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熊果酸脂肪乳注射液的制备及体外评价_宋莉

熊果酸脂肪乳注射液的制备及体外评价_宋莉
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细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤 (一)原理:细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 (二)细胞传代培养具体操作 1、细胞:贴壁细胞株 2、操作步骤 1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25%胰酶溶液,使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞,放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移,原贴壁的细胞逐渐趋于圆形,在还未漂起时将胰酶弃去,加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼,当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液,分到另外两到三瓶中,实践培养液塞好橡皮塞,置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备:细胞室及工作台紫外线照射15min;培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用;收集对数生长期细胞,在冻存前一天最好换液 2.用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液,PBS清洗2遍吸出冲洗液,加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶,加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中,离心(1000r/min,10分钟)。 5. 去上清液,加入与细胞悬液等量的冻存液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16~18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 7.记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒;培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,离心。 3.去上清,加入培养基,吹打,然后移入培养瓶中,用培养基清洗冻存管,清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基,放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期;次日换液。

齐墩果酸和熊果酸保护神经的药理作用综述

齐墩果酸和熊果酸保护神经的药理作用综述 齐墩果酸(oleanolic acid)和熊果酸(ursolicacid)同属五环三萜酸类化合物,它们又是同分异构体,因此药理作用几乎相同。现已证实齐墩果酸和熊果酸都具有抗炎、降糖、调脂、抗肥胖、抗动脉粥样硬化药理作用[1-4],有望成为抗代谢综合征新药。代谢综合征可诱发神经系统方面的并发症,如脑中风、疼痛、糖尿病脑病、痴呆等。我国正在步入老龄社会,尤其是很多大城市已经进入老龄社会,老年性神经精神疾病如老年痴呆、帕金森病等发病率快速增长,而目前又缺乏安全有效、毒副作用低的防治老年性神经精神疾病药物。齐墩果酸和熊果酸除了通过抗代谢综合征阻滞神经系统并发症外,已有大量实验研究发现齐墩果酸和熊果酸具有神经保护作用。本文综述齐墩果酸和熊果酸保护神经细胞、镇痛、抗精神失常、改善学习记忆等神经精神药理方面的研究进展,为齐墩果酸和熊果酸防治老年痴呆、帕金森病和抑郁症的研发提供依据。 1 对离体神经细胞的保护 β 淀粉样肽、过氧化氢、谷氨酸、6-羟基多巴胺等都具有神经毒性作用,能直接损伤神经细胞引起的神经元凋亡和神经功能障碍。齐墩果酸和熊果酸对这些神经毒素引起的离体神经细胞损伤都有保护作用。 1.1 对抗β 淀粉样肽的神经毒性 PC12 细胞源自大鼠髓质嗜铬细胞瘤,为神经源性细胞,具有多巴胺能神经特性,被广泛用作神经细胞体外模型,常被用来筛选神经保护药物。齐墩果酸(20、40、80 mg/L)预处理PC12 细胞,可浓度相关地对抗β 淀粉样肽诱导乳酸脱氢酶渗漏,提高PC12 细胞存活率,降低细胞凋亡率。这种神经保护作用可能与齐墩果酸促进抗凋亡基因bcl-2 表达,抑制促凋亡基因bax 表达有关[5].Hong 等[6]报道熊果酸0.5~125 μmol/L浓度相关的抑制β淀粉样肽诱导PC12 细胞产生活性氧,从而减少DNA 断裂和细胞凋亡。也可通过抑制上游激酶ERK1/2、p38和JNK 磷酸化,阻滞核因子-κB(NF-κB)的p65亚单位核易位,抑制β 淀粉样肽诱导PC12 细胞表达诱生型一氧化氮合酶和环氧化酶-2,阻止神经炎症反应发生[7].Wilkinson 等[8]报道熊果酸阻滞β 淀粉样肽与小神经胶质细胞结合并抑制活性氧生成。用表达人CD36 的中国仓鼠卵巢细胞实验,发现熊果酸浓度相关地阻滞β淀粉样肽与其受体CD36结合,浓度增至20 μmol/L 时作用达到峰值,最大抑制率为64%,认为熊果酸通过阻滞β 淀粉样肽与CD36结合,抑制前炎性细胞因子和神经毒活性氧产生,从而阻断神经变性发生。 1.2 对抗过氧化氢的神经毒性 Yu 等[9]报道熊果酸0.05~2 mg/L通过诱生抗氧化酶过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和抑制脂质过氧化反应,对抗过氧化氢损伤HEI-OC1 听觉细胞。Rong 等[10]报道齐墩果酸1、10 μmol/L 可对抗过氧化氢损伤PC12 细胞,表现为显着降低乳酸脱氢酶活性和丙二醛水平,逆转低下的线粒体膜电位、琥珀酸脱氢酶和超氧化物歧化酶活性、还原型谷胱甘肽水平,从而提高PC12 细胞存活率。Cho 等[11]报道齐墩果酸通过对抗过氧化氢升高细胞内钙离子浓度和活性氧生成,抑制过氧化氢诱导大鼠皮质神经元凋亡。 1.3 对抗谷氨酸、6-羟基多巴胺的神经毒性 当熊果酸在低浓度(5~15 μmol/L)时对抗谷氨酸受体激动剂红藻氨酸诱导大鼠海马神经元自由基形成、线粒体膜电位下降[12].熊果酸在0.5、1mmol/L 高浓度时还显着对抗去极化试剂KCl 升高大鼠大脑皮质神经细胞内钙离子浓度,抑制谷氨酸大量释放,保护神经细胞免受兴奋性神经毒物的伤害[13-14].宋小丹等[15]报道齐墩果酸1、10、100 μmol/L都能对抗谷氨酸诱导大鼠海马神经元钙离子超载性损伤。Ndlovu 等[16]报道低浓度6-羟基多巴胺

