胰岛素对RF6A细胞VEGF受体表达的影响

天津医药2010年12月第38卷第12期

胰岛素对RF/6A细胞VEGF受体表达的影响*

周赛君陈松于珮于德民△

实验研究

以血管新生为主要病变特点的增殖型糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy,PDR）已成为西方国家成人致盲的首要原因，亦是我国糖尿病患者致盲的主要原因[1]。严格控制血糖是延缓包括视网膜病变在内的严重并发症的有效手段。应用胰岛素是控制血糖、延缓糖尿病慢性并发症进展最有效的治疗方法。然而目前，关于应用胰岛素能否促进糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR），尤其是PD R的发生、发展，一直有广泛争议[2-4]。本研究通过探讨胰岛素对视网膜内皮细胞血管新生的影响及可能的机制，为临床更加安全地应用胰岛素提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1材料恒河猴视网膜血管内皮细胞系RF/6A为ATCC 产品，为永生化细胞系，购自中国典型培养物保藏中心，细胞培养液RPMI-1640培养基购自美国GIBCO公司，胎牛血清、青霉素、链霉素购自北京鼎国生物技术有限公司。Matrigel购自美国BD公司，抗磷酸化VEGFR2（p-VEGFR2）特异性单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的抗鼠免疫球蛋白购自美国

Cell Signaling公司。生物合成人胰岛素诺和灵R购自诺和诺德公司，其他试剂均购自天津润泰生物公司。

1.2方法

1.2.1实验分组对照组（NC）、低胰岛素组（LINS）和高胰*国家自然科学基金资助项目（项目编号：30971393）；天津市科技支撑重点项目（项目编号：08Z CG Y SF01700）；天津市卫生局科技基金重点项目及面上项目（项目编号：09K Z01，09K Z89）；天津医科大学科技基金资助项目（项目编号：2007ky15，2009ky25）作者单位：300070天津医科大学代谢病医院，卫生部激素与发育重点实验室（周赛君，于珮，于德民）；天津市眼科医院（陈松）△通讯作者E-mail：yudemintij@https://www.sodocs.net/doc/7018176494.html,

摘要目的：探讨胰岛素对视网膜血管内皮细胞RF/6A血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR）的表达及血管新生的影响。方法：分别用0、1和100nmol/L的人胰岛素处理RF/6A细胞，采用MTS实验、细胞迁移实验、管腔形成实验分别检测胰岛素对RF/6A细胞增殖、迁移、管腔形成等生物学功能，RT-PCR、Western blot技术检测VEGFR的表达、磷酸化活性。结果：胰岛素可促进RF/6A的增殖、迁移、管腔形成（P<0.05或P<0.01），促进VEGFR2mRNA的表达和VEGFR2蛋白的磷酸化（P<0.05或P<0.01），而对VEGFR1mRNA表达的影响差异无统计学意义（P>0.05）。结论：胰岛素可经VEGFR2信号促进RF/6A细胞血管新生，而VEGFR1信号可能不参与胰岛素诱导的RF/6A细胞血管新生。

关键词胰岛素脉络膜视网膜血管内皮,血管恒河猴受体,血管内皮生长因子新生血管化,病理性The Effects of Insulin on the Expression of VEGFR in RF/6A Cells

ZHOU Saijun,CHEN Song,YU Pei,YU Demin

Metabblic Diseases Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin300070,China Abstract Objective:To study the effect of insulin on vascular endothelial growth factor receptor(VEGFR)and angiogenesis in RF/6A retinal vascular endothelial cells,and the underlying mechanism thereof.Methods:RF/6A cells were treated with0,1and100nmol/L of insulin respectively.The MTS,cell migration and lumen formation experiments were used to detect cell proliferation,migration and lumen formation influenced by insulin in RF/6A cells respectively.RT-PCR and Western blot were used to measure the expressions of VEGFR and phosphorylation activity.Results:Insulin promoted the proliferation,migration and lumen formation in RF/6A cells(P<0.05or P<0.01).Insulin also increased both the expression of VEGFR2mRNA and its phosphorylation(P<0.05or P<0.01).There was no significant difference in the expression of VEGFR1mRNA between groups(P>0.05).Conclusion:Insulin might promote angiogenesis via a VEGFR2in RF/6A cells. VEGFR1may not be involved in insulin-induced angiogenesis in RF/6A cells.

Key words insulin choroid retinal vessels endothelium,vascular macaca mulatta receptors,vascular endothelial growth factor neovascularization,pathologic

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Tianjin Med J熏Dec2010熏Vol38No12

岛素组（HINS）分别用含有0、1和100nmol/L胰岛的1640细胞培养液处理RF/6A。同一浓度设置3个复孔，所有实验重复3次。

1.2.2细胞增殖实验细胞长至80%~90%融合时，进行消化，制成1×105/mL细胞悬液，将细胞接种到96孔板中（每孔100μL细胞悬液），24h后吸净培养液，加入无血清培养液饥

饿培养过夜，吸净培养液分别加入含有0、1和100nmol/L的胰岛素培养液，72h后终止培养。吸取20μL[3-（4，5）-二甲基-2-yl）-5-（3-羧基甲氧基苯）-2-（4-硫苯）-2H-苯唑，内盐（MTS）加入96孔板中，每个样品含100μL培养液制作标准曲线，设置3个复孔。37℃温箱孵育1~4h。用酶标仪测490nm波长，测定各孔吸光度值[5]。

1.2.3细胞迁移实验将1×105/mL的内皮细胞接种到用多聚赖氨酸处理过的24孔板。待细胞生长至融合形成单层细胞后，用200~1000μL微量加样枪头在培养孔中央垂直划一直线，形成一宽约0.5mm的无细胞“裸区”。用D-Hanks溶液清洗细胞2遍，分别加入含有0、1和100nmol/L胰岛素培养液，培养48h后，用D-hanks溶液清洗细胞2遍，10%福尔马林溶液固定5~10min,伊红染色2min，清洗，拍照。采用Image Pro-Plus图像处理软件进行图像分析。低倍镜下（×40倍）测量迁移入“裸区”面积[5]（代表迁移的细胞数）。

