蛋白表达步骤

1．培养基的配制

原理

https://www.sodocs.net/doc/8e14242382.html,/link?url=B2SX0TUS5KB2ovXQcKyds9MS9OnW7y5Yn204CH3vg44Fs TWICJAnwePCb013a9T-vzmX5g9oCbv6GSuPahN6jfA9hVhQXCd3QCMZ_NTscu7

步骤

LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。

LB培养基的配制：

成分

胰蛋白胨(tryptone)

10g

酵母提取物(yeast extract)

5g

氯化钠(NaCl)

10g

固体培养基另加琼脂粉15-20g

加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min

配制方法

（1）称量分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl，置于烧杯中。

（2）溶化加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。

（3）调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。

（4）定容将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。

（5）加琼脂加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。

（6）分装、加塞、包扎。

（7）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。

2、大肠杆菌菌种活化

原理

菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中进行培养，逐级增大培养是为了得到纯而壮的培养物，可以理解为就是为了获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物进行培养。菌种发酵一般情况下需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境

中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就首选需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际和国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。

对于不同的保存方式活化的方式也不同：

1 定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可；

2 液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次；

3 沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面；

4 真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养；

5 -80℃冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养

6 液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安

瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。

步骤

总结一下菌种活化需要以下几个步骤：

第一配置菌种适宜生长的培养基

第二将菌种从保藏状态恢复到室温状态，比如将冷冻的菌种解冻

第三将通过操作将保藏的菌种接种到培养基中培养，此步骤称为菌种复壮

第四步挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的培养基中培养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的菌落经过这四个步骤就到达将菌种从保藏状态活化的最终目的.

举例大肠杆菌菌种活化方法：配活化培养基（LB）：活化大肠杆菌配方：0.5g酵母粉，1g蛋白胨，1g氯化钠，稀释到100ml复苏细胞（去掉DMSO及冷冻过程中产生的有毒物质）

材料：液氮中的细胞共1毫升：含20%血清（FBS），10%DMSO（防止细胞内产生冰晶），培养基

步骤：一、从液氮（约-190度）中取出细胞（管中有1ml细胞）（稍微抖掉液体）二、快速放入37度水浴1分钟。三、加入1ml DMEM 培养基融化冰晶。

四、全部移入离心管中，管口封口膜封口；五、离心：1200r/min，5min。六、去上清（用大枪（1-5ml）一次吸出，吸时沉淀朝上）；G2 细胞沉淀较明显

七、先（用1ml 小枪）加到离心管中1 ml培养基并吹打吸出到培养瓶中，再加1 ml培养基润洗离心管吸出到培养瓶中，然后用大枪加3ml培养基到培养瓶中（补足5毫升）；八、培养瓶放入37度温箱。

3、质粒的提取

一、导论

已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤:

细菌培养物的生长。

细菌的收获和裂解

质粒DNA的纯化。

(一)细菌培养物的生长

从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体(如pUC系列)都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DNA。然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像pBR322-类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。

(二)细菌的收获和裂解

细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素:质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。

1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的

细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。

2)加200μl新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ

0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)

1%SDS

盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。

3)加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ

溶液Ⅲ

5mol/L乙酸钾60ml

冰乙酸11.5ml

水28.5ml

所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。

盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后

将管置于冰上3-5分钟。

4)用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。

5)可做可不做:加等量酚:氯念，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚:氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。

6)用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合，于室温放置2分钟。

7)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟。

8)小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

9)用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8)所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。

i.此法制备的高拷贝数质粒(如Xf3或pUC)，其产量一般约为:每毫升原细菌培养物3-5μg。

ii.如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量离心管内，加1μl 10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶，在适宜温育1-2小时。将剩余的DNA贮存于-20℃。

iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物:

3.煮沸裂解

1)将细菌沉淀，所得重悬于350μlSTET中。

STET

0.1mol/L NaCL

10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)

1mmol/L EDTA(pH8.0)

5% Triton X-100

2)加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。

3)将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。

4)用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。

5)用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。

6)在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠(pH5.2)和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。

7)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。

8)小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。

9)加1ml 70%乙醇，于4℃以12 000g离心2分钟。

2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。

3)一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株)用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时