熊果酸含量测定方法研究进展

熊果酸含量测定方法研究进展 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 【关键词】熊果酸;含量测定方法 熊果酸(ursolie acid,UA)又名乌索酸、乌苏酸,属于三萜类化合物,广泛存在于熊果、白花蛇舌草、女贞子、乌梅等天然植物和草药中,具有抗炎、护肝、降血脂等多种生物学活性[1~4]。目前许多中药材及其制剂常选用熊果酸的含量作为其质量控制指标。本文对熊果酸含量测定方法的研究进展综述如下。 1 分光光度法 李国章等[5]建立了湘产3种苦丁茶中熊果酸含量测定的分光光度法,具体操作是取苦丁茶经索氏提取器提取后,加入5%香草醛-冰醋酸、高氯酸显色,在波长548 nm处测定吸光度,结果熊果酸在4~20 μg·ml-1浓度范围内线性关系良好,加样回收率为98.96%。罗启剑等[6]采用同样方法测定了连钱草中熊果酸含量,结果熊果酸在0~18 μg·ml-1浓度范围内线性关系良好,加样回收率为100.64%。 2 薄层扫描法

白洁等[7]采用双波长薄层扫描法测定了夏枯草中熊果酸的含量,具体操作为取夏枯草药材粗粉经95%乙醇超声提取两次,滤液用70℃水浴蒸干,残渣用石油醚浸泡两次,挥干溶剂,用95%乙醇溶解后测定。采用硅胶G板,以环己烷-氯仿-醋酸乙酯(20∶5∶8)为展开剂,用10%硫酸乙醇溶液显色,选用λS=540 nm,λR=700 nm进行双波长反射式锯齿扫描,结果熊果酸在0.314~1.570 μg范围内线性关系良好,加样回收率为99.3%。张军等[8]建立了狼疮静颗粒中熊果酸的薄层扫描法测定方法,具体操作为取狼疮静颗粒用乙醚萃取3次,合并乙醚萃取液水浴蒸干乙醚,残留物加无水乙醇-氯仿(3∶2)混合液溶解后测定,以环己烷-氯仿-醋酸乙酯-甲酸(20∶5∶8)为展开剂,用10%的硫酸乙醇液显色,以λS=520 nm,λR=700 nm进行双波长薄层扫描,结果熊果酸在0.498~3.084 μg范围内线性关系良好,加样回收率为97.91%。 3 高效液相色谱法 3.1 HPLC-UV法戚志华等[9]采用HPLC法测定了陕西女贞子中熊果酸的含量,其方法为取女贞子粉末经超声提取后采用HPLC法,选用Lichrospher C18( 4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,流动相为乙腈-甲醇-水-磷酸-三乙胺(50∶30∶20∶0.02∶0.04),流速1 ml·min-1,测定波长为205 nm,结果熊果酸在20.48~102.4 μg范围内线性关系良好,加样回收率为100.6%。梁洁等[10]采用HPLC法测定了广西产美味猕猴桃根中熊果酸的含量,具体操作为取