1.2.4管腔形成实验将Matrigel至于4℃过夜，融化成黄色胶状液体。用预冷的微量加样器在短时间内迅速加入预冷的96孔板中，每孔70μL（厚度约0.5mm），轻轻摇晃培养板使其平铺板底。将培养板置入37℃孵箱中30min左右，使其凝固。将1×105/mL细胞悬液接种到铺好胶的培养孔中，并分别加入含有0、1和100nmol/L胰岛素培养液，置于孵箱中孵育18h，采用低倍镜（×40倍）视野进行拍照。采用Image Pro-Plus图像分析软件计算血管分支点数（每3个分叉处记做1个血管腔）[2-3]。

1.2.5RNA抽提和RT-PCR检测细胞传代24h后,经无血清饥饿培养过夜，分别加入含有0、1和100nmol/L的胰岛素培养液，培养48h后,采用Trizol法提取总RNA。测定OD260/OD280值以检测RNA浓度和纯度；琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整性，确定没有发生RNA降解的前提下取1μg总RNA用DNase处理后，按Promega反转录试剂盒说明书进行反转录。内参采用GAPDH基因。目的基因引物及反应条件分别为：VEGFR1上游5′-CCCACTTGCCATCATAA GG-3′，下游5′-CACCATACCTCCTGCGAAACCT-3′,60℃、45s，35个循环；VEGFR2上游5′-ATAGATGGTGTAACCCGGAGTG AC-3′，下游5′-TGGGATTGGTAAGGATGACAGTGT-3′62℃、45s，30个循环；内参GAPDH上游5′-TGATTTTGGA GGGAT CTCGC-3′，下游5′-GGTGCCTTGGCTTTGTC-3′，55℃、30s，30个循环。

1.2.6Western blot检测RF/6A经传代、无血清饥饿培养过夜后，分别加入含0、1和100nmol/L的胰岛素培养液孵育48h。用Bradford法分析测定样品的蛋白含量。将含相同量蛋白（50μg）的细胞裂解液用SDS-PAGE电泳，并转到硝酸纤维素膜上用抗p-VEGFR2单克隆抗体孵育膜。辣根过氧化物酶标记的二抗和DAB显色、照相，条带密度分析用

BandScan图像分析软件完成，与内参β-actin比较，计算相对光密度。

1.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，检验水准为双侧α=0.05。

2结果

与对照组比较，低胰岛素组和高胰岛素组RF/ 6A细胞增殖、迁移和管腔形成、VEGFR2mRNA的表达量及p-VEGFR2活性均有增加（P<0.05或P<0.01），两胰岛素干预相比，差异亦具有统计学意义（P<0.05或P<0.01），而对VEGFR1mRNA表达的影响3组间差异无统计学意义（P>0.05），见表1、图1~4。

3讨论

临床研究发现，2型糖尿病患者给予胰岛素或口服降糖药治疗后，胰岛素组DR的患病率及其严重程度明显高于非胰岛素组[2]；亦有报道，长期应用表1胰岛素对RF/6A细胞各种指标的影响（n=9，x±s）

0.24±0.04

0.32±0.05

0.39±0.09

8.29**

3.81*

7.14**

3.63*对照组（1）

低胰岛素组（2）

高胰岛素组（3）

F

q（1）∶（2）

（1）∶（3）

（2）∶（3）

细胞增殖

（OD值）

0.74±0.14

1.03±0.18

1.31±0.27

8.94**

3.73**

7.33**

3.60*

迁移

（万像素）

3.92±0.87

5.91±1.21

9.74±1.38

19.63**

5.10**

14.23**

9.12**

管腔数

（个）

17.30±1.58

22.11±2.47

38.33±4.03

22.42**

5.02**

21.91**

16.09**

VEGFR1

mRNA

0.36±0.04

0.36±0.08

0.35±0.07

0.49

_

_

_

VEGFR2

mRNA

0.51±0.09

0.61±0.07

0.70±0.05

7.73**

4.17**

7.51**

3.76*

组别p-VEGFR2 *P<0.05，**P<0.01

M：Marker；1：对照组；2：低胰岛素组；3：高胰岛素组

图4胰岛素对RF/6A p-VEGFR2表达的影响

M：Marker；1：对照组；2：低胰岛素组；3：高胰岛素组

图3胰岛素对RF/6A VEGFRmRNA

表达的影响

天津医药2010年12月第38卷第12期

胰岛素治疗可能恶化PDR[6]。本研究显示，胰岛素是RF/6A强有力的促增殖因子，同时亦能促其迁移和管腔形成。因此，胰岛素在体外是一种强有力的促视网膜内皮细胞血管新生的因子。

近年来研究认为，胰岛素治疗对DR有不利的影响,根源在于胰岛素可通过调节各种细胞因子促进视网膜血管新生。而VEGF是促血管新生的关键因子。VEGF能通过其特异性受体即VEGFR1、VEGFR2发挥其促进血管新生的作用[5，7]。大量研究亦表明，不论在DR早期或PDR玻璃体中VEGF水平升高[2-3，5]。体内研究表明，降低玻璃体VEGF水平能使PDR得到显著改善[1]。可见胰岛素的促内皮细胞血管新生与VEGF的高表达密切相关。VEGFR与其他许多生长因子受体一样，介导了一系列细胞行为，包括细胞迁移、存活、增殖等，在介导脉管新生过程中起着关键的作用。内皮细胞上主要表达VEGFR1、VEGFR2两种关键受体[3-4]。VEGFR1在胚胎发育过程中起着促进胚胎血管形成等重要的生物学功能；VEGFR2可以在各种病生理情况下调控血管内皮细胞的生物学活性[3]。本研究发现，在体外实验中，胰岛素能显著增加RF/6A VEGFR2mRNA的表达。此外，胰岛素亦能促进VEGFR2的磷酸化。VEGFR2磷酸化激活是启动下游信号途径，发挥其促血管新生等重要的生物学功能的关键步骤[3]。因此，胰岛素对RF/6A血管新生的作用可能是通过促进VEGF-A的表达及增强其受体后的效应双靶点起作用的。本研究还发现，胰岛素对RF/6A VEGFR1mRNA的表达无明显影响。据此推测，VEGFR1可能不参与胰岛素诱导的视网膜内皮细胞血管新生的作用机制。

