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TaqMan探针技术原理

TaqMan探针技术原理
TaqMan探针技术原理

检测原理:

应用一对双标记Taqman探针,分别针对双等位SNP的不同基因型,只有完全匹配的探针扩增出各自对应的基因型;用两种荧光染料Fam,Hex(Vic)分别标记这两种探针,就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。

原理示意图

方法/技术特点

◆检测灵敏度高

◆分型准确

◆操作便捷

适宜范围:适于低、中通量的SNP检测

客户方提供

要检测的SNP位点信息;组织、细胞样品,保证样品质量见服务申请单。

服务方提供:每一步骤原始数据、证明材料及相关初步分析数据。服务流程

a目标基因引物、探针设计合成

b样品基因组抽提

c引物探针调试

d正式样品检测

检测周期

根据客户的样本量和检测基因的数目而定,如有特殊时间需求可加急。

验收标准:定量原始数据、测序图谱等,详见具体合同。

两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则

两种定量分析方法的比较及Taqman 探针、引物设计原则 遗传物质DNA 首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA (mRNA ),携带遗传信息的mRNA 从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合,在核糖体中mRNA 携带的遗传信息被翻译成为多肽,多肽经过进一步加工后变成蛋白质,至此遗传物质DNA 完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤,所转录的mRNA 的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少,所以通过对细胞内某条基因mRNA 含量多少的分析,就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。 定量PCR 仪是在普通PCR 仪的基础上加装了荧光激发装臵和荧光检测装臵,PCR 扩增和检测同时进行;在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术于1996年由美国Applied Biosystems 公司推出,由于该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR 相比,它具有特异性更强、有效解决PCR 污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。 定量PCR 常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct 值 扩增曲线:反映PCR 循环次数和荧光强度的曲线,定量PCR 仪每次轮PCR 扩增都会自动记录 荧光强度的变化 荧光阈值:样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,手动 设臵的原则要大于样本的荧光背 景值和阴性对照的荧光最高值,同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,并且保 证回归系数大于0.99。 CT 值: PCR 扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 扩增曲线 阈值及CT 值 荧光定量PCR 的数学原理 理想的PCR 反应: X=X0*2n 非理想的PCR 反应: X=X0* (1+Ex)n (n :扩增反应的循环次数;X :第n 次循环后的产物量;X0:初始模板量;Ex :扩增效率) 在扩增产物达到阈值线时 : C(t) value

两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则

两种定量分析方法的比较及Taqman探针、引物设计原则 遗传物质DNA首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA(mRNA),携带遗传信息的mRNA从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合,在核糖体中mRNA携带的遗传信息被翻译成为多肽,多肽经过进一步加工后变成蛋白质,至此遗传物质DNA完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤,所转录的mRNA的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少,所以通过对细胞内某条基因mRNA含量多少的分析,就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置,PCR扩增和检测同时进行;在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR 相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。 定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 扩增曲线:反映PCR循环次数和荧光强度的曲线,定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动记录荧光强度的变化 荧光阈值:样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值,同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,并且保 证回归系数大于0.99。 CT值: PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 C(t) value 扩增曲线阈值及CT值 荧光定量PCR 的数学原理

实时荧光定量 原理 taqman 探针简介

实时荧光定量 PCR技术原理与应用 聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后,我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析,也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析,分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下,我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质,随着 PCR 反应的进行, PCR 反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如图 1) 。 图 1 实时荧光扩增曲线图 一般而言,荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段 , 荧 光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光 背景信号所掩盖,我们无法判断产物量的变化。而在平台期,扩增产物已不再

呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段, PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便,在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念:荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值( threshold value )(如图 2 所示)。

Taqman设计总结

一、单重Taqman引物探针设计:(为了确保引物和探针的特异性,最好将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast中核实一次) 1、探针:探针的设计应该在引物的设计之前 ①长度:18~35(18~30之间最好、最常见),最长37;太长淬灭效果不好。 ② TM值:Primer Express软件计算出来的Tm值在66~72℃之间(最常见68~70℃), 最好为70℃,确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5~10℃,GC含量在30~80%(最好40%~70%),因此探针最好是富含GC的保守片段;(Primer Express:Do not expand the Tm range by more than 2 °C from the default range)。 ③探针位置:尽可能地靠近上游引物,上游引物的3' 端离探针的5' 端为1-20bp(一 般10个以内),最好是探针的5'端离上游引物的3' 有1个碱基。 ④5'端应避免使用碱基G,5' G会有淬灭作用,即使被切割下来这种淬灭作用也还 会存在;如果选择FAM-dye在5'端第二个序列也不能为G(G in the second position on the 5' end in FAM dye-labeled probes can reduce fluorescent normalized reporter signal)。 ⑤可选:整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量,G的含量多于C会降 低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。要同时考虑在正反两条链上设计引物与探针。若找不到完全保守的片段,也只能选取有一个碱基不同的片段,且这个不同的碱基最好在探针的中间,且最好为A或T。 ⑥Repeating oligonucleotides:a. 避免探针中同一碱基重复过多,尤其是要避免4 个或超过4个的G碱基出现,即≦3(Avoid runs of identical nucleotides. If repeats are present, there must be fewer than four consecutive G residues.);b. 避免连续的6个A出现(Consecutive A residues:Avoid six consecutive A residues anywhere in the probe. Consecutive A residues can cause a high No Template Control (NTC) signal);c. 避免探针的中间区域含有2个或以上的CC dinucleotides(Avoid two or more CC dinucleotides in the

