Western blot 转膜及膜的选择

Western blot 转膜及膜的选择

转膜： 经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从PAGE 胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行Western Blot的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜的首要是选膜。在转移膜上显色其实就像是画家在画布上作 画一样，不光要有好的画笔和颜料，适合的画布也是相当之重要。Western Blotting亦是如此，没有选择好合适的转移膜是无法做出漂亮的结果的。因此，选择适合的转移膜，要让转移“膜”高一尺，帮衬而不是阻碍到我们的实 验。

Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride） ，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。具体哪种膜适合于哪些实验呢？选择的根据主要有：a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜 能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有 其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜，就像国画要选择宣纸，油画要挑亚麻布或薄棉扣布一样。

转膜 是对western blot最终结果影响最大的一步，转膜质量的好坏直接决定了实验结果的好坏。转膜的影响因素不多，主要有膜的选择、转印方法和实验操作三个方面。

首先是膜的选择问题。膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑。例如，要做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的NC膜是不可取的，因为这样可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定，从而影响到最终结果的可靠性。而如果所分离的蛋白需要进行测序，则非PVDF膜不可，因为只有PVDF 膜才能经受住严酷的清洗条件。常用的western blot用膜有NC膜、PVDF膜和尼龙膜，它们的一些主要的特点总结如下表：

NC膜 尼龙膜 PVDF膜

灵敏度和分辨

高 高 高

率

背景 低 较高 低

结合能力 80－110 ug/cm2 >400 ug/cm2 125－200 ug/cm2（适合于SDS 存在下与蛋白质的结合）

材料质地 干的NC膜易脆 软而结实 机械强度高

溶剂耐受性 无 无 有

操作程序 缓冲液润湿,避免气泡 缓冲液润湿 使用前100%甲醇润湿

检测方式 常规染色，可用放射性和非

放射性检测

不能用阴离子

染料

常规染色， 比较于NC膜，可

用考马斯亮蓝染色，可用于ECL

检测，快速免疫检测。

适用范围 0.45um 一般蛋白

0.2um一分子量小于20kD

蛋白

0.1um一分子量小于7kD蛋

白

低浓度小分子

蛋白、酸性蛋

白、糖蛋白和蛋

白多糖(主要用

在核酸检测中)

糖蛋白检测和蛋白质测序

价格 价格较便宜 便宜 较贵

其次是转膜方法的选择。主要有半干法转膜和湿法转膜。半干法操作要求高，但效率也高。湿法操作要求相对低，花时间多一些。

最后是实验操作方面的问题。使用PVDF膜的时候需要进行预处理，这里面会带来一些问题，如甲醇润湿不够，膜的有些区域不能很好的结合蛋白就会引入误差。膜上面一定不要有油脂类的东西，否则也会影响蛋白结合和抗体的杂交。

1. 硝酸纤维素膜

硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、 染色和荧光显色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以 了；比如NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间， Schleicher & Schull公司的一个实验表明，转移到NC膜上的几种蛋白4度条件下保存5年依然保持免疫识别特性，依然可以得到清晰可信的Western Blot结果。不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途——因为经不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要 注意的是选择合适的孔径，通常

20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话最好选择 0.1um的膜。另外还要注意选择纯的NC膜——混有

含醋酸纤维（CM）的NC膜结合力会有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污 剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）。

硝纤膜最为大家熟悉和认可的品牌就是 Schleicher & Schull；Millipore；PALL，另外罗氏、Invitrogen、GE（Amersham）、Santa Cruz等公司都有提供各式的硝纤膜（估计OEM的可能性比较大，不过有时挺奇怪的，OEM的有时比生产厂家卖的还便宜）。 Schleicher & Schull的名字拗口——那大概需要舌头在口腔里经过若干次不同弧度和不同速度的上下往返精确运动再配合适当的吐气才能读得准确优雅，不过作为第一个提 供硝纤膜的厂家依然广为人知，其NC 膜分为纯NC膜和强化NC膜两种：Protran nitrocellulose membrane和Optitran nitrocellulose membrane。前者Protran一直是 Schleicher & Schull自豪的产品，这种“100% Pure Nitrocellulose Membranes”。一般而言，NC膜越纯，其蛋白结合能力就越高，所以要增加WB的灵敏度和分辨率，提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。如果NC 膜搀杂一些醋化纤维素——这在前面已经提到，会影响蛋白质结合。而Protran在制作过程中去除了各种杂质，保证了其纯度，从而增加了蛋白结合能力。除 了这一点以外，Protran还有低背景、多孔径选择（0.45, 0.2, 0.1um）和保存时间长（实验证明膜上蛋白辨认时间可长达5年！真是“路遥知马力”的典范）等优点。但是Protran由于是纯NC膜，比较脆，机械耐 受力欠佳，需要小心操作，如果担心自己“粗手粗脚”，那么就可以考虑一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著称的BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。