它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。

4)当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101)中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚:氯仿进行抽提)可以避免此问题。

5)目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。

(三)质粒DNA的纯化

常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA 的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和(每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子)。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭

的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度的质粒。

二、质粒DNA的小量制备

细菌的收获和裂解

收获

碱裂解法

煮沸裂解

质粒DNA小量制备的问题与对策

质粒DNA的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法

(一)细菌的收获和裂解

1.收获

1)将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好(不盖紧)的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。

2)将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。

3)吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

2.碱裂解法

1)将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。

溶液I

50mmol/L葡萄糖

25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)

10mmol/LEDTA(pH8.0)

溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。10)按步骤8)所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体(2-5)分钟。

11)用50μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。

注:当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株(endA+株，如HB101 )中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg2+存在下温育(V中用限制酶时)质粒DNA可被降解。在上述方案的步骤9)之间增加一步，即用酚:氯仿进行抽提，可以避免这一问题。

(二)质粒DNA小量制备的问题与对策

裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题:

1)有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚:氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。

2)在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。

三、质粒DNA的大量制备

在丰富培养基中扩增质粒

细菌的收获和裂解

收获

碱裂解法

(一)在丰富培养基中扩增质粒

许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2-5mg质粒DNA，而且重复性也很好。

1)将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期(DNA 600约0.6)。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。

2)将含相应抗生素的500ml LB或Terrific肉汤培养基(预加温至37℃)施放入25ml 对数晚期的培养物，于37℃剧烈振摇培养25小时(摇床转速300转/分)，所得培养物的OD600值约为0.4。

3)可做可不做:加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇)，使终浓度为170μg/ml。像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒(如pUC质粒)可复制达到很高的拷贝数，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。

4)于37℃剧烈振摇(300转/分)，继续培养12-16小时。

(二)细菌的收获和裂解

1.收获

1)用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。

2)将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。

STE

0.1mol/L NaCl

10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)

1mmol/L EDTA(pH8.0)

2)按步骤1)所述方法离心，以收集细菌细胞。

2，碱裂解法

1)将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[ 来自收获细菌的步骤3] 重悬于10ml(18ml)溶液I中。

溶液I

50mmol/L葡萄糖

25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)

10mmol/L EDTA(pH8.0)

溶液I可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

2)加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。

3)加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ

0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)

1%SDS

盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。

4)加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。

溶液Ⅲ

5mol/L乙酸钾60ml

冰乙酸11.5ml

水28.5ml

所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。

封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。

5)用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤4)]。

6)上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。

7)用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于4℃离心，盐也会了生沉淀。

8)小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70%乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，

于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。

9)用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。

10)纯化。四、质粒DNA的纯化

聚乙二醇沉淀法质粒DNA

氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA

(一)聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA

1)将核酸溶液所得]转入15mlCorex 管中，再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用合适转头于4℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。

2)将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇，充分混匀，用SorvallSS34转头(或与其相当的转尖)于室温以10 000转/分离心10分钏，回收沉淀的核酸。

3)小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。

4)用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml )的TE(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。

5)加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟，以回收质粒DNA。

6)吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚:氯仿、氯仿各抽1次。

7)将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2倍体积(约1ml)乙醇，于室温放置10分钟，于4℃以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA。

8)吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。

9)吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。

10)用500μl TE(pH8.0)溶解沉淀1:100稀释[用TE(pH8.0)] 后测量OD260，计算质粒DNA的浓度(1OD260=50μg质粒DNA/ml)，然后将DNA贮于-20℃。

IPTG诱导

原理

https://www.sodocs.net/doc/8e14242382.html,/link?url=nFHCAi4blrX0oT46l7hBUNP1nOqsde2GY_KNW moivU7QlE5Z6dBiqK1uPAYDuuprKiXJPAUsAKhrJCUHICJT0qtFPeLKVv1gxlHB XT8L7hq

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤

E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

材料

1、诱导表达材料

( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基

酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10g

NaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%

蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0

适用范围：大肠杆菌

( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。

( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：

50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )

50 mmol / L DTT

2 % SDS （电泳级）

0.1 ％溴酚蓝

10 ％甘油

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

1 ）酶溶法

（1）裂解缓冲液：

50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。

（3）10 mg / mL 溶菌酶。

（4）脱氧胆酸。

（5）1 mg / mL DNase I。

2 ）超声破碎法

( 1 ) TE 缓冲液。

( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：

100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )

100 mmol / L DTT

4 %SDS

0.2 ％溴酚蓝

20 ％甘油

实验方案

1、外源基因的诱导表达

1) 用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因；

2) 按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到转化DH5α感受态细胞中；

3) 分别挑取单菌落接种于5 mL LB ( 0.1 g·L-1 氨苄青霉素)中，37℃培养过夜；

4) 以2 %体积比转接于2 ml LB( 0.1 g·L-1 氨苄青霉素)中，37℃继续培养2.5 hr，至细菌对数生长期，加0.1mmol/L IPTG 2 μl 诱导3-4 hr，同时设立不加IPTG 诱导作为对照；

5) 取上述菌液1 mL，12000 rpm 离心10min，收菌沉淀；

6) 重悬于冰的100 μl PBS 中，加入PMSF 至终浓度为10 mmol/L。震荡器震荡混匀，加入2×加样缓冲液，煮

沸10 min 变性，12,000 rpm 离心10 min；

7) 分别取诱导前和诱导后的样品10 μl 进行SDS-PAGE 电泳分析。

（PS：如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 ℃培养数小时，使培养液的OD600 达0.4-0.6，迅速使温度升至42 ℃继续培养 3 -5h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 ℃培养细菌数小时达到对数生

长期后加IPTG 至终浓度为 1 mmol / L，继续培养 3 -5h）。

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化

1 ）细菌的裂解

常用方法有：①高温珠磨法；②高压匀浆；③超声破碎法；④酶溶法；⑤化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法①、②已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为：

人SRY基因表达及表达蛋白的结合功能研究

人SRY基因表达及表达蛋白的结合功能研究 院系：生命科学学院 专业：生物工程 班级：122 学号：2012031202 姓名：陈志强 日期：2015年6月28日 【摘要】研究人类性别决定基因(sex determining region on the Y chromosome,SRY)表达蛋白对下游基因的调节作用。将SRY基因HMG结构域片段与表达载体PET-15b-进行重组，构建了SRY基因的表达质粒PETSY，转入大肠杆菌中表达，组氨酸结合树脂柱纯化表达蛋白，与苗勒氏管抑制因子基因(Müllerian inhibiting substance,MIS)启动子区片段进行凝胶电泳阻滞试验及竞争试验。获得SRY基因表达蛋白，分子量接近20.8U(21kD)，凝胶电泳阻滞试验及竞争试验表明，SRY表达蛋白能特异结合位于19号染色体的MIS基因的启动子区。提示SRY基因对MIS基因转录具有调节作用。 【关键词】性别决定基因基因表达苗勒氏管抑制因子基因蛋白结合功能 前言 SRY基因作为睾丸决定因子(testis determining factor,TDF)的候选基因于1990年被Goodfellow定位在Y染色体短臂上之后，各种性别发育异常与SRY基因突变、缺失、异位等的研究相继报道。而SRY基因在性别发育过程中是如何起作用的，一直是人们关注的课题。目前认为SRY基因是在睾丸分化发育中起着开关式的重要调节作用的基因之一，其编码的蛋白具有DNA结合功能，属HMG结构域的转录因子家族。Haqq等［1］对SRY基因表达蛋白功能进行研究的结果提示SRY蛋白在调节下游基因中起重要作用。MIS是在性别发育过程中通过

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种

1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)

第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天

1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS

蛋白表达步骤

1．培养基的配制 原理 wenku.baidu./link?url=B2SX0TUS5KB2ovXQcKyds9MS9OnW7y5Yn204CH3vg44FsT WICJAnwePCb013a9T-vzmX5g9oCbv6GSuPahN6jfA9hVhQXCd3QCMZ_NTscu7 步骤 LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。 LB培养基的配制： 成分 胰蛋白胨(tryptone) 10g 酵母提取物(yeast extract) 5g