（图1、2见插页）

参考文献

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[2]Chantelau E,Meyer-Schwickerath R,Klabe K.Downregulation of serum IGF-1for treatment of early worsening of diabetic retinopa-thy:a long-term follow-up of two cases[J].Ophthalmologica, 2009,224(4):243-246.

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研究进展[J].眼科研究,2008,26(5):393-396.

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（2010-03-24收稿2010-07-07修回）

（本文编辑魏杰）

有前兆的偏头痛（MA）是心血管疾病（包括缺血性脑卒中和心肌梗死）的危险因素。已有研究证实，偏头痛患者有较高的患心血管疾病的危险因素。但无前兆的偏头痛（MO）是否与之具有相类似的作用，目前仍存在争议。

近日，挪威的Winsvold BS等进行了一项大样本横断面人群研究来验证头痛与心血管危险因素之间的关系。该研究选取年龄≥20岁的人群作为研究对象，共有48713例受试者完成了头痛问卷的填写。依据1995—1997年挪威的北特隆特雷健康研究（H哉NT2）的结果对所有受试者进行头痛分类。并且，通过测量血压、体质指数（BMI）、胆固醇（CHO）、高密度脂蛋白（HDL）等参数对44098例（90.5%）受试者进行Framingham10年心肌梗死和冠心病猝死风险评估。

研究结果显示，相较于对照组而言，非偏头痛的头痛组（OR1.17,95%CI1.10~1.26）、MO组（OR1.17,95%CI1.04~ 1.32）和MA组（OR1.54,95%CI1.21~1.95）的Framingham 风险评分均升高。并且Framingham评分与头痛的频率呈正相关。在非偏头痛的头痛组和MO组中，吸烟、高BMI和缺乏体育锻炼等生活方式均可增加心血管风险，但这些生活方式因素并不能解释MA组的心血管风险是如何增加的。

因此，该研究认为MA、MO和非偏头痛的头痛都与心血管疾病的危险因素相关，但MA与其他两种头痛类型可能是通过不同的作用机制导致心血管风险增加。

（张爽摘杨卓审校译自Eur J Neurol,2010Sep6.[Epub ahead of print]）

头痛和偏头痛与心血管疾病风险国内外研究快讯

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胰岛素对RF/6A细胞VEGF受体表达的影响

作者：周赛君， 陈松， 于珮， 于德民， ZHOU Saijun， CHEN Song， YU Pei， YU Demin

作者单位：周赛君,于珮,于德民,ZHOU Saijun,YU Pei,YU Demin(卫生部激素与发育重点实验室,天津医科大学代谢病医院,300070)， 陈松,CHEN Song(天津市眼科医院)

刊名：

天津医药

英文刊名：TIANJIN MEDICAL JOURNAL

年，卷(期)：2010，38(12)

被引用次数：0次

参考文献(7条)

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相似文献(10条)

1.外文期刊Polak.K.Dallinger.S.Polska.E.Findl.O.Eichler.HG.Wolzt.M.Schmetterer.L Effects of insulin on retinal and

pulsatile choroidal blood flow in humans.

BACKGROUND: Insulin induces vasodilation in several tissues, including skeletal muscle and kidneys. OBJECTIVE: To investigate whether insulin may contribute to ocular blood flow regulation. METHODS: The study was performed in a balanced, randomized, placebo-controlled, single-masked, 3-way, crossover design in 9 healthy male subjects. Each subject received 2 doses of insulin (1.5 or 3 mU/kg per minute) or placebo on 3 different study days. Measurements of fundus pulsation amplitude with laser interferometry to assess pulsatile choroidal blood flow, of retinal blood flow with the blue-field entoptic technique, and of mean blood flow velocity in the ophthalmic artery with Doppler sonography were performed under euglycemic clamp conditions over 120 minutes. RESULTS: Hyperinsulinemia significantly increased fundus pulsation amplitude (1.5 mU/kg per minute: 8.7% +/- 1.1% vs baseline; 3 mU/kg per minute: 13.2% +/- 2.3% vs baseline; P<.001 vs placebo [analysis of variance]) and mean blood flow velocity (1.5 mU/kg per minute: 10.0% +/- 4.3% vs baseline; 3 mU/kg per minute:

6.6% +/- 3.5% vs baseline; P = .03 vs placebo). Retinal blood flow did not increase during administration of insulin (1.5 mU/kg per minute: 6.4% +/- 8.0% vs baseline; 3 mU/kg per minute: 8.0% +/- 5.1% vs baseline; P = .99 vs placebo). Neither the effect in the choroid nor that in the ophthalmic artery was dose-dependent. CONCLUSION: Hyperinsulinemia significantly increases choroidal blood flow and mean blood flow velocity in the ophthalmic artery. By contrast, retinal blood flow was not influenced by hyperinsulinemia. The maximum effective dose of insulin for ocular hemodynamics is likely to be within the physiological range.

