Ion torrent 文库构建流程 线粒体DNA建库
基因工程及其应用教学设计
第2节基因工程及其应用 孝义三中高一生物组张文 一、教材内容分析 基因工程是现代四大生物工程之一。《基因工程及其应用》是人教版高中生物必修2第6章第2节内容。本节内容主要包括三个方面，分两课时讲授。第1课时简要介绍“基因工程的原理”，第2课时介绍“基因工程的应用”及“转基因生物和转基因食品安全性”。本节内容是对前面所学育种内容的补充，是即贴近生活又远离生活的微观内容。由于在选修3中还有基因工程的介绍，因此本节的要求相对简单一些。 二、学情分析 对于基因操作的工具和基本步骤，内容抽象和复杂，学生接触少，会出现掌握不好，甚至理解错误的情况。虽然经过必修1的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，尽量通过生活化打比喻的方式和模型建构活动及采用多媒体动画形象化教学，并在教师引导下适时加强学生解决问题和运用图解等生物学语言归纳结论等方面的能力。切记不可讲的太多。 三、教学目标 1、简述基因工程的基本概念； 2、简述基因工程的基本工具； 3、简述基因工程的基本操作步骤； 4、通过基因工程的简介，鼓励学生积极探索新知和科学创新，树立一分为二的辩证唯物主义思想； 四、教学重点、难点分析 教学重点：基因工程的基本原理（概念、工具、操作步骤） 教学难点：基因工程的基本原理 五、教学思路 本节课主要解决如下几个问题：1）什么是基因工程？2）基因工程的主要原理是什么？3）基因工程的操作过程如何？4）基因工程有哪些方面的应用？如何看待转基因食品？由于本节内容和前面的育种内容联系比较紧密，因此可以让学生回顾前面几种育种方法的成果，再通过情景展现传统育种方法所不能达到的地方，进而引出基因工程，通过列举生活中的转基因成果让学生知道基因工程就在我们身边。而后通过与学生们所熟知的器官移植做对比，让学生理解基因工程的本质和操作过程。通过对转基因食品的讨论让学生树立辩证唯物主义观念。 六．教学策略及教学媒体 根据激趣原则，通过展示色彩绚丽的转基因生物图片入手，引出基因工程的概念，采取“引导—互动—探究”模式，即采用师生互动探究式教学，借助老师生活化打比喻和多媒体动画并安排学生制作模型活动从而使抽象的课程内容具体化，直观化和形象化。 七、教学设计流程图第1课时“基因工程的原理”
基因工程基本过程
基因工程基本过程 基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA 技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为"克隆"）和行使正常功能（称之为"表达"），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA 结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。 常用的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 主要过程有为四步： 一．获得目的基因 有多种方法可获得目得基因 1.构建cDNA文库分离目的基因 过程： （1）从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA的第一条链。 （2）以第一条链为模板，以反转录酶或DNA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二条链。 （3）在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。
（4）接头或衔接子连接。 （5）凝胶过滤分离cDNA。 （6）通过核酸探针法或免疫反应法从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。 2.人工化学合成法 适于已知的核苷酸序列且校小的ＤＮＡ片断合成，常用方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。 过程：先用以上方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡核苷短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形较长的ＤＮＡ片段，再用连接酶连接成完整的基因。 3.利用PCR技术直接扩增目的基因 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物，类似于DNA的天然复制过程，用ＰＣＲ法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。 二．载体的选择与制备 1.载体的选择（以质粒为例） ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。 (6)应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别 (7)应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。 (8)应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，且所产生的mRNA较为稳定。 (9)所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。 2.制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。
BAC文库构建
(转载)BAC文库构建技巧 (2011-07-21 09:39:20) 基因组DNA文库构建实验技巧 基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。 一、分离基因组DNA（gDNA） 毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA 的纯度。 二、处理基因组DNA 根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体（比如Epicentre的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。
构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA 片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。 构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。 需要注意： （1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。 （2）电泳以后，应该避免用紫外光照射目标DNA，紫外光照射DNA 会显著降低克隆效率。解决方法：把marker所在的部分凝胶切下，在紫外灯下做好记号， 然后以此为参考定位所需的片段。 （3）回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA被剪切，降低文库质量。 三、载体的选择
基因工程主要内容及流程
基因工程制药 姓名：惠霞 学号：2011506024 班级：2011级生技1 班