氯化钠(NaCl) 10g 固体培养基另加琼脂粉15-20g 加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min 配制方法 （1）称量分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl，置于烧杯中。 （2）溶化加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。 （3）调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。 （4）定容将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。 （5）加琼脂加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。 （6）分装、加塞、包扎。 （7）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。

2、大肠杆菌菌种活化 原理 菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中进行培养，逐级增大培养是为了得到纯而壮的培养物，可以理解为就是为了获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物进行培养。菌种发酵一般情况下需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境 中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就首选需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际和国常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。 对于不同的保存方式活化的方式也不同： 1 定期移植法的菌种复较简单，直接转接即可； 2 液体石蜡法保存的菌种在复时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次；

重组蛋白表达系统的选择

重组蛋白表达系统的选择、表达策略和方法学研究 宁

1. 前言 在生命科学的很多研究和应用领域中，如何获得大量、均一、高纯、有活性的蛋白质都是一个关键问题。现代重组蛋白表达技术为我们提供了多种选择：传统的大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达系统以及较新的植物和体外表达系统。每种表达系统都有很多成功的例子，但重组蛋白的个性不尽相同，没有任何一个系统和方法是普遍适用的，为目的蛋白选择一个恰当的表达系统也就成为表达工作的重中之重。 关于目的蛋白的一切信息，对表达系统的选择都是有帮助的，有几个最基本的问题一定要在表达之前回答清楚：目的蛋白的来源是原核还是真核生物？具有什么样的功能？分子量和聚合状态？是膜蛋白还是水溶蛋白？胞表达还是分泌表达？是否需要以及需要何种翻译后修饰？有没有配体、底物或产物类似物可以利用？对蛋白酶是否敏感？有多少分子及分子间二硫键？对目的蛋白的表达量、活性、表达速度和成本有怎样的要求？除了摸清目的蛋白的脾性，还要清楚各个表达系统的特点、优势和局限性，才能找到表达工作的大略方向，要获得最适合目的蛋白的表达方案，还需要在具体实验中调整优化。 表1比较了目前常用的表达系统的特点，并给出了粗略的适用围。 大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞流程简单简单复杂复杂 培养基简单简单复杂复杂 成本低低中高 产率高中中低 表达量高高较高较低 蛋白折叠中较好较好好 胞外表达周质空间分泌至培养基分泌至培养基分泌至培养基 细胞增殖周期30min 90min 18H 24H 折叠常有错误折叠偶有不当折叠正确折叠正确 二硫键难以形成有有有 N-糖基化无甘露糖残基，高无唾液酸，简单复杂 O-糖基化无有有有 磷酸化无有有有 酰化无有有有 γ-羧基化无无无有 适用原核蛋白、简单 真核蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 复杂高等真核生 物蛋白 表1：常用表达系统比较

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤 E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 材料 1、诱导表达材料 ( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基 酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2% 蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围：大肠杆菌 ( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃ 保存。 ( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液： 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS （电泳级） 0.1 ％溴酚蓝 10 ％甘油 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

蛋白表达步骤

1．培养基的配制 原理步骤 LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的 lysogeny broth，即溶菌肉汤。 LB培养基的配制： 成分 胰蛋白胨(tryptone) 10g 酵母提取物(yeast extract) 5g 氯化钠(NaCl) 10g 固体培养基另加琼脂粉 15-20g 加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约）调pH至，121℃灭菌30min 配制方法 （1）称量分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl，置于烧杯中。 （2）溶化加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。 （3）调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至。 （4）定容将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。 （5）加琼脂加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。 （6）分装、加塞、包扎。 （7）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。

2、大肠杆菌菌种活化 原理 菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中进行培养，逐级增大培养是为了得到纯而壮的培养物，可以理解为就是为了获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物进行培养。菌种发酵一般情况下需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境 中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就首选需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际和国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。 对于不同的保存方式活化的方式也不同： 1 定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可； 2 液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次； 3 沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面； 4 真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养； 5 -80℃冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养 6 液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。 步骤