TaqMan探针法实时荧光定量PCR的应用和研究进展

TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 的应用和研究进展 姜文灿,岳素文,江洪,王成彬 姜文灿,温州医科大学检验医学院、生命科学学院2014级硕士研究生。主要研究方向为分子生物学技术。 [摘要] TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 因其重复性好、特异性强、线性范围宽等特点在各个领域有着广泛的应用,内标系统的引入进一步提升了该方法的灵敏度,增加了其可靠性和实用性。然而,这一技术也因为假阴性和假阳性问题存在着改进的空间。本文从TaqMan 探针法的简介、研究进展以及应用前景展开综述。 [关键词] 实时荧光定量PCR ;TaqMan 探针;引物二聚体;内标系统 [中图分类号] R446.6-3 [文献标志码] A [文章编号] 2095-2775(2015)01-0797-09 Application and research progress of TaqMan probe real time PCR [Abstract] TaqMan real-time PCR has been widely used in various fields because of its good repeatability, strong specificity, wide linear range, etc. Import of the internal control (IC) system further improved the sensitivity of this method, consequently increased its reliability and practicability. However, there are still some improve rooms for this technique because of the false negative and false positive problem. Here we proceed a review for TaqMan real-time PCR cover its introduction, research progress and applicative prospect. [Key words] Real-time fluorescent quantitative PCR; TaqMan; primer dimer; IC [作者简介] 姜文灿,2014级硕士研究生。主要研究方向为分子生物学技术 [作者单位] 325000 浙江温州 温州医科大学检验医学院、生命科学学院(姜文灿,王成彬);100085 北京 北京泰格瑞分子检验有限公司(岳素文,江洪) [通讯作者] 王成彬,E-mail :wangcb301@https://www.sodocs.net/doc/8a4167931.html, 聚合酶链式反应 ( Polymerase Chain Reaction, PCR ) 是在体外模拟体内核酸复制从而获取大量目的基因拷贝的技术,最早由Mullis [1]发明。其几何级数的放大模式,相比于普通信号叠加的检测方法灵敏度提升了上百万倍,同时又因操作简便,成为核心技术之一。实时荧光定量 PCR 是在传统 PCR 基础上加入信号系统达到实时监测 PCR 扩增的目的,继承了传统 PCR 高灵敏度和操作简便的特点,同时实现了对样本的定量检测。根据信号基团的不同,实时荧光定量 PCR 可以分为染料法和探针法。非特异的染料法成本较低,但面临着类似于普通 PCR 非特异性扩增产物干扰的假阳性问题[2]。探针法中使用的探针多是 TaqMan 探针,与染料法相比,在一定程度上避免了假阳性问题的出现。现阶段, TaqMan 探针技术在医药卫生、农业科学、生物科学、政治法律等方面得到了广泛的应用[3-6]。 1 TaqMan 探针法简介 1.1 原理 TaqMan 探针的基本原理是利用扩增过程中Taq 酶的5’核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针,该探针5’端标记荧光报告基团,3’端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止探针在PCR 过程中延伸[7],当引物延伸至寡核苷酸结合位置时,Taq 酶可以将其切割成小片段,使报告基团和淬灭基团分开并发出荧光(图1),经过检测伴随扩增产物增加过程中荧光强度的增长对样本进行定量分析。现阶段使用的荧光报告基团有HEX 、FAM 、ROX 、JOE 、VIC 等[8],荧光淬灭基团主要有TAMRA 、BHQ 等。研究发现,BHQ 本身具有非常低的荧光背景,实用性

荧光定量PCR的原理及使用

荧光定量PCR的原理及使用 荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。其基本特点是:1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA,或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得,大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测,免除了标本和产物的污染,且无复杂的产物后续处理过程,高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法: 1、双链DNA内插染料 某些染料如SYBR GreenⅠ能选择性地与双链DNA结合,同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBR GreenⅠ可与新合成的双链DNA结合,产生的荧光信号与双链DNA成正比。 SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时,发出荧光;从DNA双链上释放出来时,荧光信号急剧减弱。因此,在一个体系内,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是:1、开始反应,当SYBR Green 染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时,SYBR Green染料释放出来,荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中,引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后,SYBR Green染料与双链产物结合,定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合 SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合,对DNA模板没有选择性,所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果,对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下,本法 是一种成本低廉的选择。 2、TaqMan探针技术原理 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术,其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合,所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中,包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC 等,3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q),如TAMRA等。当探针完整的时候,报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收,仪器检测不到信号。随着PCR 的进行,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断,报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收,即产生荧光信号。所以,每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步

TaqMan探针技术原理

TaqMan探针技术原理 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术,其核心是利用Taq酶的3′?5′外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合,所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中,包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC等,3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q),如TAMRA等。当探针完整的时候,报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收,仪器检测不到信号。随着PCR的进行,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其3′?5′外切核酸酶活性就会将探针切断,报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收,即产生荧光信号(图4)。所以,每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 图4 TaqMan探针的荧光信号产生机制 TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种:普通的TaqMan 探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-

Fluorescent Quencher),本身不产生荧光,可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团(图5),可以将探针的Tm值提高10?C左右。因此为了获得同样的Tm值,MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短,既降低了合成成本,也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下,短的探针比长的更容易设计。实验证明,TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。 图5 TaqMan MGB探针

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