基因工程制药 一．基因工程制药常用的工具酶： 基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工具酶。 (一) 限制酶(Restriction enzymes) 限制酶即限制性核酸切酶的简称，是一类专一性很强的核酸切酶。与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。限制酶的种类 Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不大。 Ⅱ型酶：相对分子质量较小，为20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2＋。能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。 (二) DNA聚合酶(DNA polymerase) DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。 1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 2. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断Klenow 片断 3. T4噬菌体DNA聚合酶 4. 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶） 5. T aqDNA聚合酶及AmpiTaqTMDNA聚合酶 6. 反转录酶
（三）DNA连接酶（DNA ligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。 1. T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5'羟基之间形成磷酸二酯键。 2. 大肠杆菌DNA连接酶：用途较窄，不常用。 （四）基因工程中常用的其他酶 1. 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶） 2. T4噬菌体多核苷酸酶 3. 核酸酶（Nuclease） 4. 碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphodiesterase）：能催化去除单链或双链DNA和RNA 分子中的5' 磷酸基（脱磷酸作用）。分为细菌碱性磷酸酯酶（BAP），牛小肠碱性磷酸酯酶（CIP）。 二．基因工程制药中常用的克隆载体 载体：能在细胞进行自我复制的DNA分子就是外源DNA片段（基因）的运载体（Vector）,又可称为分子载体或无性繁殖载体。基因工程制药中常用的目的基因克隆载体主要有：质粒、λ噬菌体、M13噬菌体和粘粒。 （一）质粒 1.质粒（Plasmid）是一些存在于微生物细胞染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位。 2 常用的几种质粒载体 （1）pBR322及其衍生载体 pBR322 最早构建成功的较理想载体，分子质量2.6×106u，4.36kb，属松弛型复制，含有两个抗性基因（Tetr和Ampr），已确定32个限制酶切割位点的相对位置。BamH I
基因工程中为什么要建立基因文库
基因工程中为什么要建立基因文库？基因文库是如何建立的？ 基因文库是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 目的：当我们要对某一基因结构和功能进行研究时，首先要获得此基因，最简便的方法就是直接从基因文库中获取。 构建过程：将纯化的细胞基因组DNA用限制性内切酶消化，获得一定大小的DNA片段，将这些片段克隆到载体中，从而获得含有不同DNA片段的噬菌体，这就是基因组文库。 打个比方让你建图书馆，你就得把所有书分门别类放，以便于找。这么多书你一个人又搞不定，所以你得找一群人，一个人负责一部分，各自干各自的，然后最后一汇总就行了。 基因组文库和cDNA文库 一.基因组文库 用限制性内切酶切割整个基因组DNA，把所得的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。由此而得的克隆中每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段。这样的一套克隆便称作基因组克隆，而这些克隆中的一套基因组DNA片段则叫做基因组文库(genomic library)。 二.cNDA 文库的构建及应用 cDNA基因文库(cDNA library)是指以 mRNA为模板，在反转录酶及其他一系列酶的催化作用下所获得的双链cDNA，经与适当载体连接并转化到寄主细胞内进行扩增，由此而构成包含着相应基因编码
序列的一群克隆。与基因组DNA克隆不同，用作cDNA克隆的真核mRNA，其间隔序列早已在拼接过程中被删除，而由这种成熟mRNA 为模板转变而来的DNA基因，自然也不含有非编码序列。cDNA克隆除以 mRNA为起始材料这一优点外，其构建比较简易可行，而且由于每一个cDNA克隆都只含有一种mRNA序列，这样在选择中出现假阳性的概率也就较低。 随着分子克隆研究在理论和技术上的进步，cDNA 基因文库的构建不仅是分离基因的重要手段，也是当前真核分子生物学研究的强有力工具。首先，在基因工程的操作中，以cDNA为探针可从基因组文库中分离出相应的特异基因；其次，cDNA序列只与基因中的编码序列有关，有助于对真核生物mRNA结构和功能的认识；再者，cDNA 克隆还可以有效地分析真核基因的结构和功能。 cDNA文库（cDNA library)：指只包括在特定组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的所有的基因序列。 基因组文库(genomic DNA library)：指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机的同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA所有的序列。
基因工程的基本过程
基因工程的基本过程 基因工程主要包括几个过程： 1、目的基因的制备； 2、选择合适的载体，将目的基因与载体相连接生成重组DNA分子； 3、将重组DNA片段导入受体； 4、选择目的基因； 5、目的基因的表达。 对于整个基因过程来讲，目的基因的获取是关键，它直接涉及到产物，而且还影响到产物的量。很多在基因操作过程中，目的基因是很难获得的，所以通常采取先生成基因文库的方法，然后从基因文库中筛选。如果目的基因的序列以及它的调控等信息很清楚，可以直接通过PCR或cDNA获取，这样就大大减少了选择目的基因的盲目性，可以将整个过程简化为以下步骤： 图10-3-8 基因工程过程
(1)目的基因的分离和制备 目的基因是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。获得目的基因的方法很多，但也是十分困难的一步。目前获得目的基因有4条途径： 1.从生物基因组群体中分离目的基因 原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。 图10-3-1 限制性内切酶