Optitran是在一层超薄聚酯支撑膜的两面均匀铺上100%纯的硝酸纤维素，结果表面看起来和纯硝纤膜完全一样，保持了NC膜各种优点，只是内部多了 一层中性支持物，大大增强这种强化NC膜的柔韧度和机械耐受力，不容易卷曲，方便操作，特别是重复标记和洗脱的实验。不过有的使用过的人反应不如纯NC膜 结合能力强。 NC膜除了一般的Discs、Rolls和Sheets以外，像Invitrogen、Bio-Rad公司还有一种方便顾客使用的“sandwich”三 明治形，十分有趣。说它有趣是因为考虑周到，利于高通量操作，但其实也就是将滤纸和NC膜纸套成滤纸—NC膜—滤纸的层迭形式，预先切割装订好，方便使 用。不过，卷膜肯定是最实惠的选择，只不过要自己动手裁剪——切记，必须带手套操作。不知道为什么在国外硝纤膜会被当作危险品来运输还要加收运费，所以货 期蛮长的，所以还是卷膜好，一卷用n年——如果非要给这个n加个期限，那就是......至少可以用到等我毕业之后。

2. PVDF膜

刚开始做WB的人也许会有这种疑问：为什么实验室的老师（或者师兄师姐们）

在教我们做WB的时候，如果是用PVDF膜做，总是小心翼翼的剪，节省着用，甚

至一些边边角角也舍不得丢掉呢？其实，这不仅是因为PVDF膜比较贵，还由于

PVDF膜是做WB的“杀手锏”。

聚偏二氟乙烯（PVDF）膜作为基质的转印膜由Millipore公司在1985年首

先推出。与硝酸纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度 和化学相

容性上都更优越的性能（Pluskal,et al.,1986)。市售硝酸纤维素膜的典型结合

量是80-100μg/cm2,而PVDF膜结合量是100-200μg/cm2（而结合强度PVDF比

硝纤膜强6倍！）。在艾滋病毒（HIV）血清学检验中直接比较PVDF和硝酸纤维

素膜，PVDF膜具有更好的截留总HIV抗原能力并提高抗体检测糖基化被 膜抗原

的性能。但是PVDF膜最大的优点不仅于此：更好的机械强度和化学耐受性使PVDF

膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；而且单个凝胶的 泳道复本

可用于多种目的，如考马斯亮蓝染色后切出条带并进行N-末端测序、蛋白消化/

肽分离/内部测序和免疫检测（Kurien,et al.,2003)。特别是需要做N端蛋白测

序，在相当“严酷”的清洗条件下，当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下PVDF

膜依然保持本色，笑傲江湖。所以 PVDF也是要做蛋白测序的唯一选择。此外，

个人经验，一些强疏水蛋白用PVDF膜效果会更好一些。PVDF膜适用的检测方法

也不少，化学发光、常规显 色、同位素和标准染色都一样OK，但不适合荧光。

PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡，才

能用，而且适用过程中 万一干了也要同样程序再处理（不过要真出现这种问题

也是自己欠扁，谁要你不小心呢，转膜前处理也就罢了，转膜后再这样处理可能

会影响后继的抗体识别呢）。 PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，

对小分子蛋白有较好的拦截吸附，背景可能会比前者稍高。

PVDF膜常见的有以下几个品牌

公司 产品名 孔径 适用范围 参考价格

Millipore Immobilon Transfer

Membranes 0.45um

0.2um

$212

Bio-Rad Immun-Blot PVDF

Membrane Chemiluminescent, colorimetric western blots, amino-terminal sequence and total amino acid composition

Pierce PVDF Membrane 0.45um

0.2um Western, Southern, Northern, and dot blots

Pall Life Science BioTrace PVDF Transfer

Membrane

0.45um Nucleic acid and

protein transfers.