2.学位论文王海鹏单色光眼底摄影术在胰岛素非依赖型糖尿病眼底病变检查中的应用研究1996

3.学位论文邓志宏胰岛素样生长因子-2对鸡形觉剥夺性近视眼调控作用的研究2006

第一章IGF-1、IGF-2及其受体在小鸡FDM眼后极部视网膜-脉络膜中的表达

目的：建立小鸡形觉剥夺性近视(FDM)动物模型，观察FDM眼后极部视网膜-脉络膜胰岛素样生长因子(IGF-1、IGF-2))及受体(IGF-1R，IGF-2R)表达水平的变化，探讨IGF-1、IGF-2及IGF-1R、IGF-2R在FDM发病中的作用。

方法：选取孵化1天的健康白色来亨鸡36只，随机分为2组：右眼遮盖为实验组，遮盖时间为7天、14天、21天，各时间段12只：左眼不遮盖为自身对照组。于实验前及遮盖不同时间段测量屈光度和眼轴长度；用免疫组化及RT-PCR检测后极部视网膜一脉络膜IGF-1、IGF-2及IGF-1R、IGF-2R的表达水平。

结论：形觉剥夺可成功建立鸡近视眼模型，表现为屈光度向近视化发展，眼轴延长。鸡眼后极部视网膜-脉络膜均可见IGF-1、IGF-2及IGF-IR、IGF-2R蛋白质和mRNA水平的表达。形觉剥夺可导致IGF-2和IGF-1R表达水平升高，而对IGF-1和IGF-2R表达水平无影响，提示IGF-2可能通过与IGF-1R结合参与调控近视的发展。

第二章重组人igf-2对小鸡眼球发育及后极部视网膜一脉络膜igf-2mrna表达的调控

目的:小鸡非遮盖眼和fdm眼玻璃体腔注射重组人igf-2,观察rhlgf-2对其屈光度、眼轴长度及内源性igf-2 mrna表达水平的影响,探讨rhlgf-2对小鸡眼球发育的影响及其调控作用与形觉剥夺的关系。

方法:选取孵化1天的白色来亨鸡120只,随机均分为2组:a组为非遮盖组,按不同处理分为al～a5组,每组12只:a<,1>组为空白对照组;a2组为阴性对照组,单眼玻璃体腔注射20ul牛血清白蛋白;a<,3>～a<,5>组为rhlgf-2注射组,浓度分别为lng/20ul、10ng/20ul、100ng/20ul。b组为单眼遮盖组,分为b<,1>～b<,5>组,各组遮盖眼处理同a<,1>～a<,5>组。实验第7天测量遮盖眼屈光度和眼轴长度,并用rt-pcr检测内源性igf-2 mrna的表达水平。

结论:rhlgf-2玻璃体腔注射对非遮盖组的屈光度和眼轴长度无影响;但可使单眼遮盖组近视屈光度增加,眼轴延长,其效应呈浓度依赖性。rhlgf-2可下调两组后极部视网膜一脉络膜内源性IGF-2mRNA的表达水平，效应呈浓度依赖性。以上结论提示rhlGF-2在形觉剥夺存在的条件下可促进FDM的发展。

第三章IGF-2、IGF-1R反义寡核苷酸对小鸡FDM及后极部视网膜一脉络膜IGF-2 mRNA、IGF-1R mRNA表达的抑制作用

目的：小鸡FDM眼玻璃体腔注射IGF-2和IGF-IR的反义寡核苷酸(ASON)，观察其屈光度、眼轴长度以及IGF-2 mRNA、IGF-1R mRNA表达水平的变化，探讨IGF-2、IGF-lRASON对FDM的影响。

方法：选取孵化l天白色来亨鸡120只，行单眼遮盖后随机分为4组：A组(12只)为空白对照组。B组(12只)为阴性对照组，遮盖眼玻璃体腔注射20ul生理盐水。C组(48只)为IGF-

2寡核苷酸注射组，均分为C<,l>、C<,2>、C<,3>、C<,4>组，C<,1>组：遮盖眼玻璃体腔注射40ug／20ul的IGF-2正义寡核苷酸(sense oligonucleotides，SON)：C<,2>～C<,4>组：分别注射10ug／20ul、20ug／20ul、40ug／20ul的IGF-2 ASON。D组(48只)为IGF-1R寡核苷酸注射组，均分为D<,l>、D<,2>、D<,3>、D<,4>组，D<,l>组：遮盖眼玻璃体腔注射

40ug／20ul的IGF．1R SON；D<,2>～D<,4>组分别注射10ug／20ul、20ug／20ul、40ug／20ul的IGF-1R ASON。于实验第7天测量实验眼的屈光度、眼轴长度，用RT-PCR检测其IGF-2 mRNA、IGF-1R mRNA的表达水平。

结论：玻璃体腔注射IGF-2、IGF-1R ASON可通过下调小鸡FDM眼视网膜-脉络膜IGF-2 mRNA及IGF-1R mRNA的表达，减缓小鸡FDM的发展，证实IGF-2可能通过与IGF-1R结合调控近视的发展。

4.期刊论文邓志宏.谭佳.刘双珍.赵少贞.汪建涛重组人胰岛素样生长因子2对豚鼠眼球发育的调控作用及其与形觉剥夺的关系-眼视光学杂志2009,11(2)

目的 对豚鼠非遮盖眼和形觉剥夺性近视(form-deprivation myopia,FDM)眼玻璃体腔注射重组人胰岛素样生长因子2(recombinant human insulin-like growth factor,rhIGF-2),观察rhIGF-2对两组豚鼠眼屈光度、眼轴长度及视网膜-脉络膜内源性IGF-2表达水平的影响,探讨rhIGF-2对豚鼠眼球发育的调控作用以及该调控作用与形觉剥夺的关系.方法 选取3周龄的三色豚鼠80只,随机均分为2组.A组为非遮盖组.分为A1～A5组,每组8只:A1组为空白对照组;A2组为阴性对照组,单眼玻璃体腔注射20μl牛血清白蛋白;A3～A5组为rhIGF-2注射组,注射量分别为1 ng、10 ng、100 ng(20 μl).B组为单眼遮盖组,分为B1～B5组,各组遮盖眼处理同A1～A5组.实验第14天测量遮盖眼屈光度和眼轴长度,检测视网膜-脉络膜IGF-2的表达水平.结果 非遮盖组中,rhIGF-2注射组(A3、A4、A5组)的屈光度、眼轴长度与对照组(A1、A2组)之间差异无统计学意义(P>0.05);但A4、A5组的IGF-2水平明显低于对照组