限制性内切酶(restrictive enzyme)是20世纪60年代末在细菌中发现的，能水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，使一个完整的DNA分子切成若干段，每一种限制酶，都有自己特定的作用位点，而且切口或切下来的序列，往往是回文结构（palindromes）。例如Eco RI把GAATTC在GA之间切开，形成粘性末端。也有一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端，如HapI。多在原核生物中存在，能识别4～6个特苷酸特定的碱基序列。限制酶对细菌有保护作用，某些入侵的噬菌体可因DNA链被限制性酶切断而不能在细菌中繁殖，“限制”因此而得名。限制酶不能切开细菌本身的DNA，这是因为细菌DNA的腺嘌呤和胞嘧啶甲基化（-CH3）而受到保护之故。 这样就可以用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段，对于原核生物比较小的基因组来说，可以直接用标记地探针来获取在通过特定的方法，对于比较大的基因组，可以先制作基因文库，然后钓取所需要的带有目的基因的片段。 2.人工合成目的基因DNA片段 人工合成目的基因DNA片段有化学合成和酶促合成法两条途径。一般是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段。 3.PCR反应合成DNA 聚合酶链式反应（PCR)是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。PCR技术的原理如下：
基因组DNA测序文库构建
基因组DNA测序文库构建 1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含 RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。 对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。 对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。 2.用Qubit检测DNA样品浓度。 3.吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间， 体积为130ul。用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。 4.样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。 5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ul TE或Elution Buffer洗脱。回收产物用Qubit测值。 6.修平和磷酸化 100ul体系
DNA 1ug 5 X T4 polymerase buffer 20ul BSA (5mg/ml) 2ul ATP (100mm) 1ul dNTP（10mm）10ul T4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ul Klenow（10U/ul）1ul T4 PNK (10U/ ul) 1.5ul 22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 7.加‘A’ 100ul体系 DNA 0.5-2.5ug 10 X klenow buffer 10ul dATP(10mm) 1-3ul Klenow(exon-)（5U/ul）1-3ul 37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 8.连接头 200ul体系 10 X T4 DNA ligase buffer 20ul PEG4000 30ul ATP(100mm) 2ul DNA X 接头 Y T4 DNA ligase 1.5-2ul 加水至 200ul DNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。 9.连接产物用柱式法纯化后，跑琼脂糖胶切割目的区域回收。 10.PCR扩增 10 X TagE buffer 5ul Mg2+ 4ul dNTP(10mm) 1ul lib-PCR-F 0.5ul
基因组文库的构建和应用研究进展
一. 基因组文库的构建和应用研究进展 随着后基因组学时代来临，克隆、研究并利用生物的重要基因、研究它们的结构、功能和进化已经成为遗传学领域的热点之一。和原核生物相比，真核生物基因组结构复杂，研究起来较为困难。随着大片断DNA克隆技术的发展核完善，构建真核生物大片断DNA的基因组文库，并以之为平台进行基因组序列测定、物理作图、基因分离、以及基因结构核功能的分析等研究，已经成为真核生物基因组研究中行之有效的方法[1]。 基因组文库是指含有某种生物全部基因的随机片断的重组DNA克隆群体。这个文库象是一个贮存有基因组全部序列的信息库，故称为基因组文库（genomic library），又称为人工构建的基因“活期储蓄所”（genomic bank）。人们既可以通过基因组文库的构建、贮存和扩增特定生物基因组的全部或部分片段，同时又能够在必需时从基因组文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因[2]。 1 基因组文库的产生和发展 克隆载体作为基因组文库构建的重要媒介，提高其容纳量一直是重要发展方向之一。自1973年Cohen构建了第一个质粒载体pS101以来，越来越多的克隆载体相继出现，使得克隆载体的整体结构和克隆效率有了很大改善。载体的发展大致经过三个阶段：第一代是以λ噬菌体和粘粒为代表的载体；第二代的代表为YAC （yeast artificial chromosome）、BAC（bacterial artificial chromosome ）及PAC （P1-derived artificial chromosome）；第三代为BIBAC（binary BAC）及TAC （transformation –competent artificial chromosome）为代表的新型文库载体，不仅具有第二代载体的所有特征，而且具备了植物的转化功能[3]。 1.1 第一代载体 λ噬菌体是最早使用的克隆载体，其插入片断仅20 kb左右[4]。1979年Royal 等确定了在粘粒（Cosmid）载体中克隆大片断的可能性[5]。此后粘粒载体用于构建果蝇、小鼠、人等基因组文库，并从这些文库中成功分离得到基因。肺炎支原体基因组全序列的测定就是粘粒文库的基础上完成的[6~8]。粘粒是用包含λ噬菌体cos位点的质粒。载体长4～6 kb，平均插入一般为40 kb左右。重组的粘粒可承载
基因工程主要内容及流程
基因工程制药 姓名：刘惠霞 学号：2011506024 班级：2011级生技1 班
