3种瓜类枯萎病菌Fusariumoxysporum的分子检测

植物病理学报

A CTA PHY TO PA THO LOG ICA SI N ICA 40(6):636 641(2010)

收稿日期:2010 02 01;修回日期:2010 07 29

基金项目:黑龙江省自然科学基金项目(200839)

通讯作者:王玉霞,副研究员,主要从事植物病害生物防治研究;E m a i :l w an gyux i a218@s ohu .co m 第一作者:张淑梅,研究员,主要从事农业微生物研究;E m ai:l z s m h l@j yahoo https://www.sodocs.net/doc/916509770.html, 。

研究简报

3种瓜类枯萎病菌Fu sa ri um o xyspo rum 的分子检测

张淑梅1,2,赵晓宇1,张先成1,孟利强1,李晶1,张云湖1,王玉霞

1*

(1黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;

2

东北农业大学园艺学院,哈尔滨150030)

M o lecu la r de tec tio n o f Fusa rium o x y sp o rum

in cucum b e r ,w a te r m e lo n and m e lo n

ZHANG Shu m e i 1,2

,ZHAO X iao yu 1

,ZHANG X ian cheng 1

,M ENG L i q i a ng 1

,L I Ji n g 1

,ZHANG Y un hu 1,W ANG Y u x ia 1

(1Instit ute o fM icrob i o l o gy ,H e ilong jiang A cade m y o f Sc iences ,H arb i n 150010;2Co llege o f Ho rti

cult ure ,N o rtheast A gr icu lt ura lU n i v ersity ,H arbi n 150030)

Ab stra ct :Fusar i u m oxyspo ru m is one o f the m o st i m portan t phy topathog ens and cause Fu sar i u m w ilt d isease i n cucu m ber ,w ater m e lon and m elon ,etc.I n t h is study ,a pa ir o f spec i e s spec ific pri m ers Fc 1and Fc 2w as syn t h esized based on d ifferences in interna l transcri b ed spacer sequences o fFusar i u m genus .W it h t h e pri m ers ,a specific 315bp PCR productw as a m plified from fi v e F.oxyspo ru m iso lates iso lated fro m cucum ber ,w ater m elon and m elon ,i n fected cucu m ber and w ater m e l o n tissues ,w hile no product w as obta i n ed from o ther four teen fung ,i healthy cucum ber and w ater m e l o n tissues .The detection sensitiv ity is 100fg for geno m ic DNA o f F.o xysporum and 1000spo res/g so il for the so il pathogens .In contras,t the nested PCR w it h t w o pairs o f pri m ers (I T S1/I T S4and Fc 1/Fc 2)i n creased t h e sen siti v ity by 100 fo ld .I n add iti o n ,one step PCR could also detectF.oxyspo rum i n sym ptom l e ss cucu m ber roo t o f 7dp i (days po st ino culation)and in i n fected cu cum ber and w a ter m elon tissues at the early stag e o f disease developm en.t Therefore ,the deve l o ped PCR based m ethod enab led rapid ,sensitive and reliab l e detection o fF.o xy spo ru m.It also pr o v i d es the detection m e t h od fo r early m onit o ring and d iagno sis o f the pathog en as w ell as t h e plan t d isease m anage m ent guidance .Key w o rd s:Fusa riu m oxyspo rum ;PCR;m o lecular detection

文章编号:

0412 0914(2010)06 0636 06

瓜类枯萎病是黄瓜、西瓜、甜瓜等主要瓜类作物的常见病害,在全国各地均有发生,其中以黄瓜、西瓜发病最重,一旦发病,难以根除,并随着连作年份的增加发病率升高,给生产带来严重损失。

尖镰孢菌(Fusar i u m oxyspo rum Sch lech.t )是引起瓜类枯萎病的主要病原菌,对该病菌的传统鉴定方法主要基于形态学及致病性测定,但耗时长、程序繁琐,不能在病害潜伏期和初发期作出诊断,难以做到对病害发生的及时监测和有效控制。随

着分子生物学技术的发展,RAPD (random ly a m plified po l y m o rphis m ),RFLP (restricti o n fragm ent length po l y m o rphis m ),AFLP (a m p lified fragm ent length po ly m orph is m ),r D NA (ri b o som al DNA )序列分析和特异引物PCR 检测已应用于枯萎病菌的研究中。由于真菌核糖体转录间隔区(i n ter nal tran scri b ed spacer ,I T S)序列具有种间高度变异和种内稳定的特性,为病原菌的分子检测提供了理想

的靶序列。Z heng 等[1]