细胞传代培养

细胞传代培养(胰蛋白酶消化法) 具体操作: 一. 传代前准备: 1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 2.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 3.正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。 4.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。 8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。 二.胰蛋白酶消化; 1.加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。 2. 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。 3.吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。 三.吹打分散细胞: 1.吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 四.分装稀释细胞: 1.分装:将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。 2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 五.继续培养: 用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。 传代细胞培养注意事项: 1.严格的无菌操作 2.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

体外细胞培养

第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点:简化细胞的生长环境,方便施加实验因素,便于观测实验结果,便于获得均一细胞群,能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处:培养对象脱离了机体的整体支配和调控,细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异,分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 (一)、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室:基本条件要求:清洁、无菌、干燥、不通风,并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 (二)、体外培养的设备和器具 设备:1. 超静工作台,生物安全柜,净化室 2. 培养箱:温度,湿度,pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置:去离子水净化装置,石英玻璃蒸馏器, 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置:电热干燥箱,pH计,天平 培养器具:1. 过滤除菌装置:Zeiss 滤器,抽滤式玻璃简易型滤器, 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿:(1)溶液瓶(2)培养瓶(3)培养皿 (4)多孔培养板(5)离心管 3. 移液器 4.筛网:金属筛网(不锈钢网、铜网),尼龙筛网 (三)培养用液 ?水和平衡盐溶液(balanced salt solution, BSS) 水:离子交换水,蒸馏水 平衡盐溶液:主要成分:无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ,Ringer Earle ,D-Hanks,Hanks ?培养液:1.天然培养液:1)血清:小牛血清,胎牛血清(fetal bovine serum, FBS),马血清,2)水解乳蛋白,3)胚胎渗出液 2.合成培养液:合成培养基的种类MEM,RPMI 1640,McCoy 5A,HAM F12等

