尼古丁对雄性小鼠生殖能力的影响及其诱发的神经行为学效应跨世代
目录
摘要................................................................................................................................. I ABSTRACT .................................................................................................................. VII 缩略词表 ................................................................................................................... XVII 第一章绪论 (1)
1.1 吸烟对男性生育能力的影响 (1)
1.1.1 吸烟对男性精子质量的影响 (1)
1.1.2 吸烟影响精子的功能 (2)
1.1.3 吸烟影响辅助生殖结果 (3)
1.1.4 吸烟影响睾丸的生物学功能 (3)
1.1.5 吸烟和附睾的功能 (4)
1.2 烟草中的主要有害物质 (5)
1.2.1 尼古丁 (5)
1.2.2 重金属类物质 (6)
1.2.3 苯并(a)芘 (7)
1.3 吸烟影响男性生育能力的分子机制 (7)
1.3.1 氧化应激 (7)
1.3.2 DNA断裂 (8)
1.3.3 细胞凋亡 (9)
1.3.4环境吸烟及被动吸烟 (9)
1.4 吸烟引发的表观遗传学效应 (10)
1.4.1 获得性性状的跨世代传递机制 (10)
1.4.2 吸烟引发后代的健康问题 (12)
1.4.3 吸烟引发的DNA甲基化水平改变 (12)
第二章尼古丁对小鼠睾丸组织中蛋白表达谱的影响 (15)
2.1 背景介绍 (15)
2.2 实验仪器及材料 (17)
2.2.1 实验仪器 (17)
2.2.2 实验材料 (18)
2.3 实验方法 (20)
2.3.1 动物模型的建立 (20)
2.3.2 细胞培养及处理 (20)
2.3.3 密度梯度离心法分离小鼠生精细胞 (20)
2.2.4 蛋白质双向凝胶电泳 (21)
2.3.5 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (22)
2.3.6 比较蛋白组学分析 (23)
2.3.7 TRIzol法抽提组织总RNA及逆转录反应 (24)
2.3.8 实时定量荧光PCR (25)
2.3.9 蛋白质免疫印迹 (27)
2.3.10 计算机辅助精子分析 (29)
2.3.11 免疫荧光染色 (29)
2.3.12 基因组DNA的抽提及重亚硫酸盐处理 (30)
2.3.13 重亚硫酸盐测序及甲基化特异性PCR (32)
2.3.14 统计学分析 (35)
2.4 实验结果 (36)
2.4.1 尼古丁处理造成小鼠睾丸组织中蛋白表达谱的变化 (36)
2.4.2 蛋白组学分析结果的验证 (40)
2.4.3 差异表达蛋白的比较蛋白组学分析 (41)
2.4.4 尼古丁处理上调小鼠精子的运动性指标 (45)
2.4.5 尼古丁导致小鼠睾丸组织中精子细胞中PFN1表达上调 (46)
2.4.6 尼古丁处理降低小鼠睾丸组织中Pfn1基因启动子区域的DNA甲基化水平 (48)
2.5 讨论 (51)
第三章尼古丁对小鼠附睾组织中蛋白质表达谱的影响 (55)
3.1 背景介绍 (55)
3.2 实验仪器及材料 (57)
3.2.1 实验仪器 (57)
3.2.2 实验材料 (58)
3.3 实验方法 (60)
3.3.1 上游法分离纯化小鼠精子 (60)
3.3.2 小鼠精子体外获能检测 (60)
3.4 实验结果 (61)
3.4.1 尼古丁处理造成小鼠附睾组织中蛋白表达谱的变化 (61)
3.4.2 蛋白组学分析结果的验证 (65)
3.4.3 差异表达蛋白的比较蛋白组学分析 (66)
3.4.4 尼古丁处理抑制小鼠精子体外获能反应 (70)
3.4.5 SORD高表达主要集中于附睾小体中 (72)
3.4.6 尼古丁处理降低小鼠睾丸组织中Pfn1基因启动子区域的DNA甲基化水平 (74)
3.5 讨论 (78)
第四章父系尼古丁处理对雄性后代小鼠行为的影响 (81)
4.1 背景介绍 (81)
4.2 实验仪器及材料 (85)
4.2.1 实验仪器 (85)
4.2.2实验材料 (86)
4.3 实验方法 (88)
4.3.1 动物模型的建立 (88)
4.3.2 细胞培养及处理 (89)
4.3.3 动物行为学实验 (90)
4.3.4 RNA测序及后续生物信息学分析 (91)
4.3.5 microRNA的逆转录及Real-time PCR (92)
4.3.6 双荧光素酶报告实验 (94)
4.3.7 重亚硫酸盐测序及甲基化特异性PCR (97)
4.3.8 小鼠脑定位注射 (98)
4.3.9 统计学分析 (99)
4.4 实验结果 (101)
4.4.1 香烟烟雾处理造成小鼠动物行为学表型的改变 (101)
4.4.2 父系香烟烟雾处理造成F1代小鼠的行为学表型改变 (102)
4.4.3 尼古丁处理造成F0代小鼠的抑郁表型 (103)
4.4.4 父系尼古丁处理造成F1代小鼠的行为学表型 (105)
4.4.5 尼古丁处理造成小鼠精子中Wnt4转录本高表达 (106)
4.4.6 父系尼古丁处理引发后代雄性小鼠脑组织中Wnt4通路的活化 (109)
4.4.7 F1代小鼠丘脑中表达的WNT4激活海马区的Wnt4通路 (111)
4.4.8 父系尼古丁处理导致F1代小鼠脑组织中mmu-miR-15b表达下调 (114)
4.4.9 尼古丁引发小鼠mmu-miR-15b启动子CpG岛滩区域高甲基化 (117)
4.4.10 小鼠丘脑中过表达WNT4及mmu-miR-15b引发其行为学表型 (121)
4.4.11 父系尼古丁处理引发的F1代小鼠的动物行为学表型没有传递到F2代 (126)
4.5 讨论 (130)
第五章全文总结 (135)
参考文献 (137)
附录：主要实验试剂的配制方法 (149)
致谢 (161)
攻读博士学位期间已发表或录用的论文 (163)