(P=0.000),A3组与对照组差异无统计学意义(P>0.05);A3、A4、A5组内源性IGF-2表达水平与rhIGF-2注射量呈负相关(r=-0.940,P=0.000).单眼遮盖组中,B4、B5组与对照组(B1、B2组)相比,近视屈光度增加,眼轴延长,内源性IGF-2表达水平下降(P=0.000),而B3组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05);B3、B4、B5组的屈光度及内源性IGF-2表达水平与rhIGF-2注射量呈负相关(r=-0.832,-0.858,P=0.000),眼轴长度与rhIGF-2注射量呈正相关(r=0.863,P=0.000).结论 rhIGF-2玻璃体腔注射对豚鼠非遮盖眼的屈光度和眼轴长度无影响,但可使形觉剥夺眼近视屈光度增加,眼轴延长,其效应呈浓度依赖性.rhIGF-2可下调豚鼠眼视网膜-脉络膜内源性IGF-2的表达,效应呈浓度依赖性.提示rhIGF-2在形觉剥夺存在的条件下可促进形觉剥夺性近视的发展.

5.学位论文田军胰岛素样生长因子Ⅰ、Ⅱ与形觉剥夺性近视的实验研究2005

本实验拟建立豚鼠形觉剥夺性近视模型，从转录水平上研究形觉剥夺性近视形成过程中，IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ在视网膜、脉络膜和巩膜的变化规律，以探讨IGF与形觉剥夺性近视发生的关系，结果表明，豚鼠可作为研究形觉剥夺性近视的一种经济有效的哺乳动物模型；哺乳类动物控制眼轴增长的主要因素是增强巩膜的抵抗力而不是控制巩膜的生长；IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ参与形觉剥夺性近视的形成。4如在哺乳类动物形觉剥夺敏感期补充外源性胰岛素样生长因子会在一定程度上减轻形觉剥夺对视功能造成的损害。

6.学位论文王帅胰岛素样生长因子-Ⅰ对豚鼠巩膜成纤维细胞的影响2007

近视是一种十分常见的眼部疾病，影响世界上大约十亿人。研究近视的发病机制对延缓近视发展、防止近视并发症及探索治疗近视的方法都有极其重要的意义。国内外通过对哺乳类动物近视模型和人类高度近视眼的研究发现：大多数近视的发生机制是眼球玻璃体腔延长，巩膜在近视发展的过程中经历了主动重塑过程，其病理改变为细胞成分减少、细胞外基质成分改变等。大量近视相关研究发现，在异常视觉信息的作用下，视网膜、脉络膜内多种神经递质和生长因子的表达发生改变，通过一系列信号转导过程使巩膜成纤维细胞和细胞外基质在增生代谢上发生变化。目前已有多种物质被证明可能参与这一信号转导过程，如多巴胺、血管活性多肽、一氧化氮等，我们推测这些物质并不是直接作用于巩膜细胞和细胞外基质，而是作为导致巩膜病理改变的异常视觉信息转导过程中的上游信号分子，通过某种特定因子发挥对巩膜的终端调控作用。因此，寻找调控巩膜改变的生物活性物质，并明确其作用机制是近视研究中的一个重要内容。

胰岛素样生长因子(Insulin-Like growth factor，IGF)是一类多功能细胞增生调控因子，在细胞分化、增殖及个体的生长发育中有重要的促进作用。IGF有三种配体即胰岛素、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ，后两者70﹪以上同源，与人胰岛素的结构和功能约50﹪相似，它们通过与IGF-Ⅰ受体、IGF-Ⅱ受体和IGF/Ins杂合受体结合发挥作用。IGF-I与IGF-H具有相似的结构和体外活性，但体内生物学效应不尽相同，在不同组织，不同生长发育期，IGF-Ⅰ与IGF-Ⅱ的作用及水平均有差异。机体许多组织细胞能够自分泌和旁分泌IGF-Ⅰ，IGF-Ⅰ依赖于生长激素，可促进体外培养的多种细胞增生，促进蛋白质和DNA的合成。我们在豚鼠形觉剥夺性近视模型的研究中发现，豚鼠巩膜中IGF-Ⅰ mRNA的含量显著下降，提示IGF-Ⅰ可能是引起巩膜重塑的直接因子。本研究采用体外培养豚鼠巩膜成纤维细胞(guinea pig scleral fibroblasts，GSF)，观察IGF-Ⅰ对巩膜成纤维细胞的影响，探讨IGF-I与近视发生机制的关系。

材料与方法

随机选取健康三色出生1～3天的豚鼠，雌雄兼用，体重80～120g。体外培养GSF，依次进行原代GSF的形态学观察，免疫组织化学法对GSF进行波形蛋白和角蛋白的鉴定；取

3～6代的细胞进行药物实验，采用MTT法观察IGF-Ⅰ对体外培养GSF增生的时间、剂量效应关系，氯胺T法检测IGF-Ⅰ对胶原蛋白合成的影响，ELISA法检测IGF-Ⅰ对细胞基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和金属蛋白酶组织抑制剂-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)表达水平的影响。

结果

1.GSF原代、传代培养生长良好，波形蛋白鉴定阳性，角蛋白鉴定阴性。

2.与对照组相比IGF-Ⅰ在10.00 ng·ml<'-1>～200.00 ng·ml<'-1>浓度范围内与GSF的增生呈剂量效应关系(P<0.05)，且在100.00 ng·ml<'-1>～200 ng·ml<'-1>浓度时促进增生作用显著(P<0.01)。