熊果酸及五环三萜同类物的研究进展

湖南工业大学学报Journal of Hunan University of Technology Vol.23 No.5Sep.2009 第23卷 第5期2009年9月熊果酸及五环三萜同类物的研究进展 李宏杨1,刘国民1,刘 飞2,张凤琴2,李小龙2 (1. 海南大学 农学院,海南海口570228;2. 湖南工业大学包装与材料工程学院,湖南株洲412007) 摘要:五环三萜类化合物种类繁多,广泛分布在植物体中,且大多具有重要的药理活性,临床应用前景 十分诱人。随着研究的不断深入,有关五环三萜结构与活性的研究取得了大量进展,新的同类化合物不断的被发现。就熊果酸及五环三萜同类物结构与分类、在植物中的分布情况和药理作用的研究进展进行了综述。 关键词:熊果酸;五环三萜;抗肿瘤 中图分类号:Q541 文献标志码:A 文章编号:1673-9833(2009)05-0018-04 Research of Ursolic Acid and Similar Pentacyclic Triterpenoid Li Hongyang 1,Liu Guomin 1,Liu Fei 2,Zhang Fengqing 2,Li Xiaolong 2 (1. School of Agriculture ,Hainan University ,Haikou 570228,China ; 2. School of Packaging and Material Engineering ,Hunan University of Technology ,Zhuzhou Hunan 412007,China ) Abstract :Various pentacyclic triterpenoids, widely distributing in plants, have excellent pharmacological activities. The clinical application of such compounds has attracted much attentions. The research of the structure and classification of Ursolic Acid and similar pentacyclic triterpenoids and their distribution and pharmacological functions are summarized. Keywords :ursolic Acid ;pentacyclic triterpenoid ;antitumor 收稿日期:2009-08-17 基金项目:国家科技支撑计划子课题(2007BAD76B05-02)作者简介:李宏杨(1983-),男,河南信阳人,海南大学硕士研究生,主要研究方向为作物种质资源的创新与利用,E-mail :hyang896@https://www.sodocs.net/doc/7d17843109.html, ;刘国民(1955-),男,湖南祁东人,海南大学教授,博士生导师,主要研究方向为作物种质资源的创新与利用,E-mail :kudingcha_no1@https://www.sodocs.net/doc/7d17843109.html, 五环三萜类化合物是一类重要的天然产物,大多以游离形式或者与糖结合成苷的形式广泛存在于自然界中。熊果酸(ursolic acid )又名乌索酸、乌苏酸,属于α-香树脂烷(α-amyrin )型五环三萜类化合物。1990年,日本将熊果酸列为最有希望的癌化学预防药物之一[1]。大量研究表明,熊果酸及五环三萜同类物具有抗肿瘤、抗HIV 、抗糖尿病、抗菌、抗病毒、增强免疫功能和降血脂等多种生物学活性。近年来,国内外学者围绕熊果酸及五环三萜同类物的药理学作用、以及新五环三萜结构的发现做了大量的研究工作,取得了丰硕的成果,这些成果亦展示了五环三萜广泛的应用前景,为五环三萜的综合开发利用提供了可靠的实验依据。 1熊果酸及五环三萜同类物的结构 目前已发现的三萜类化合物多数为四环三萜和五 环三萜。五环三萜类成分在药用植物中较为常见,主要的结构类型有乌苏烷型、齐墩果烷型、羽扇豆烷型和木栓烷型等[2],见图1。 乌苏烷(ursane )型又称α-香树脂烷(α-amyrane )型,如熊果酸、积雪草酸[3]、蔷薇酸[4]、坡模酸[5]、2α-羟基乌苏酸[6];齐墩果烷(oleanane )型又称(β-香树脂烷(β-amyrane )型,如齐墩果酸、甘草酸、甘 草次酸[7]、丝石竹皂苷元[8]、蒲公英萜醇[9]、刺囊酸[10]等;羽扇豆烷(lupane )型如白桦脂醇、白桦脂酸[11]、 与分类

熊果酸抗肿瘤作用机制的研究进展

Studies in Synthetic Chemistry 合成化学研究, 2016, 4(3), 19-27 Published Online September 2016 in Hans. https://www.sodocs.net/doc/7d17843109.html,/journal/ssc https://www.sodocs.net/doc/7d17843109.html,/10.12677/ssc.2016.43003 文章引用: 孟艳秋, 杨丽娜, 潘洪双, 于婷婷, 张伟晨, 宁梓廷. 熊果酸抗肿瘤作用机制的研究进展[J]. 合成化学研究, Research Progress on Antitumor Action Mechanism of Ursolic Acid Yanqiu Meng, Lina Yang, Hongshuang Pan, Tingting Yu, Weichen Zhang, Ziting Ning Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang Liaoning Received: Oct. 1st , 2016; accepted: Oct. 16th , 2016; published: Oct. 21st , 2016 Copyright ? 2016 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.sodocs.net/doc/7d17843109.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Ursolic Acid is a type of pentacyclic triterpene compounds with many kinds of pharmacological ac-tivities, especially its antitumor activity. The antitumor mechanism of ursolic acid is multifaceted. In this paper, the research progress of anti-tumor mechanism of ursolic acid has been reviewed and forecasted. Keywords Ursolic Acid, Antitumor, Action Mechanism 熊果酸抗肿瘤作用机制的研究进展 孟艳秋,杨丽娜,潘洪双,于婷婷,张伟晨,宁梓廷 沈阳化工大学,辽宁 沈阳 收稿日期:2016年10月1日;录用日期:2016年10月16日;发布日期:2016年10月21日 摘 要 熊果酸是一种具有多种药理活性的五环三萜类化合物,其抗肿瘤活性尤为显著。熊果酸的抗肿瘤机制是多方面的。本文对熊果酸的抗肿瘤作用机制的研究进展进行综述并进行展望。 Open Access

熊果酸药理作用研究进展

熊果酸药理作用研究进展 ,相对分子量456 科植物毛子草的地上部分熊果酸具有广泛的 之 对致癌、促癌物有抵抗作用 多研究认为,熊果酸能通过化学预防、抗突变、细胞生长抑制和细胞毒等作用来抑制 到预防恶性肿瘤的目的。癌的发生、发展一般要经历始发突变、促癌和演变三阶段,干扰三个阶段即可达到延缓或阻止