分子生物学第一篇基因表达调控和蛋白质修饰

分子生物学第一篇: 基因表达调控和蛋白质修饰 基因组(Genome): 生物个体所携带遗传性物质的总量。即细胞中的DNA总量，或病毒的DNA或RNA量 “C值悖论”(C-value paradox): C值:一种生物细胞中特异不变的DNA总量（单倍体基因组）。物种的C值和它进化的复杂性之间没有严格的对应关系，这种现象称为C值悖论。基因表达(Gene expression): 在一定调控机制下基因经过激活、转录、翻译、等过程产生具有生物学功能分子从而赋予细胞一定功能或表型，即基因的转录和翻译的过程。 基因表达调控（Regulation of gen expression): 细胞或生物体接受环境信号刺激或适应环境营养状况变化在基因表达水平上作出应答的分子机制。这包括对表达基因种类和数量上的调调控。 基础基因表达(basic gene expression)：又称持续性/组成型基因表达(constitutive gene expression）: 不易受环境变化而改变的基因表达。这其中包括一类“管家基因(housekeeping genes)”, 这类基因产物是细胞生存活动所必需的，在个体各生长阶段都表达。 可调节基因表达(regulated gene expression):易受环境变化而改变的基因表达。对环境应答时被增强表达的过程称为诱导(induction), 被激活的基因称为可诱导基因(inducible genes)；对环境应答时被抑制表达的过程称为阻遏repression)，被抑制的基因称为可阻遏基因(repressible genes) 基因表达规律:组织特异性(tissue specificity)时间特异性(temporal specificity) 基因表达调节的生物学意义: (一) 适应环境，维持生长和增殖 (二) 维持个体发育与分化. 真核细胞的结构特性: 1、庞大基因组，结构复杂，大量重复序列，基因组大部分是非蛋白质编码的序列，基因内部常被内含子(intron)隔开 2、结构基因转录产物是一条单顺反子(monocistron)mRNA,基本上没有操纵元件的结构，而且真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽链形成的亚基构成的，涉及到多个基因的协调表达。

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤 发布日期:2008-12-17 热门指数:21114 分享| 收藏 E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I 序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 材料 1、诱导表达材料 ( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基 酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2% 蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围：大肠杆菌 ( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－2 0 ℃ 保存。 ( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液： 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS （电泳级） 0.1 ％溴酚蓝 10 ％甘油 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

IPTG诱导表达蛋白步骤

IPTG诱导表达蛋白步骤 15-11-3 配固体培养基和液体培养基，灭菌。 配BindingBuffer和脱盐液各500ml。在400ml体积时调节溶液pH值至7.4，定容后转到试剂瓶中。溶液使用前要抽滤（滤除溶液内的气泡和不溶性杂质）。倒板：（5个灭菌的培养皿） ①微波加热溶解固体培养基 （每次加热30s待有沸腾的迹象时，减少加热的时间）。 ②超净台操作，以1?1000的比例（1ml培养基~1μl抗生素）向培养基中加入Kan+(50mg/ml)，摇匀。 ③倒板。 ④培养皿放置在超净台上凝固， 凝固后将培养皿倒着放入培养箱 中 15-11-4 热转化： （将质粒导入大肠杆菌中） ①提前将大肠杆菌（冰上融化）和质粒拿出来融化，混合（冰上操作）后冰上放置 30min。 ②42℃热水浴1min（超过90s会损伤细菌），取出后立即放在冰上冷却2~3min，加入1mlSOC培养基。③摇床上摇45min，150rp，37℃。（使菌体复苏） ④离心，

3000rpm3min。 ⑤涂板：取200μl上述液体，喷到板上，用玻璃涂布棒涂匀，放入培养箱中30min晾干后倒着放置。（12~16h） 15-11-5配IPTG（0.2g/ml），用灭菌水，超净台操作。 挑单克隆：将细菌放入培养液中，以便进行扩大培养和后续实验） ①提前准备好几支装有 3ml 培养基的试管，每管加入3μl Kan+抗生素(50mg/ml)，塞好塞子，试管倾斜，是抗生素溶入培养液中。（塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌）。 ②小镊子过火灭菌后，夹取一个枪头，在培养皿上挑一个单个的菌落，轻轻划过。将带有菌落的枪头放入试管中，塞好塞子（试管中培养基液澄清） ③将试管放在摇床中培养一晚，37℃,250rpm。（尽量不超过12h）【试管中培养基液变混浊】注意：操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。 15-11-6 扩大培养、诱导表达 ①以（抗生素?培养基）1?1000的比例向培养基中加入Kan+抗生素，摇匀后再加入（100ml培养基）1ml单克隆溶液，摇匀。 ②摇床上放置2.5h,37℃,180rpm ③以48μl IPTG/100ml培养基的比例加入IPTG诱导，移去牛皮纸，恒温摇床上摇6h， 30℃,180rpm。冰上放置一晚（抑制细胞生长 速率，有利于蛋白质充分折叠）

