI技术却不能显现出该技术当初刚用于临床时的降低心肌梗死患者的死亡率。因为研究人员们发现，某些患者就算开通了梗死的冠状动脉相关血管支配的心肌梗死面积却没有如人所愿的大大降低，心肌梗死的面积在开通冠脉后仍然在进展。因为研究人员发现缺血期的心肌在各种因素的作用下已经发生了损伤，心肌的再灌注有可能加重了缺血期心肌的损伤程度，对细胞或者细胞器造成了新的损伤，我们称之为再灌注损伤(reperfusion injury)。本文主要此种损伤的可能发生机制进行综述。 关键词心肌再灌注损伤心肌缺血心肌梗死炎症自由基线粒体渗透性转换孔 一、心肌再灌注损伤病理生理 心肌再灌注损伤（myocardial reperfusion injury）指的是缺血的心肌组织恢复血运后可能对心肌造成的进一步损伤[2,3]。但是缺血再灌注引起的心肌损伤的确切病理生理机制仍没有研究清楚。其中一个很重要的因素就是目前所建立使用的心肌缺血-再灌注模型本身就是一个问题，因为我们知道心肌的缺血分很多种，其中最常见也是最凶险的一类便是ST段抬高型心肌梗死，现流行的线栓建模法被广泛应用，但心肌梗死的过程却没有线栓法阻断冠脉引起的心肌组织坏死及再灌注损伤如此简单，根据欧美国家的指南[4,5]，将心肌梗死分为五型，从这五种分型可以发现简单的结扎、再通冠脉造成的心肌梗死模型也不过是其中分型的一型，其它四型或者更多的类型心肌在缺血及再灌注时发生的确切变化仍然没有研究清楚的，因为我们至今没有发现哪一种干预措施可以非常有效的缩小心肌梗死后心肌坏死的进展。但是自50多年前，Jennings等[6]第一次从犬的缺血后再灌注的心脏组织中发现
大鼠脑缺血模型
大鼠脑缺血模型 大脑中动脉阻塞 (middle cerebral artery occlusion，MCAO) 是目前最常用的局灶性脑缺血模型,MCAO 模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。从ECA插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。 1.实验动物 SPF级Wistar大鼠，健康，雄性，体重为250g-300g。 2.实验分组 实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 3.主要试剂 2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride（sigma） 4.建模方法 1.15%水合氯醛麻醉大鼠，颈部备皮，消毒，插入肛温探头，保持体温在37±0.5℃。 2.颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，颈内动脉和颈外动脉。使用6-0丝线在距离颈总动脉分叉4mm 处结扎颈外动脉远心端，在颈外动脉穿入另一根6-0丝线，在靠近颈总动脉分叉处打一个活结。 3.使用动脉夹夹闭颈总动脉。在距离颈总动脉分叉处3mm处的颈外动脉上剪一个小口，将一根头端处理过的0.33mm直径的尼龙线从小口中插入，进入颈内动脉，并向内插入大脑中动脉，尼龙线的插入深度距离颈总动脉分叉处约16±1mm。 4.缺血后90min拔掉线栓，用6-0丝线结扎外动脉近心端，用3-0丝线缝合颈部伤口，活力碘消毒伤口，将大鼠放在加热垫上，待清醒后放入恒温抚养箱饲养。 5.术后24h，对小鼠进行神经功能评分，然后腹腔注射15%水合氯醛麻醉大鼠，取大脑进行TTC染色和病理染色 5.模型的评价 1.神经功能缺失体征评分 参考Longa及Bederson的5分制法在动物麻醉清醒后24h进行评分，分值越高,说明动物行为障碍越严重。 0分:无神经损伤症状