显增加,部分细胞在

熊果酸在自然界中分布广泛,资源丰富,具有化学预防,保肝、抗肝炎,抗肿瘤、抗菌、抗病毒等多种药理活性,熊果酸药用开发景已被众多研究机构所重视,有望成为一种高效低毒的多用途新药。 【参考文献】 1 李开泉,陈武,熊筱娟,等.乌索酸的化学、药理及临床应用进展.中成药,2002, 2 4(9):709-711. 2 Muto Y,Ninomiya M,Fujiki H.Present status of research on cancer chemopre vention in Japan.Jpn J Clin Oncol,1990,20(3):219-221. 3 黄镜,孙燕.熊果酸的抗肿瘤活性.中国新药杂志,1997,6(2):101-104. 4 Niikawa M,Hayashi H,Sato T,et al.Isolation of substances from glossy prive t(Ligustrum lucidum Ait)inhibiting the mutagenicity of benzo(α)preene in bacteri a.Mutat Res,1993,319(1):1-4. 5 Young HS,Chung HY,Lee CK,et al.Ursolic acid inhibits aflatoxin B1-induced mutagenicity in a Salmonella assay system.Biol Pharm Bull,1994,17(7):990-99 3. 6 Huang MT,Ho CT,Wang ZY,et al.Inhibition of skin tumorigenesis by rosema ry and its constituents carnosol and ursolic acid.Cancer Res,1994,54(3):701-70 5. 7 Ohigashi H,Takamura H,Koshimizu K,et al.Search for possible an-titumor p romoters by inhibition of12-O-tetrade-canoylphorbol-13-acetate-induced Epstein-Barr v irus activation;ursolic acid and oleannolic acid from an anti-inflammatory Chinese m edicnal plant,Glechoma hederaceae L.Cancer Lett,1986,30(2):143-148. 8 Ames BN.Dietary carcinogens and anticarcinogens.Science,1983,221:1256-12 58. 9 Balanehru S,Nagarajan B.Protective effect of oleanolic acid and urso-lic acid against lipid peroxidation.Biochem Int,1991,24(5):981-984.

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器:培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃) 材料:动物组织块 试剂:1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s液,碘酒 初代消化培养法 1. 准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。 3. 处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切:用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化:或用恒温水浴,或置于37℃温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 (500~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。 7. 计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整。 8. 培养:置于36.5℃温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶,另瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,塞好瓶塞,置36.5℃温箱培养2小时左右(勿超过4小时),使小块微干涸。 4. 培养:从微箱中取出培养瓶,开塞,46度斜持培养瓶,箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