基因和蛋白不一致的分析

这是我最近实验遇到的问题，拿出来请教一下各位 我的目的基因经real-time pcr 验证，在病灶区和非病灶区中，20多对样本，两两对照，最低的表达差异也要高出10倍。 但是我用western和组化研究蛋白时，发现表达几乎无差异。我在考虑可能是什么可能使得目的基因在mrna水平上变化如此之大（我认为这变化应该和我研究的疾病有关，可能是疾病的因，也可能是果，不然不会在疾病中表达差异这么明显这么一致，不知各位同意否），以便设计我下面的实验。 我想出来的可能性： 1、可能我的目的基因位于基因组拷贝数变化的一个区域内，可能是它相邻的基因在疾病中发挥了作用，但是我用real-time做过它相邻的基因，没有变化，因此我基本否认了这个猜测。 2、也可能是另一种蛋白高表达引起了这个疾病，而这个蛋白可能同时又调控我研究的目的基因的表达，不知这样的猜测应该如何设计实验进行验证比较好？ 因为才疏学浅，只想到了这两种可能性，因为请问还有没有其他的可能性呢？望版上各位不吝赐教。 首先建议验证qPCR assay的重复性和可靠性。 2. 有无在mRNA水平由于alternative splicing而引起的两者水平不一致？ 关于这个问题，要分开两步来分析。 第一，在mRNA水平，你用不同的样本、多次qPCR均有10倍以上的差异，相信你的结果是非常肯定的，这一结果不用怀疑； 第二，在蛋白质检测水平，你用免疫组化与western blot均证实该抗体的信号没有明显差异，个人觉得这个结果也应该比较肯定的； 但是，两者的不一致导致你的怀疑，难以解释。从mRNA到蛋白一般来说很少出现这样的差异，至于alternative splicing的可能，你可以认真检索一下该基因是否存在splicing而产生的多个transcriptor，而你的引物又刚好引起了这种差异。因为现在的引物设计软件是比较严谨的，这种原因可以分析出来。由于这个基因不是新的，所以很多信息都可以查到，这个问题很容易解决。 到于蛋白质的检测要受到抗体特异性的限制，你所使用的抗体是否是国际公认的大公司所生产的，有没有其它文章已经使用过并且证明特异性很好；能否找一个该基因明显变化的细胞模型，然后用qPCR与western检验一下该基因的变化。 还有一种非常低级、概率非常低的可能，就是你所买的抗体根本就不是你所

镍柱子纯化表达蛋白的具体步骤

镍柱子纯化表达蛋白的具体步骤，注意事项！！！ 1、过柱前的注意事项： a、样品必须澄清、无颗粒物，否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命； b、包含体洗涤的最后一步及溶解时所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME； c、确保样品及Binding Buffer中有适量的NaCl，以防止杂离子与Ni离子竞争； 2、过Ni柱的操作步骤： a、用去离子水洗涤，洗去20％的乙醇、除尽基质中的空气，并能防止下一步中Ni离子沉淀； b、5×柱体积的Charge Buffer（50mM NiSO4）充电； c、5×柱体积的去离子水洗涤，去游离的Ni离子； d、10×柱体积的Binding Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑，pH8.0）平衡； e、上样（手工上样，样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定）； f、20×柱体积的Washing Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,20-50mM咪唑，pH8.0）洗涤，至无蛋白检出，收集流出液； g、Elution Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,500－1000mM咪唑，pH8.0）洗脱，每次1ml，应呈现正态分布（两边稀，中间浓）； h、10×柱体积的Binding Buffer洗涤。此时，即可用于纯化同种蛋白，很少需要重新充电。 注：同种蛋白纯化5～10次后，应进行strip和re-charge。 3、柱的清洗与保存： a、去Ni离子：a、5×柱体积的Strip Buffer（20mMTris-HCl,0.5M NaCl,50mM EDTA，pH7.4）洗涤； b、10×柱体积的去离子水洗涤。 b、去沉淀的蛋白质：a、5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr；b、去离子水洗涤，至流出液的pH值为7。 c、保存：20％乙醇洗涤，再加20％乙醇保存于4℃。