3．从第2天开始，实验组和对照组相比IGF-Ⅰ对巩膜成纤维细胞有显著促增生作用(P<0.05)。

4．与对照组相比浓度为10.00 ng·ml<'-1>～200.00 ng·ml<'-1>的IGF-Ⅰ能有效刺激巩膜成纤维细胞胶原蛋白的合成，并呈剂量效应关系。

5．IGF-Ⅰ在浓度为10.00 ng·ml<'-1>时与对照组相比明显降低巩膜成纤维细胞MMP-2蛋白的表达(P<0.05)，在50.00 ng·ml<'-1>～200.00 ng·ml<'-1>时下降更为明显

(P<0.01)；而TIMP-2蛋白的表达在浓度5.00 ng·ml<'-1>～200.00 ng·ml<'-1>范围内没有明显改变。

结论

1. IGF-I可以显著刺激GSF的增生，并呈时间剂量效应依赖关系。

2. IGF-I在一定浓度范围内随着浓度增加能有效促进巩膜成纤维细胞胶原蛋白合成。

3. IGF-I在一定浓度范围内随着浓度的增加能够抑制MMP-2蛋白的表达，而对TIMP-2蛋白表达作用不明显。

4．在哺乳类动物形觉剥夺敏感期补充外源性IGF-I可能会在一定程度上减缓形觉剥夺性近视的发展。

7.外文期刊Findl.O.Dallinger.S.Rami.B.Polak.K.Schober.E.Wedrich.A.Ries.E.Eichler.HG.Wolzt.M.Schmetterer.L Ocular

haemodynamics and colour contrast sensitivity in patients with type 1 diabetes.

BACKGROUND: There is evidence that altered ocular blood flow is involved in the development and progression of diabetic retinopathy. However, the nature of these perfusion abnormalities is still a matter of controversy. Ocular haemodynamics were characterised with two recently introduced methods. METHODS: The cross sectional study was performed in 59 patients with type 1 diabetes with a diabetes duration between 12 and 17 years and an age less than 32 years and a group of 25 age matched healthy controls. Scanning laser Doppler flowmetry and laser interferometric measurement of fundus pulsation amplitude were used to assess retinal and pulsatile choroidal blood flow, respectively. In addition, colour contrast sensitivity along the tritan axis was determined. RESULTS: Fundus pulsation amplitude, but not retinal blood flow, increased with the progression of diabetic retinopathy. Retinal blood flow was influenced by plasma glucose levels (r = 0.32), whereas fundus pulsation amplitude was associated with HbA(1c) (r = 0.30). In addition, a negative correlation between the colour contrast sensitivity along the tritan axis and retinal blood flow was observed. CONCLUSIONS: The present study indicates that pulsatile choroidal blood flow increases with the progression of diabetic retinopathy. Increased retinal blood flow appears to be related to loss of colour sensitivity in patents with type 1 diabetes.

8.学位论文张娜伟SERPINF1、FGG、AHSG及TTR在妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中的表达2009

妊娠期高血压疾病是妊娠最严重合并症之一，严重影响母婴健康，是孕产妇和围生儿发病及死亡的主要原因之一。病因和发病机制至今尚未完全阐明。目前认为子痫前期—子痫的发病起源于胎盘病理生理改变，进一步导致全身血管内皮细胞损伤，后者引起子痫前期的一系列症状。

本次实验基于本研究组之前重度子痫前期患者血清的蛋白组学的分析结果，利用排除法降低血清中白蛋白及其他足量蛋白的浓度，使可能为潜在致病因子的微量蛋白得以鉴别，然后经质谱分析，鉴定出差异蛋白93种，其中45种表达下调，48种表达上调。在这些差异蛋白中，仍不乏一些免疫球蛋白及补体蛋白等，从中筛选出SERPINF1、FGG、AHSG及TTR四种兴趣蛋白，研究其在妊娠期高血压疾病患者胎盘中的表达情况，以进一步探讨其与子痫前期发病之间的关系。鲜见关于SERPINF1、FGG、AHSG及TTR与妊娠期高血压疾病之间关系的报道。

SERPINF1(serpin peptidase inhibitor)，为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员之一，又名色素上皮衍生因子(pigment epithelium—derived factor，PEDF)，具有抗肿瘤形成，抗分解代谢及分化活性等多种功能。正向调节神经生长，负向调节血管生成，参与细胞增殖及多细胞器官的形成。来源于视网膜色素上皮细胞及脉络膜、胎盘、脑、胰腺及其他组织。PEDF的缺失可能与致癌相关。未见妊娠相关研究。

FGG(fibrinogen gamma chain)，人纤维蛋白原γ链，具钙离子结合功能，参与纤维素的聚合作用和交联，参与纤维蛋白溶解作用的启动，结合并调节XIII因子的活性，和血小板及其他细胞的相互作用，介导凝血酶与纤维素结合，以及抗凝血酶Ⅰ的凝血酶的抑制作用。FGG通过调节内皮功能和促进平滑肌细胞的增殖和迁移参与动脉粥样硬化斑块的形成

，并与血栓形成相关。

AHSG(Alpha-2-HS—glycoprotein)，又称胎球蛋白—A(fetuin—A)，是一种重要的胎儿糖蛋白，与血管的病理及骨代谢相关，参与急性期反应、胰岛素的细胞反应、大脑皮层发育、胰岛素受体信号通路的副调节、器官再生及调节炎症应答等，血清中含量较丰富，仅在肝脏，舌及胎盘组织中产生。研究发现AHSG为2型糖尿病的独立危险因子，与代谢综合征和致动脉粥样硬化的脂类代谢强相关。在妊娠中晚期，血清中此蛋白水平即发现有升高。

TTR(transthyretin)，甲状腺激素结合蛋白，是一种载体蛋白，主要于肝脏、脾脏和大脑脉络从中合成。具有激素活性，能够与激素、视黄醇和类固醇结合，负责转运血浆和脑脊液及中枢神经系统中的甲状腺激素，既往研究已在正常足月妊娠的胎盘滋养层细胞的胞浆中证实了此蛋白质的存在。