研究表明黄瓜、西瓜和甜瓜

6期张淑梅,等:3种瓜类枯萎病菌F usa riu m oxy s po ru m的分子检测

枯萎病菌I TS序列同源性几乎达100%,因此利用I TS PCR技术可以对黄瓜、西瓜和甜瓜枯萎病菌进行特异的分子检测。本项研究用一对特异引物Fc 1/Fc 2建立了常规PCR技术检测黄瓜、西瓜和甜瓜枯萎病菌。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试的19个菌株均为致病性菌株,其种名、来源及寄主见表1。

1.2 菌丝体及孢子培养与收集

供试真菌在PDA平板上28 培养3d,从菌落边缘挑取菌丝接种于PD培养液中,28 培养7d,用灭菌纱布过滤收集菌丝,用无菌水冲洗2遍,吸干水分,-70 冷冻保存。

将黄瓜枯萎病菌在PDA平板上26 培养9d,用无菌水洗脱孢子,用血球计数板测定孢子悬浮液浓度,稀释成不同浓度,4 保存备用。1.3 DNA提取

采用CTAB方法从菌丝体及感病植株根部提取DNA,按照参考文献[2]方法从土壤中提取病原菌DNA。

1.4 引物设计与PCR扩增

1.4.1 引物设计 根据G enB ank中Fusa riu m属不同种间I TS序列的差异,用G ene R unner3.05软件设计枯萎病菌I T S种特异引物Fc 1/Fc 2。序列如下:Fc 1(5 CATACCACTTGTTGCCTC 3 )和Fc 2(5 ATTAACGCGAGTCCCACC 3 )。

1.4.2 常规PCR反应 PCR反应混合液总体积为25 L,包括模板DNA10ng,10 PCR反应缓冲液(含2mM M gSO4)

2.5 L,Fc 1和Fc 2各0.4 M,0.2mM dNTP,1U EasyTag DNA po l y m erase(Trans G en B io tech)。在PE9700PCR扩增仪上进行扩增反应,反应程序为:94 预变性5m i n;94 变性30s,60 退火1m i n,72 延伸1m i n,40个循环;72 延伸10m i n。取5 L扩增

Ta b l e1 Fun g a l sp ec i e s use d in th e s tu dy

Spec ies O r i g i n Ho st

F usa riu m oxy s po ru m f.sp.cucu m erinu m HW S 12H a rbin C ucu m ber

F.o xyspo ru m f.s p.cu cu m er i num3.2830CGM CC C ucu m ber

F.o xyspo rum f.sp.n iveu m HW S 8H eil ong ji ang W a ter m e l o n

F.o xyspo rum f.sp.n iveu m HW S 9H eil ong ji ang W a ter m e l o n

F.avena ceu m C anada B arley

F.g ra m i nea rum R ussia W heat

F.m onilif o rm e3.2835CGM CC R ice

F.pro lifera t um3.3635CGM CC R ice

F.s o lan i H eil ong ji ang So ybean

F.equiseti R ussia Bean

F.niva le R ussia B arley

F.po ae H eil ong ji ang W heat

F.o xyspo ru m f.sp.m e l o nis H eil ong ji ang M e l on

Fu s a r i u m s p.H eil ong ji ang C ucu m ber

C o lleto trichu m l a gena r i u m H eil ong ji ang C ucu m ber

Bo try tis ci ner ea H eil ong ji ang C ucu m ber Sclero ti nia sc lero tio ru m H eil ong ji ang C ucu m ber

P y t h i u m s p.H eil ong ji ang C ucu m ber Rhizo cton i a so lan i C anada C ucu m ber

CGM CC:C hi na G eneralM i crob i o log i ca l Cu lt ure C o llecti o n Center.

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植物病理学报40卷

产物在添加G e l R ed染色剂的1%琼脂糖凝胶中电泳60m i n(85V),在凝胶成像系统上检测。

1.4.3 N ested PCR反应 以真菌通用引物I TS1 (5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 )和I T S4(5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 )作为第一轮反应引物,反应体系参照1.4.2,反应程序为:94 预变性5m i n;94 变性30s,58 退火30s,72 延伸1m i n,30个循环;72 延伸10m in。取1 L PCR产物为模板与引物Fc 1/Fc 2组合进行第二轮PCR扩增,反应程序同1.4.2。取5 L扩增产物在添加G el R ed染色剂的1%琼脂糖凝胶中电泳60m i n(85V),在凝胶成像系统上检测。

1.5 引物特异性检测

以供试19株病原菌基因组DNA为模板,进行常规PCR反应。

1.6 PCR扩增灵敏度检测

将黄瓜枯萎病菌基因组DNA从10ng/ L依次10倍梯度稀释至100ag/ L,取1 L为模板分别进行常规PCR和nested PCR,比较2种PCR扩增体系对枯萎病菌基因组DNA的最低理论检测量。

将黄瓜枯萎病菌孢子计数后与0.5g灭菌土混匀,使每克土壤含有病菌孢子数分别为105,104, 103,102和10,放置7d,分别以接种不同浓度孢子的土壤基因组DNA为模板进行常规PCR反应,检测优化的常规PCR扩增体系对土壤中病菌孢子的最低检测量。