原核表达步骤

原核表达步骤

Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O

中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

实验三 重组蛋白的表达及Western boltting鉴定

实验三重组蛋白的表达及Western boltting鉴定 一、实验内容 1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。 2．重组蛋白的Western boltting鉴定。 二、实验要求 通过实验，要求学生掌握外源基因在原核细胞中表达的方法，掌握Western bolt的基本原理、实验操作步骤及注意事项。 三、实验方法 1．重组蛋白的原核表达与SDS-PAGE分析 （1）将含有重组质粒的细胞在LB平板（含抗生素）上划线，37℃培养过夜。（2）从LB平板挑取单菌落分别移至2 mL的LB培养液（含抗生素），37 ℃振荡培养过夜。 （3）将过夜培养物按1：100转接于2 mL的LB培养液（含抗生素），37℃继续振摇培养至细菌生长对数中期（OD600值达0.5～0.6）。 （4）加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37℃诱导表达3～6 hr。 （5）取200 μL菌液装入1.5 mL Eppendorf管中，以5000 rpm离心1 min，得到菌体细胞。将细胞重悬于30 μL水，再加入10 μL 4 × SDS-PAGE加样缓冲液，混匀，100℃煮沸10 min后，12,000 rpm离心2 min，吸取上清转移至另一新的离心管中。 （6）样品取5~10 μL进行SDS-PAGE分析。 2．Western blot分析 （1）取4 μL阳性克隆诱导后的样品，利用15%SDS-PAGE电泳分离。 （2）用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。 a.将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡10 min。 b.裁剪与凝胶大小相同的NC膜，在电转移缓冲液中平衡10 min。 c.裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC膜、 凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。 d.按0.5 mA/cm2膜恒流电转移30～50 min。 （3）杂交 a.将NC膜在5%脱脂奶封闭液中室温反应1 hr。 b.TBST漂洗3 × 10 min c.转移膜至用TBST1：100稀释的一抗工作液（抗六个组氨酸单克隆抗体）中， 室温反应1 hr。 d.TBST漂洗3 × 10 min e.转移膜至用TBST1：2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔I gG

蛋白表达纯化流程

第一章蛋白表达纯化 一、诱导表达分析 1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜; 2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜; 3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时; 4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。 二、蛋白纯化 2.1重组蛋白的提取 2.1.1 提取缓冲液 20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。 Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。 2.1.2 方法 1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30 minutes at +4 °C)。 2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬； 3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。 4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。 5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分 析。 Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。 6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。 7)小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。

IPTG诱导蛋白质表达实验步骤总结

实验总结 IPTG诱导表达蛋白 15-11-3 配固体培养基和液体培养基，灭菌。 配Binding Buffer和脱盐液各500ml。在400ml体积时调节溶液pH值至7.4，定容后转移到试剂瓶中。溶液使用前要抽滤（滤除溶液内的气泡和不溶性杂质）。 倒板：（5个灭菌的培养皿） ①微波加热溶解固体培养基（每次加热30s，待有沸腾的迹象时，减少加热的时间）。 ②超净台操作，以1?1000的比例（1ml培养基~1μl抗生素）向培养基中加入Kan+抗生素(50mg/ml)，摇匀。 ③倒板。 ④培养皿放置在超净台上凝固，凝固后将培养皿倒着放入培养箱中。 15-11-4 热转化：（将质粒导入大肠杆菌中） ①提前将大肠杆菌（冰上融化）和质粒拿出来融化，混合（冰上操作）后冰上放置30min。 ②42℃热水浴1min（超过90s会损伤细菌），取出后立即放在冰上冷却2~3min，加入1mlSOC培养基。 ③摇床上摇45min，150rpm，37℃。（使菌体复苏）