基因工程制药 一．基因工程制药常用的工具酶： 基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工具酶。 (一) 限制酶(Restriction enzymes) 限制酶即限制性核酸内切酶的简称，是一类专一性很强的核酸内切酶。与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。 限制酶的种类 Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不大。 Ⅱ型酶：相对分子质量较小，为20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2＋。能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。 (二) DNA聚合酶(DNA polymerase) DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA 模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。 1．大肠杆菌 DNA聚合酶Ⅰ 2. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断Klenow 片断 3. T4噬菌体DNA聚合酶 4. 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶） 5. TaqDNA聚合酶及AmpiTaqTMDNA聚合酶 6. 反转录酶 （三）DNA连接酶（DNA ligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。 1. T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5'羟基之间形成磷酸二酯键。 2. 大肠杆菌DNA连接酶：用途较窄，不常用。 （四）基因工程中常用的其他酶 1. 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶） 2. T4噬菌体多核苷酸酶
基因文库的构建
基因组DNA文库构建的基本流程 日期：2013-03-07 来源：网络标签：载体DNA文库文库构建 摘要: 基因组DNA文库构建的基本流程是什么？基因组DNA文库构建有哪些步骤？基因组DNA文库构建有哪些实验必备技巧？基因组DNA文库构建有哪些注意事项？相信一下内容给你个清楚的解答。 基因组DNA 文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。 一、分离基因组DNA(gDNA) 毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。 二、处理基因组DNA 根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。比如，对于黏粒载体(比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM)，合适的片段长度大约为40kb;对于BAC载体(比如Ep ICE ntre的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM)，平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。 构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA;接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率;然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的dna片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶(常用EcoR I、BamH I或者Hind III)来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段(比如100kb-150kb)，随后透析回收DNA。 需要注意： (1)电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。 (2)电泳以后，应该避免用紫外光照射目标DNA，紫外光照射DNA会显著降低克隆效率。解决方法：把marker所在的部分凝胶切下，在紫外灯下做好记号，然后以此为参考定位所需的片段。 (3)回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA被剪切，降低文库质量。 三、载体的选择 目前，常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体(P1人工染色体)、BAC 载体(细菌人工染色体)和YAC载体(酵母人工染色体)。选用何种载体可以参考如下几个因素： 1.目标区域的大小 如果基因组的目标区域很小(小于50kb)，那么可以选择黏粒载体甚至是λ噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，研究者可以方便的构建黏粒载体文库。 如果基因组的目标区域比较大，那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。P1操作比较困难，PAC相对简便。BAC载体也是很好的选择，研究者可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如EPICENTRE公司的一系列BAC载体及配套试剂盒。
文库构建
cDNA基因文库的构建 2009-10-11 17:56:18| 分类：生命科学|举报|字号订阅 一、cDNA文库的特征和发展： cDNA (complementary DNA):以mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成的与之反向互补的DNA链(单链cDNA，反义链)，以单链cDNA为模板还可以合成 其反向互补链(取代mRNA的DNA链，正义链)，得到双链cDNA。 将生物某一组织细胞中的总的mRNA分离出来作为模板，在体外用反转录酶合 成互补的双链cDNA，然后连接到合适的载体上，并转入宿主细胞。这种方法所形成的所有克隆的集合体叫cDNA文库。 1）cDNA只含有对应于成熟mRNA的转录区，不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。 2）cDNA一般较短，平均长度1.5kb左右，多数为100bp至10kb。 3）表达谱的时空动态性决定了cDNA文库的多样性。 4）不同基因的cDNA间存在丰度上的差异。 二、cDNA文库的构建： 1、RNA的分离 mRNA是构建cDNA文库的起始材料。总RNA中绝大多数是tRNA和rRNA，而mRNA只占总RNA的1﹪-5﹪，平均为2%，mRNA的比例取决于细胞类型和细胞的生理状态。由于mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库的一个重要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大提高筛选到目的基因的可能性。利用Poly(A)尾巴纯化或直接提取mRNA。1）根据研究目标合理选择器官、组织和细胞类型以及合理的环境条件，用于提取RNA。 2）保持mRNA的完整性，是构建全长cDNA文库的核心。 3）选取合适的提取方法，除完整性外，mRNA还要求纯度高、DNA污染少， 最好是采用无RNase的DNase去除杂质DNA。