农杆菌感受态制作

1. 挑取单克隆接种于2 ml YEB（含30 mg/l链霉素和100 mg/l利福平）液体培养基，28℃，250 rpm，振荡培养过夜（如用5 ml YEB，需培养36 h）；

2. 将菌液按1:100转移至200 ml YEB（含50 mg/l链霉素）培养液中，28℃，250 rpm，振荡培养至OD600=0.3（约4-5 h）；

3. 转入50 ml的无菌离心管，4℃，4000 rpm离心10 min，弃上清；

4. 用20 ml冰浴的HEPES（1 mM，PH 7.0）重悬；（刘堃师姐说可以用灭菌的一级水）

5. 4℃，4000 rpm离心10 min，弃上清；

6. 重复4、5步骤2~3次；

7 . 用2 ml冰浴的10％甘油重悬；

8. 每管100 μl分装于1.5 ml无菌的Eppendorf管中，-80℃保存，待用；

9. 用时取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融；

10. 加2 μl质粒DNA于100 μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀；

11. 取出细胞与质粒的混合物转入电击杯中（电击杯-20℃预冷，在1800 V高压下电击）；

12. 取出电击杯，加入800 μl预冷的YEB培养液（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5 ml离心管中，28℃，200 rpm振荡培养5 h；

13. 取30-40 μl菌液涂在含相应抗生素的YEB平板上，28℃倒置培养1.5~2 d。