目的：探讨SERPINF1、FGG、AHSG及TTR在妊娠期高血压疾病患者胎盘中的表达情况，研究其与妊娠期高血压疾病发生的关系。

方法：本实验采用免疫组织化学方法检测45例妊娠期高血压疾病患者(包括：重度子痫前期和子痫、轻度子痫前期、妊娠期高血压和慢性高血压合并妊娠)和20例正常妊娠孕妇胎盘组织中SERPINF1、FGG、AHSG及TTR的表达情况，结果采用motic软件进行图像分析，记录阳性率及阳性目标平均灰度。数据采用多个独立样本秩和检验的Kruskal—Wallis H

test，组间差异进一步分析应用Nemenyi检验。

结果：

1、SERPINF1在妊娠期高血压疾病患者和正常妊娠孕妇胎盘中均呈阴性表达；FGG主要表达于胎盘绒毛血管内皮细胞中；AHSG主要表达于胎盘绒毛的合体滋养细胞和蜕膜细胞的胞浆及绒毛血管内皮细胞；TTR主要表达于绒毛的合体细胞及蜕膜细胞的胞核，也见于胞浆表达。

2、FGG、AHSG在各组胎盘表达比较中，其表达阳性率及表达强度均无明显差异，且FGG在胎盘中的表达稍弱。

3、各组间胎盘中TTR表达有差异，妊娠期高血压疾病组与对照组比较胎盘组织中TTR的表达明显降低(P<0.01)，且子痫与重度子痫前期组胎盘的表达同正常妊娠组比较具有极显著性差异(P<0.01)。

9.学位论文张卉拉坦前列素对毛囊生长、毛乳头细胞VEGF分泌以及黑素细胞黑素合成的影响2006

拉坦前列素(latanoprost)是前列腺素F2α的类似物，广泛应用于开角型青光眼的治疗，取得了满意效果。长期临床观察发现，开角型青光眼和眼压增高的患者局部应用拉坦前列素治疗时，绝大多数患者会出现睫毛增长、增粗、色泽加深、上下眼睑周围出现多毛表现、皮肤色素沉着。动物实验表明，拉坦前列素能明显促进毛发再生。总结拉坦前列素诱导毛发生长的主要表现为：①毛发增多，变得稠密，特别是终末期毛发比例增高；②毛发延长；③毛发增粗；④色素沉着，颜色加深；⑤与皮肤的角度变得陡峭；⑥毛发卷曲；⑦裂隙灯下观察发现眼睑的毳毛变得更丰富，变长、变黑、增粗。拉坦前列素诱导毛发生长的机制目前尚无确切结论，推测可能通过以下几方面发挥调节作用：诱导毛囊从休止期进入生长期；延长毛发生长期从而延长整个毛发周期；刺激毛乳头分泌多种细胞因子或生长因子从而间接促进毛发生长；调节黏附分子的表达；增加蛋白酶的合成等。

毛囊是一种结构复杂的皮肤附属器官，经历生长期、退行期和休止期的周期性循环。真皮乳头对诱导和维持毛囊的周期性循环是必不可少的，通过调控毛母质细胞数量进而影响其自身大小和功能，最终决定了毛干的直径和生长期的长短。已经知道毛乳头细胞能分泌多种生长因子，如胰岛素样生长因子(IGF)-1、成纤维细胞生长因子(FGF)-7、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等。最新研究发现VEGF能作用于毛囊，在毛囊的周期性循环和毛发生长中起着重要作用。研究发现抗VEGF的中和性抗体可以阻断重组VEGF和毛乳头起源的VEGF的活性，从而首次证实VEGF是毛乳头细胞的一种自分泌生长因子。目前认为VEGF调控毛囊生长的机制主要在以下两方面：

(一)促进毛乳头细胞的增殖和迁移研究发现，在体外培养的鼠触须毛乳头细胞中加入不同浓度的VEGF，发现VEGF可以明显促进毛乳头细胞的增殖和迁移，且其最大活性是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的2倍。VEGF可能是通过促进毛乳头细胞的增殖和迁移而调控毛囊的周期性循环和促进毛发生长。

(二)诱导毛囊周围的血管形成毛囊的周期性循环伴随着毛囊周围血管的相应变化，在毛发生长早期毛囊周围有大量血管形成，而至退行期和休止期血管则发生明显退化。研究发现，毛囊周围暂时性的血管生成与毛囊外根鞘的角质形成细胞中VEGFmRNA表达上调有关。用转基因方法使外根鞘角质形成细胞过度表达VEGF能强烈诱导毛囊周围血管形成，从而加速脱毛后毛发再生，并能使毛囊增大、毛干增粗。相反，系统应用中和性抗VEGF抗体则导致毛发生长迟缓、使毛囊减小。

黑素细胞是表皮中树突状细胞的一种，来源于神经嵴。黑素细胞的主要功能就是合成黑素，不同个体皮肤颜色的差异主要是由于黑素细胞合成黑素的种类和数量不同而造成的。黑素可分为两种：棕/黑色的优黑素和黄/红色的褐黑素。人类皮肤着色包括结构性和功能性两类：结构性着色由遗传决定，不受外界环境的影响。功能性着色是环境作用下的黑素合成基础水平的增加。

目前主要有关黑素合成的研究是围绕酪氨酸酶家族成员的调节展开的。酪氨酸酶是黑素合成的关键酶，该酶催化黑素合成早期限速步骤，即底物酪氨酸羟化和多巴氧化。黑素合成的速率与酪氨酸酶的量和活性直接相关。酪氨酸酶相关蛋白(TRP)-1和酪氨酸酶有着共同的催化活性，TRP-1的合成速率与黑素合成呈正相关。TRP-2催化多巴色素转化为5，6-二羟吲哚乙酸，催化黑素合成的后续步骤。翻译后的TYR、TRP-1、TRP-2糖基化过程都可以影响黑素合成。