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人脂肪间充质干细胞体外分离培养方法 间充质干细胞属于成体干细胞,广泛存在于骨髓、脂肪和脐带等组织,下面是小编搜集整理的一篇探究干细胞体外分离培养方法的,供大家阅读查看。 大面积皮肤缺损、重度烧伤的传统修复方法-自体或异体皮肤移植,因存在免疫排斥和供区不足等缺陷而限制了广泛临床应用。近年来,干细胞相关机制及应用的研究为皮肤创伤的治疗带来了新突破。研究显示,间充质干细胞能维持皮肤稳态和促进皮肤创面修复,其机制包括促进细胞分化、免疫调节和分泌生长因子来促进创面再上皮化和血管形成[1-2].人脂肪间充质干细胞(humanadipose-derivedmesenchymalstemcells,hAD-SCs)是由Zuk等[3]首次从抽脂术脂肪中分离出的一类具有多向分化能力的细胞群,因其具有来源丰富、容易获取和扩增快等优点,是组织工程的理想种子细胞。本实验旨在提供一种有效的hADSCs体外分离培养方法,为以后临床细胞移植提供实验基础。 1材料与方法 1.1材料成人腹部大网膜脂肪组织7例取自江苏大学附属医院产科剖宫产手术患者,年龄17~33岁,平均为26岁,健康状况良好,无系统性疾病。低/高糖DMEM、Ⅰ型胶原酶(Gibco公司),胎牛血清(Hyclone公司),鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其相应同型对照(eBio-sciences公司),地塞米松、抗坏血酸磷酸盐、β-甘油磷酸钠、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素(Sigma公司). 1.2方法 1.2.1hADSCs细胞分离培养产科无菌条件下取出腹部大网膜脂肪组织约 10ml,PBS清洗,剪碎,0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化45min,10%胎牛血清终止消化,离心,沉淀重悬,200目细胞筛过滤,再离心。加入完全培养液(含10%胎牛血清、1×双抗的低糖DMEM)重悬,以5×104/ml接种于6孔板,置于37℃,5%CO2培养箱中培养,48h后首次换液,之后每周换液2次,待细胞生长至80%融合时,0.25%胰酶-0.02%EDTA消化传代。实验时用第3~9代细胞。 1.2.2细胞免疫表型检测取消化消化贴壁的第3代hADSCs,1000r/min离心5min,用PBS重悬分装于1.5ml的EP管中,每管100μl,细胞密度为105/ml,加入鼠抗人CD29、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166E、HLA-DR等单克隆抗体及其同型对照。4℃避光孵育30min,PBS洗2次,加PBS300μl重悬后流式细胞仪检测细胞表面抗原。 1.2.3细胞生长曲线和倍增时间取处于对数生长期的第3、6和9代细胞,消化贴壁细胞,将细胞按5×103/孔接种于24孔板,分7组,每组3孔,置培养箱培养。每24h用台盼蓝计数一次,每次计3孔,取其平均数;连续计数7d,

不同产地及外观形态夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量比较

不同产地及外观形态夏枯草中齐墩果酸 和熊果酸的含量比较 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 【摘要】目的比较不同产地、长度、色泽的夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量,为更全面地控制夏枯草的质量提供依据。方法采用高效液相色谱法,以Shim Pack C18为色谱柱,乙腈甲醇水乙酸铵(体积比68∶16∶16∶0.5)为流动相,检测波长为215 nm,流速为0.8 mL/min。结果与结论不同产地夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量差异较大,果穗短者两者含量高于果穗长者,紫红色果穗者两者含量高于棕色果穗。 【关键词】夏枯草产地果穗齐墩果酸熊果酸 Abstract:Objective To compare the contents of oleanolic acid and ursolic acid in Prunella vulgaris with different appearances and from different provenances,in order to control the quality of Prunella vulgaris.Methods Samples were analyzed on a Shim Pack C18 column. The mobile phase consisted of acetonitrile methol water ammonium acetate (68∶16∶16∶0.5)

under a flow rate of 0.8 mL·min-1. The detection wavelength was set at 215 nm.Results and Conclusions There were large differences in contents of oleanolic acid and ursolic acid among Prunella vulgaris with different provenances and appearances, higher in Prunella vulgaris with short and mauve ears. This method was suitable for the quality control of Prunella vulgaris. Key words:Prunella vulgaris;oleanolic acid;ursolic acid 夏枯草Prunella vulgaris为常用中药,以干燥果穗或全草入药,主要用于治疗目赤肿痛、头痛眩晕、瘰疬瘿瘤、乳痈肿痛、高血压等[1]。夏枯草中含有三萜及苷类、苯丙素类、黄酮类等多种化学成分,其中齐墩果酸和熊果酸是主要活性成分[2,3]。目前文献报道有采用衍生化气相色谱法、毛细管胶束电动色谱法、高效液相色谱法等方法评价夏枯草的质量[4-6],但对于不同产地、长度、色泽的夏枯草中这两种三萜酸的含量比较还未见报道。本文以高效液相色谱法测定并比较不同产地、长度、色泽夏枯草样品中齐墩果酸及熊果酸的含量,旨在为更全面控制夏枯草的内在质量提供依据。 1 仪器与试药 Agilent 1100高效液相色谱仪:包括G1313A自动进样器,Agilent ChemStations数据处理软件,美国安捷伦科技有限公司;齐墩果酸对照品、熊果酸对照品:中国药品生物制品检定所,批号分别为110709200304、110742200516;乙腈:色谱纯,美国TEDIA公司;甲醇:分析纯及色谱纯,江苏汉邦科技有限公司;石油醚、乙酸铵:

熊果酸的功效与作用

熊果酸是由天然植物中的一种三萜类化合物而来,具特殊的气味,是存在于天然植物中的一种五环三萜类化合物。那么熊果酸具体有哪些的作用与功效呢?下边不妨一起来简单了解一下吧。 一、熊果酸的作用及功效 据临床医学表示,熊果酸中有的有益分子,非常显著而迅速的可以降低谷丙转氨酶、血清转氨酶等,对于消退小儿黄疽以及增进食欲等方面都有很好的促进,而对于抗纤维化和恢复肝功能症状,效果也非常的明显,而且还特别的稳定。熊果酸还具备有非常明显的抗氧化功效,这也使得它成为医药及化妆品方面的常备原料,例如医药方面对于肝部的治疗非常有益,能够保护并稳定稳定肝细胞膜、细胞器,从而使输出、运输等功能相继慢慢的恢复,在化妆品方面,由于熊果酸有很好的抗氧化作用,能使肌肤具有抵抗力,与此同时还有效淡化皱纹、修肌肤等皮肤难题。且熊果酸其实还是一味天然的保湿剂,大病可以调理,小病可以医治,又给人们带来不少的惊喜。

二、含量测定标准 1、色谱条件: 硅胶G薄层板;环己烷-氯仿-乙酸乙酯(20:5:8)为展开剂,上行展开;展距12~18cm;5%硫酸乙醇溶液,110℃加热5min显色。 2、样品溶液的制备: 精密称取栀子粉碎样品20g (炒栀子按得率折合后称取),置索氏提取器内,加乙醚300ml回流提取至无色,回收溶剂至干,残留物加石油醚浸泡2次,每次15ml,约浸泡2min,倾去石油醚,用无水乙醇-乙醚(2:3)混合液微热使溶解并定容于5ml量瓶中,作为样品溶液。 3、对照品溶液的配制: 精密称取熊果酸对照品适量,加无水乙醇:乙醇(3:2)的混合溶液制成每毫升含1mg的溶液,作为对照品溶液。 4、测定: 准确吸取样品溶液及对照品溶液2μl,点于同一薄层板上。按上述色谱条件展开,显色。照薄层扫描法扫描,λS=520nm,λR=700nm;双波长反射法锯齿

齐墩果酸与熊果酸结构修饰物的药理活性和构效关系研究进展_刘丹

齐墩果酸与熊果酸结构修饰物的药理活性和构效关系研究进展 刘丹1,2 孟艳秋23 赵娟2 (1天津大学药物科学与技术学院 天津 300072; 2沈阳化工学院制药工程教研室 沈阳 110142) 刘丹 女,35岁,副教授,主要从事天然活性成分的结构修饰和医药中间体的合成工作。 3联系人,E 2mail :myq6581@https://www.sodocs.net/doc/7d17843109.html, 辽宁省自然科学基金资助项目(20042009) 2005-12-12收稿,2006-08-15收稿 摘 要 齐墩果酸(OA )和熊果酸(UA )均属于五环三萜类化合物,广泛存在于自然界中,具有多种显著的 生物活性。本文综述了近年来齐墩果酸及熊果酸结构修饰物的药理活性和构效关系的研究进展。 关键词 齐墩果酸 熊果酸 结构修饰 药理活性 R ecent Advance in the Study on Derivatives of Oleanolic Acid and U rsolic Acid Liu Dan 1,2,Meng Y anqiu 23,Zhao Juan 2(1C ollege of Pharmaceuticals &Biotechnology ,T ianjin University ,T ianjin 300072;2Faculty of Pharmaceutical Engineering ,Shenyang Institute of Chemical T echnology ,Shenyang 110142) Abstract Oleanolic acid and urs olic acid belong to triterpene acids which having numerous pharmacological activities and widely presenting in food ,medicinal herbs and other plants.Here a brief introduction of the recent progresses on pharmacological activities and the structure-activity relationship of derivatives of olean olic acid and urs olic acid are given out. K ey w ords Oleanolic acid ,Urs olic acid ,M odification ,Pharmacological activities 齐墩果酸(oleanolic acid ,OA ,1)和熊果酸(urs olic acid ,UA ,2)为结构类似物,均属于五环三萜类化合物,在自然界分布十分广泛,且具有多种生物活性。为了寻找高效低毒的衍生物,需对齐墩果酸和熊果酸的作用机制进行深入的研究;通过对32位羟基,C 122C 13位双键和282位羧基等官能团的结构修饰合成了一系列衍生物,进行了相关的药理活性测试,并与母体进行比较,获得了相应的构效关系。本文将就齐墩果酸及熊果酸结构修饰物的药理活性和构效关系研究进展进行综述。 1  齐墩果酸及熊果酸化学及药理活性简介 齐墩果酸(C 30H 48O 3)属于β-香树脂醇型五环三萜类化合物,据不完全统计,它以游离形式或与糖结合的形式存在于大约60个科190种植物中[1],具有保肝[2,3]、消炎[4]、降糖[5]、抗HI V [6,7]和抗肿瘤[8~10]等药理作用。 熊果酸(C 30H 48O 3)为α-香树脂醇型五环三萜类化合物,以游离形式或与糖结合的形式存在于大约