Protein sequencing

$149

Invitrogen PVDF Membrane 0.45um

0.2um Protein sequencing, immunoblotting

￥1625.8

Whatman Westran Clear Signal

PVDF Membrane

0.45um Western blots

作为PVDF膜的鼻祖，Millipore公司的PVDF膜Immobilon系列分为Immobilon-P（0.45um）, -PSQ(0.2um), -FL(用于荧光显色)和Blotting Sandwiches for High Troughput四种。Immobilon-P膜孔径均一，具有极强的吸附能力，染色性能好、抗溶剂能力强和信噪比高，有助于提高检测灵敏度，而且开放 的孔结构容易接近被吸附的蛋白质，并有助于去除背景上没有吸附的探针，可以说是免疫印迹检测理想的印迹膜。Immobilon-PSQ转印膜是印迹小分子 蛋白质（<20KDa）的理想选择——优良的蛋白质吸附性能，渗漏少。内表面面积较大，可供蛋白质吸附从而提高蛋白质测序的得率。由于不含污染性支 撑物或表面活性剂，Immobilon-PSQ层析谱上的背景峰值极小。Immobilon-FL也是Millipore值得骄傲的产品，因为这是第一个 专门为荧光显色优化的转移膜。通过实验证明，这种膜在Kodak成像系统可以显示仅7ng的蛋白，听起来不错吧，有兴趣可以试一试。这几种膜除了一般的 PVDF膜的优点之外，最大特点就是一个字——快。按照Millipore的操作手册，Immobilon可以在保证质量的前提下缩短WB时间到2个小时 ——主要是缩短封闭和洗脱时间。这可真是个好消息，因为坐在那儿等WB结果多浪费时间啊！缩短这个费时而枯燥的过程，早出结果，可以提高实验效率，利于我 们分析实验结果，考虑下步对策嘛。卷膜经济实惠，裁剪剩下的边角料还可以用来做点杂交，而预裁剪的即用膜更适合高通量等等“用金钱换时间”的实验。再次强 调的是，疏水PVDF膜在用前必须经过50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理几分钟，待膜变成半透明后用MilliQ水或者纯水漂洗一下，转入电泳缓 冲液平衡才能用。

Invitrogen公司的PVDF膜也有大家风范：膜是与两张预裁的滤纸同时提供，方便使用；虽然一般而言0.2um的膜渗漏少适用性会更强，但 Invitrogen的 0.45umPVDF膜自有自家优势——特别适合于低背景，高敏感度的印迹反应，同样需要在乙醇或者甲醇，或者异丙醇中浸泡5分钟就可以用了。

3. 尼龙膜

尼龙膜更多是用于核酸的转移，也有见于蛋白印迹，比如dot blot，比较于NC 膜来说，它的优点是结合力强，特结实又柔软且不易卷曲，机械强度大，便于操作，缺点是背景高——由于尼龙膜电荷密度高，使得非结合区 的封闭比疏水性NC膜困难，对于灵敏度高的检测方法，背景问题尤为突出（据分子克隆III说通过热处理的酪蛋白和1%聚乙烯吡咯烷酮延长封闭时间可以改 善），而且当转移缓冲液中存在有SDS时蛋白质就容易从尼龙膜上泄漏（通过甲醛固定可以缓解这一情况）。另外至今也没有适合尼龙膜上的直接染色方法。因此 在许多情况下实验室人员进行WB实验不选择尼龙膜。

尽管如此，一些产品却能“取其精华，去其糟粕”，将尼龙膜一些不利于蛋白印迹的因素缩小或者去除，使其成为有效的蛋白转移介质。比如说，化学发光底物做得 相当出色的Pierce公司，其旗下的Biodyne A&B Nylon Transfer Membrane 就是这样一个产品。这种分为A，B两型的尼龙膜做工精良，孔径大小一致，为了保有尼龙膜高灵敏度的优点和摒弃背景影响大的缺 点，Biodyne采用了合适的signal-to-noise 比例来调整，从而达到了200ug/cm2的蛋白结合能力，同时有比大多数尼龙膜甚至比一些NC膜都要小的低背景。除此之外，B型的Biodyne 对于一 些带负电蛋白是一种理想的转移膜，因为它在A型的基础上提高了正电荷集团的浓度。另外Biodyne相对于NC膜来说还是一种“打不怕，撕不烂，烧不着 （200℃一下）”的“顽强”的转移膜。