拉坦前列素治疗青光眼的一个副作用是引起睫毛色泽加深、虹膜及眼周皮肤色素沉着，且长期临床观察发现，拉坦前列素引起虹膜色素沉着为不可逆性。对小鼠黑素瘤细胞、人葡萄膜色素细胞以及表皮黑素瘤细胞研究发现，拉坦前列素能显著提高小鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶活性，对人葡萄膜色素细胞和表皮黑素瘤细胞酪氨酸酶活性影响较小，但对上述三种细胞的cAMP诱导作用无显著性差异，因此认为拉坦前列素通过非cAMP途径诱导酪氨酸酶活性。另外还发现，拉坦前列素能提高小鼠黑素瘤细胞分裂指数，对人两种黑素细胞则无影响。对短尾猴虹膜黑素细胞研究发现，拉坦前列素治疗后优黑素合成量增加3～7倍，而褐黑素增量不超过25﹪。与对照组相比，优黑素或褐黑素合成约增加3～5倍。平行实验结果表明拉坦前列素对黑素细胞增殖无明显作用，且对虹膜其他不含黑素细胞的色素层无影响，这表明拉坦前列素直接作用于虹膜黑素合成系统从而引起虹膜色素沉着。对体外培养的牛虹膜黑素细胞、虹膜色素上皮细胞、视网膜色素上皮细胞和脉络膜黑素细胞研究发现，短期应用(3天)拉坦前列素并不能促进上述任何一种细胞增殖及黑素合成增加。

本课题的研究主要包括以下三方面：(一)采用体外培养的猪毛囊模型，观察拉坦前列素对其生长的影响近来研究发现，猪的皮肤和毛囊与人的皮肤和毛囊在结构、生理、毛发生长周期以及交叉抗原之间存在很多相似之处，因此食用型猪已越来越多地被皮肤科、外科、毒理学等领域用作实验研究的新模型。本实验采用猪毛囊体外培养的模型，通过显微镜下测量毛囊生长长度、记录其形态变化、观察培养结束后毛囊组织学结构，观察了拉坦前列素对其生长的影响。结果显示，拉坦前列素浓度达0.8ng/mL时即可显著促进毛囊生长，但随着拉坦前列素浓度升高，则未观察到毛囊生长和拉坦前列素浓度之间存在依赖性。而浓度达0.1μg/mL时，这种促进作用消失，浓度再度升高则显著抑制毛囊的生长。与阳性对照物米诺地尔、胰岛素样生长因子相比，拉坦前列素促毛囊生长作用与米诺地尔相当，弱于胰岛素样生长因子。体外培养第8天毛囊冰冻切片HE染色显示，0.8ng/mL拉坦前列素组毛囊仍保持生长期样外观，不发生或发生轻微的退行性改变；阴性对照组毛囊已发生退行性改变，真皮鞘和外根鞘变薄，毛球部萎缩，毛母质远离毛乳头，毛乳头变小或者消失。因此认为拉坦前列素对体外培养的猪毛囊生长具有明显促进作用，能延长毛囊的生长期。

(二)拉坦前列素对人毛乳头细胞增殖及分泌VEGF的影响本实验旨在观察拉坦前列素对体外培养的人毛乳头细胞增殖及分泌VEGF的影响，探讨拉坦前列素促毛发生长可能的机制。采用两步酶消化法分离纯化毛乳头细胞，贴壁后1天细胞开始迁出呈现放射状生长，2周后细胞绝大部分融合。取第4代细胞用于实验，选择0.16、0.8、4、20、100ng/mL5个浓度的拉坦前列素作用于毛乳头细胞72h，四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖活性，ELISA法检测细胞分泌的VEGF水平。结果显示，拉坦前列素对毛乳头细胞增殖无明显影响，浓度达

0.8ng/mL时即明显促进毛乳头细胞分泌VEGF，且随着浓度增高其促进作用增强。与阳性对照物米诺地尔相比，其促进VEGF分泌作用与之相当。因此，我们认为拉坦前列素可能通过促进毛乳头细胞分泌VEGF诱导毛发生长。

(三)拉坦前列素对人表皮黑素细胞增殖及黑素合成的影响取包皮环切术患者的包皮标本，两步酶消化法分离黑素细胞，取传2代后的纯化细胞用于实验。选择0.16、0.8、4、

20、100ng/mL5个浓度的拉坦前列素作用于黑素细胞72h，四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖活性，经典方法测定其酪氨酸酶活性和黑素含量。结果显示，拉坦前列素对表皮黑素细胞增殖无明显影响；浓度为4ng/mL时显著促进酪氨酸酶活性、增加黑素含量，且随着浓度增高，其作用增强。与阳性对照物8-MOP相比，其作用较弱。

10.外文期刊Kobayashi.S.Fukuta.M.Kontani.H.Yanagita.S.Kimura.I A quantitative assay for angiogenesis of cultured

choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats.

Angiogenesis of cultured choroids was quantitatively assayed in spontaneously diabetic GK and a bolus-treated streptozotocin (STZ)-diabetic Wistar rats. The number and total length of microvessels budded from cultured choroidal explants were measured to use as angiogenic indices. Both indices in 10-week-old Wistar rats were increased in parallel by 5% fetal bovine serum (FBS) from days 2 to 7 in culture. These indices in STZ-rats (10 weeks of age) were increased by 5% FBS to a greater extent than those in age-matched normal rats. These enhanced actions of FBS were concentration-dependent. The explants of 16-week-old GK rats also increased these indices to a greater extent than those of age-matched Wistar rats. Aging to 18 weeks of age also increased choroidal angiogenesis in the normal rats. In conclusion, the assay model of choroidal angiogenesis was established by determining the number and length of microvessels in cultured choroidal explants. The diabetic states of STZ-Wistar and GK rats enhanced FBS-induced choroidal angiogenesis. This assay model is useful for determining angiogenic activity of growth factors and effective drugs in diabetic choroidopathy and retinopathy.

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