熊果酸

打开的谱图文件:D:\10\熊果酸标准品3(00001).hw ───────────────────────────序号 保留时间 名称 峰面积% 峰面积 ─────────────────────────── 1 0.20 2 0.00464 3 118 2 0.23 3 0.001742 44 3 0.278 0.002292 58 4 0.444 0.009194 233 5 0.652 0.006404 163 6 0.922 0.006128 156 7 1.150 0.005266 134 8 1.199 0.002263 57 9 1.236 0.002975 76 10 1.453 0.009436 240 11 1.652 0.0075 190 12 1.803 0.001693 43 13 2.070 1.414 35901 14 2.659 0.09665 2454 15 2.777 0.1092 2773 16 3.084 1.454 36908 17 3.726 1.346 34185 18 4.277 0.2177 5529 19 4.675 0.4557 11571 20 4.886 0.322 8176 21 5.498 93.84 2382895 22 7.284 0.02985 758 23 7.588 0.006965 177 24 7.853 0.003855 98 25 8.058 0.01011 257 26 8.294 0.0007985 20 27 8.404 0.002138 54 28 8.594 0.00232 59 29 8.920 0.006411 163 30 9.097 0.003013 77 31 9.357 0.005584 142

实验五 细胞的传代培养

实验5 细胞的传代培养 一、实验目的 熟练掌握动物细胞的传代培养法。 二、实验原理 哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶,细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。 三、仪器、材料与试剂 1仪器 CO2培养箱,倒置显微镜,超净台 2材料 培养瓶,试管,移液管,巴斯德吸管,废液缸,75%酒精棉球,酒精灯,细胞。 3试剂 完全培养基(RPMLl640或DMEM),0.25%胰蛋白酶,D-Hanks液。 四、实验步骤 1.入无菌室之前用肥皂洗手,用75%酒精擦拭消毒双手。 2.倒置显微镜下观察细胞形态,确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。 3.超净台台面应整洁,用75%酒精溶液擦净。 4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右,关闭超净台的紫外灯,打开抽风机清洁空气。 5.点燃酒精灯,取出无菌试管,刻度吸管;安上橡皮头;插在无菌试管内。 6.打开细胞培养瓶,过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基,或用少量胰酶涮洗一下。 8.加入胰酶消化液,盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察,当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶,使细胞脱离胰酶,然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。

9.加入少量的新鲜培养基,反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散,再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7-10mL/大瓶,3-5mL/小瓶)制成细胞悬液,分装到新培养瓶中。盖上瓶盖,适度拧紧后再稍回转,以利于CO2气体的进入,将培养瓶放回CO2培养箱。 10.对悬浮培养细胞,步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清,加入新鲜培养基,然后分装到各瓶中。 五、注意事项 1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。 2.每天观察细胞形态,掌握好细胞是否健康的标准:健康细胞的形态饱满,折光性好,生长致密时即可传代。 3.如发现细胞有污染迹象,应立即采取措施,一般应弃置污染的细胞,如果必须挽救,可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗,随后培养基中加入较大量的抗菌素,并经常更换培养基等。 六、实验报告 1.试述传代培养的步骤和注意事项,并指出哪些是关键步骤? 2.细胞传代培养的目的是什么?

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