PVDF转膜实验步骤及注意事项

蛋白质转膜实验注意事项（用于N端测序） 转膜实验操作要点 1、SDS－PAGE电泳：按常规条件进行（CAPS系统:用于>=20KD蛋白；Tris－Tricine 系统：用于低分子量蛋白，也可用于高分子量蛋白）； 2、甲醇浓度：CAPS电印迹缓冲液中甲醇浓度范围是0-20％（甲醇浓度高，用于低分子量蛋白转印；甲醇浓度低甚至不含甲醇的用于高分子量蛋白的转印）； 3、PVDF膜处理：取出PVDF膜，用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。（注：此后的操作须防止PVDF膜干涸。如果膜变干，须重复本步骤的操作）； 4、凝胶处理：取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。（注：转移某些强碱性蛋白pI>9.0时，可省略本步骤）； 5、安装转印槽子：将滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下，然后按海绵、滤纸、PVDF 膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中； 6、转印条件：在50V恒压条件下（100-170mA）于室温下进行电印迹转移，转移时间为0.5-2小时。（注：务必排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。例如对70kD以上的蛋白质须延长转移时间）； 7、PVDF膜染色前处理：取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行染色； 8、膜染色：考马斯亮蓝染色（将0.1％考马斯亮蓝R-250溶于40％甲醇/1％乙酸中）30-50秒（切勿超过1分钟），50％甲醇脱色（勤换脱色液），用去离子水充分洗涤，然后晾干即可； 转膜实验注意事项 1）电泳胶要求：尽可能使用厚胶，以保证膜上高载量； 2）预电泳处理：低电流跑空胶2～2.5小时，防止胶内杂质污染； 3）转印缓冲液：不能使用Tris-甘氨酸缓冲液，推荐使用CAPS缓冲液； 4）转印膜选择：不能用NC膜，务必使用PVDF膜；

Western操作步骤

Western-Blot 操作流程 （一）组织中总蛋白的提取 用干净的剪刀剪取绿豆大小的组织块于1.5ml的EP管中，加入200uLRIPA裂解液(含PMSF，比例为97：1：1：1)，用杵子研磨3-4min, 段事先在酒精里浸泡至少30min，用之前用滤纸吸干酒精，） 20-30s,每隔5min 后在 4℃下12000rpm 离心 5min，取上清分装于 1.5mlEP管中并置于-80℃冰箱保存。 （二）BCA法蛋白含量的测定 (1) 从-20℃取出 1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 (3)以上步骤完成后，在所有加样的孔里各加上200uLBCA蛋白浓度测定试剂（按试剂A：试剂B=50：1的比例配置），然后置于37℃水浴锅30min后取出。 (4)酶标仪测定OD值。 (5)EXCEL表格制作标准曲线，按照标准曲线计算各样本的蛋白浓度。 （三）稀释蛋白及蛋白变性 如果计算出的样本的蛋白浓度偏高，需要用RIPA裂解液将蛋白稀释（一般将蛋白浓度稀释至5-10ug/uL）;稀释完后取10-30uL的样本蛋白置于新的1.5mLEP管中，加入新EP管中总体积1/4体积的上样缓冲液，置于99-100℃的干式恒温器中加热5-10min,使蛋白变性。（注意：将EP管的盖子盖紧，插入加热器的大圆孔中）煮过的蛋白置于-20℃冰箱保存。 （四）制作SDS电泳胶 ⑴清洗玻璃板，双蒸水冲洗晾干后，根据厂家说明安装玻璃板。 ⑵配置10%的分离胶 配方：H2O2 4.0ml 30%丙烯酰胺液 3.3ml 1.5mol/l Tris （ PH8.8） 2.5ml 10%SDS 100ul 10%过硫酸胺 100ul TEMED 4ul ⑶分离胶溶液中加入 TEMED 以及 10%过硫酸胺后需立即混匀（防止未灌胶就发生凝固），将混合液立即加入玻璃板内，距梳子下缘约 lcm 处即可，蒸馏水封顶，待凝胶完全聚合（约30min）后，倒去双蒸水。 ⑷制备5%的浓缩胶 配方；H2O2 3.4ml 30%丙烯酰胺液 0.83ml 1.5mol/l Tris （ PH6.8） 0.63ml 10%SDS 50ul