1.7 常规PCR对田间病样及人工接种病样

的检测

田间病样检测:以健康和发病初期的黄瓜和西瓜植株根部基因组DNA为模板进行常规PCR反应。

人工接种病样检测:温室盆栽黄瓜,2片真叶期灌根接种枯萎病菌孢子悬浮液(1 107个孢子/ m L),每株5m L,从接种开始,分别在接种后1、3、5、7、9、15、21和30d分别取样,每次取5株(保持根部完整),用水冲洗干净后,肉眼观察根部及茎基部色泽,判断感病情况,-70 冰柜中保存,供PCR检测。

2 结果与分析

2.1 引物Fc 1/Fc 2对F.o x yspo rum特异性

应用引物Fc 1/Fc 2对19株病原菌进行常规PCR反应,只能从供试的2株黄瓜、2株西瓜和1株甜瓜枯萎病菌基因组DNA中特异地扩增出315bp的DNA片段,而对异源属和同属异种的14株菌均无PCR扩增产物(图1),表明该引物具有种特异性,可以用于3

种瓜类枯萎病菌株的检测。

Fi g.1 PCR am p lified p ro du cts w ith the spe c ifi c p rm i e rs Fc 1/Fc 2

from g en om ic DNA o f d iffe re nt fu ng a l sp e c ies

M:DNA m arker(D L2000);1 2:Fu s a r i u m o xyspo ru m f.s p.cucu m er i nu m H W S 12and F.oxy s po ru m f.sp.cucu m erinu m 3.2830;3:Rh izocton i a s o l an i;4 5: F.o xyspo ru m f.sp.n iveu m HW S 8and F.o xys po rum f.sp.n i v eu m HW S 9;6:P ythiu m sp.;7: F.o xy s po ru m f.s p.m el on is;8 19:Sclero ti nia s c l ero tio ru m,Botrytis c i nerea, F.a vena ceu m, F.g ra m inearu m, F.m on ilif o r m e 3.2835, F.pro lifera tu m3.3635, F.so lani, F.equise ti, F.n i va le, F.poa e,Fusa r i u m sp.and Co lleto tr ichum la gena r i u m. 638

6期张淑梅,等:3种瓜类枯萎病菌F usa riu m oxy s po ru m的分子检测

2.2 常规PCR和ne s ted PCR灵敏度比较

常规PCR结果显示(图2 A),引物Fc 1/Fc 2在优化的PCR反应条件下能够从10ng~100fg的基因组DNA中扩增到315bp的特异性DNA片段,表明常规PCR反应对枯萎病菌基因组DNA的检测灵敏度为100fg。Ne sted PCR结果显示(图2 B),用两对引物进行两轮PCR扩增,能够从10ng ~1fg基因组DNA中扩增出特异性DNA片段,表明nested PCR可以使检测灵敏度提高100倍。两种方法比较,虽然常规PCR技术对枯萎病菌基因组DNA的检测灵敏度低于nested PCR,但成本低,易操作,耗时短,污染小,因此实用性较强。2.3 常规PCR对接种土壤中病菌孢子的检测

以10ng DNA为模板,应用引物Fc 1/Fc 2进行常规PCR,能够从103~105个孢子/克土中扩增出特异性DNA片段(图3),表明引物Fc 1/Fc 2对土壤中病菌孢子的检测灵敏度为103个孢子/克土。

2.4 常规PCR对田间病样的检测

从棚室随机采集具有轻微枯萎病症状的黄瓜和西瓜植株各2株,以根部组织DNA为模板进行常规PCR,均能检测到枯萎病菌的存在,而从健康黄瓜和西瓜植株根部检测不到枯萎病菌的存在(图4)

。

Fig.2 S en s itiv ity o f re g u la r PCR and ne ste d PCR fo r de te c ti o n o f

Fus a rium o xy spo rum f.sp.cu cum e rine um

A:PCR w it h pri m ers F c 1/F c 2.L ane M:100bp DNA l adder;L ane1 8:PCR produc ts from1fg,10fg,100fg,

1pg,10pg,100pg,1ng and10ng g enom ic D NA.B:N ested PCR w ith pr i m ers IT S1/IT S4fo r the first round and pri m ers

F c 1/Fc 2fo r t he second ro und a m plif i ca tion.L ane M:100bp D NA l adder m arker;L ane1:N ega tive con tro;l

L ane2 10:PCR pro ducts from100ag,1fg,10fg,100fg,1pg,10pg,100pg,1ng and10ng genom ic D NA.