④离心，3000rpm，3min。 ⑤涂板：取200μl上述液体，喷到板上，用玻璃涂布棒涂匀，放入培养箱中30min晾干后倒着放置。（12~16h） 15-11-5 配IPTG（0.2g/ml），用灭菌水，超净台操作。 挑单克隆：（将细菌放入培养液中，以便进行扩大培养和后续实验） ①提前准备好几支装有3ml培养基的试管，每管加入3μl Kan+抗生素(50mg/ml)，塞好塞子，试管倾斜，是抗生素溶入培养液中。（塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌）。 ②小镊子过火灭菌后，夹取一个枪头，在培养皿上挑一个单个的菌落，轻轻划过。将带有菌落的枪头放入试管中，塞好塞子 【试管中培养基液澄清】 ③将试管放在摇床中培养一晚，37℃,250rpm。（尽量不超过12h）【试管中培养基液变混浊】 注意：操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。 15-11-6 扩大培养、诱导表达 ①以（抗生素?培养基）1?1000的比例向培养基中加入Kan+抗生素，摇匀后再加入（每100ml培养基）1ml单克隆溶液，摇匀。 ②摇床上放置2.5h,37℃,180rpm。 ③以48μl IPTG/100ml培养基的比例加入IPTG诱导，移去牛皮纸，恒温摇床上摇6h，30℃,180rpm。冰上放置一晚（抑制细胞生长速率，有利于蛋白质充分折叠）

基因蛋白表达检测步骤

Western blot法测定蛋白表达 1 样品制备 称取100mg组织置于裂解液中充分匀浆，裂解液于4℃、12000rp m离心5min，取上清液。 2 定蛋白 利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定上清液中蛋白含量，将每个样品的蛋白浓度调至相同。上清液与5×SDS上样缓冲液按5：1(v:v)混合后，沸水浴中加热5min，离心取上清。 3 蛋白质上样及电泳 每个样品取20μL上清液上样(蛋白总量约50μg)，于20%SDS-PAGE电泳分离。样品首先在80V恒定电压下电泳。当染料显示样品接近分离胶顶端时，调节恒定电压为110V继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。 4 蛋白质转膜 电泳完毕后，卸下玻璃板并取出凝胶。遵循凝胶在负极，膜在正极的原则，按阴极–吸水纸–滤纸–凝胶–硝酸纤维素膜(NC)膜–滤纸–吸水纸–阳极的顺序将凝胶装配于转移装置上。200mA恒定电流条件下，4℃转移1h以上。转移完毕后，剪角标记NC膜，用1×丽春红染液染色以观察转膜效果。用TBS/T洗膜3次，每次5min。 5 封闭 用5％脱脂奶粉溶液封闭膜上的非特异位点，于4℃孵育过夜。 1.2.3.6 一抗孵育 加入一级抗体（工作浓度1：1000），4℃孵育过夜，使抗原抗体结合。一抗孵育结束后，用TBS/T洗膜3次，每次5min。 7 二抗孵育 加入HRP标记的二级抗体（工作浓度1：5000），室温孵育1h，以结合一级抗体。孵育结束后用TBS/T洗膜3次，每次5min。

8 ECL化学发光检测 按ECL试剂盒说明书方法曝光底片，显影、定影后保存胶片。 9 图像扫描及分析 将显影后所得条带扫描并保存为电脑文件，用Image J 图像分析软件对条带的灰度值进行分析。关键控制基因蛋白表达量以目的条带的灰度值与内参条带的比值代表目的蛋白的相对表达水平。

重组蛋白的表达

重组蛋白的概述 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化 不需要细胞破碎 表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空 间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生 长没有大的影响，通常可获得高的 表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端 在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤（待改进） 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、 Bl21 codon（DE3）等。 7、蛋白的诱导表达。 1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。 4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管，每次用一管，避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达，则扩大摇菌。 1）取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。 2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右（约 2.5h~3h），然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当 的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。 拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。 3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速140rpm左右。 4）将菌液6000rpm，4min，4度离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。 10、超声波裂解。 1）用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。 注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。 4.正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头 松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。 注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解