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植物病理学报40

卷

Fi g.3 S e ns iti v ity o f PCR w ith p rm i e rs Fc 1/ Fc 2fo r Fu sa r i u m o xy spo rum f.sp.

cucum e rineum DNA from spo re s

M:100bp DNA ladder;1:N eg ati v e con tro;l2 6:T he nu m ber of s po re s w as10,102,103,104and105;7:Po sitive co n tro.l T he sam e resu lts w e re ob tai ned from3repli ca t e s.

2.5 常规PCR对人工接种病样的检测

分别从接种后1~30d的黄瓜苗根部组织提取DNA,常规PCR扩增结果表明(图5),从接种7 ~30d植株根部DNA中均能扩增出315bp的清晰目的条带,而未接种的健康植株没有扩增条带;接种7~10d,植株根部无症状表现;接种15d,部分植株根部变褐色,出现感病症状,第30d,部分植株表现枯萎症状,说明该PCR体系可以在症状出现前约7d

检测到侵入的病原菌。Fi g.4 PCR p ro d uc ts o f DNA e x tra cte d from n a tu ra ll y in fec ted and he a lthy p lan t

tissue s w ith th e spe c ifi c p rm i e rs Fc 1/

Fc 2

M:100bp DN A ladde r;1:N ega tive con tro;l2:H ea lt hy cu cu m ber roo;t3 4:Infec t ed cucu m be r roo;t5 6:Infected w a ter m elon roo;t7:H ealt hy w ater m elon roo;t8:Po siti v e con tro.l The sa m e re sults w ere o bta i ned from3rep lica tes.

3 讨论

病原真菌的准确鉴定和早期检测是植物病害防治的重中之重。传统方法和免疫学技术不能在病菌侵染初期作出快速准确检测,而分子检测技术可以做到对病菌进行早期预警诊断,从而可以有效

控制病原菌的传播与病害流行。

Fig.5 PCR p ro du cts o f DNA ex trac ted from h e a lth y a nd in fe c ted cu cum be r ro o t

a t d iffe ren t tm i es a fte r ino cu la ti o n w ith Fu sa r i u m o x y spo rum f.sp.

cu cum e rinum w ith the spe c ific p rm i e rs Fc 1/Fc 2

M:100bp D NA l adder;1:Po sitive con tro;l2 9:R oo t a t1,3,5,7,9,15,21and30dp i(day s po st i noculati o n);

10:H ea lthy roo;t11:N eg ati v e co ntro.l T he sam e resu lts w ere ob tai ned from3repli ca tes.

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6期张淑梅,等:3种瓜类枯萎病菌F usa riu m oxy s po ru m的分子检测

真菌核糖体DNA的I T S序列既具保守性,又具种特异性,利用PCR扩增病原真菌核糖体I TS 基因区段进行病原真菌鉴定、检测及病害诊断技术得到了很大发展,应用r DNA区I TS序列设计种特异性引物对引起西瓜和黄瓜枯萎病的F.oxyspo rum的分子检测已有一些报道,Zhang等[3]采用I TS PCR技术对F.oxyspo ru m f.sp.n ive um进行分子检测,检测灵敏度为1fg DNA和100个孢子/克土;C hang等[4]采用I T S PCR技术对F.oxyspo rum f.sp.niveu m进行分子检测,检测灵敏度为10pg DNA和5个孢子/克土,但是他们均没有对田间病样和人工接种病样进行检测。C hen等[5]采用PCR RFLP和nested PCR在接种发病早期(3d和5d,未显症时)可以检测出黄瓜枯萎病菌,但是采用的方法较复杂,增加了DNA污染风险。本研究建立的瓜类枯萎病菌一步PCR分子检测体系,对黄瓜枯萎病菌检测灵敏度为100fg DNA和1000个孢子/克土,该体系能够从田间发病初期黄瓜和西瓜以及人工接种发病潜伏期7d的黄瓜苗根部检测到病原菌。虽然检测灵敏性低于文献报道,然而,1步常规PCR与2步nested PCR相比,操作简便、快速、DNA污染风险小。土壤中黄瓜枯萎病菌孢子数在103个孢子/克土以上具有致病性,而且随着病菌数量增加致病性增强,103个孢子/克土发病率低,病害潜伏期长,107个孢子/克土发病率高。本研究建立的PCR方法对土壤中黄瓜枯萎病菌孢子的检测下限为103个孢子/克土,能够在病害潜伏期,初发期进行快速准确检测,可以满足实际需求,具有应用潜力。此外,本研究设计的引物与文献报道不同,适用范围较广,适用于黄瓜、西瓜和甜瓜三种瓜类枯萎病菌的特异检测,迄今为止,用1对特异引物对黄瓜、西瓜和甜瓜三种寄主枯萎病菌的分子检测还鲜见报道。

F.oxyspo rum的致病基因不在核糖体DNA转录间隔区,因此该研究建立的一步PCR方法不能区分该菌株是否具有致病性。

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责任编辑:李晖

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