Western超详细实验步骤

Western实验步骤 1. 电泳(Electrophoresis) （1）SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。 一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。 配胶步骤： 1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。 2.按比例配分离胶（8ml-10ml） 3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面 4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。（如果今日不上样可以放入4°C冰箱） 注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理 1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加 3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀 2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。 3.12000r离心5分钟。 （3）上样与电泳 1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右 2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。 3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳） 注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。 3.转膜(Transfer) 1.物品准备，甲醇，转膜缓冲液，滤纸，转膜槽，玻璃皿3个，制冰。 2.取下胶板，用专门的板将玻璃板分离（务必不要将胶弄破，动作轻些，从下面和上面分离玻璃板），切适合大小的胶（不要切掉MAKER）。 3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜，PVDF膜要放入甲醇中浸15秒（一般1-2分钟），胶要切角做标记（不要切到maker）,一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序 4.铺膜，PVDF膜铺在胶上，在PVDF膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可（滤纸要大于等PVDF膜，PVDF膜要大于等胶），赶尽气饱。 5.再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中，有PVDF膜这面放在正极侧（即无色透明夹这面），再将夹子放入转膜槽里（电极不要放错，蛋白质带负电的）

Western操作步骤

Western-Blot 操作流程及注意事项 Western操作步骤 （一）蛋白样品制备 （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2~7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3. 按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合） 4. 每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行） 6. 于4℃下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷） 7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。 （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强） （2）组织中总蛋白的提取： 1. 将少量组织块置于1~2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。 3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： 1. 将培养液倒至15ml 离心管中，于2500rpm 离心5min。 2. 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后PBS 重复洗涤一次。 3. 用枪吸干上清后，加100 μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 4. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （二）蛋白含量的测定 （1）制作标准曲线 1. 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 2. 取18 个1.5ml 离心管，3 个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

western转膜条件

western 转膜条件 蛋白来源：RAW264.7 总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70 KD WB用膜类型、孔径：0.45 NC 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA 转膜时间：60~90 min PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min 就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。 蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin & AKT 蛋白分子量：65 KD & 56 KD WB用膜类型、孔径：0.45 PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100 V 转膜时间：60~70 min 设备名字是“ Bio-Rad mini ”。 蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65 KD & 55 KD WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12 V 转膜时间：30-40 min 设备：“ Bio-Rad mini ” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。 蛋白来源：293T 细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95 KD & 35 KD WB用膜类型、孔径：PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90 V-110 V ，控制电流不要超过300 mA。转膜时间：70 min 蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min 转膜设备：湿转Bio-Rad 说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。 蛋白来源：成纤维细胞 蛋白名称（可保密）：smad3 蛋白分子量：54 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流 转膜时间：150 min 转膜设备：湿转Bio-Rad 蛋白来源：胰腺癌细胞 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：16 KDa and 42 KDa

Western_blot_试剂配制及操作流程

Western-Blot操作流程 试剂配制 1.RIPA裂解液： 10mM Tris（MW121.14，PH7.5） 1%NP40 0.5%TritonX-100 0.2%脱氧胆酸钠 2 mM EDTA 1 mM PMSF 20%甘油 调pH值至7.5。 混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。 制胶用（1-6）： 1. 1.0mol/L Tris·HCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 12.114g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。 2. 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 18.671g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。 3.10％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 4.10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g

（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周） 5．四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4?C保存。 6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。 10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水 5.9ml 30%丙烯酰胺 5ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml 10%SDS 150μl 10%AP 150μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加异丙醇（1ml）消泡 5%上层胶（两块胶，6ml）： 依次加入去离子水 4.1ml 30%丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml 10%SDS 60μl 10%AP 60μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。 7．5X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。 8．10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g

Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜

Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜 PAGE倒胶的仪器我们在前面WesternBlot仪器之选已经介绍过了，除了顺手的工具能防止漏胶，PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，小气病发作的后果往往是得不偿失——胶凝不好多半是这里疏忽（或者混合不匀），因为相对配胶的其他组分，AP算最活跃分子——如果还有诸如漏加某组分或者配比错误或者Buffer搞错，那绝对是你自己找骂，不值得同情。水要用去离子的纯水，MilliQ级更好。Cambrex(原来的FMC)有商品化的丙烯酰胺母液，很贵，也很好——配出的胶对200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE胶，条带清晰漂亮，可惜一直没有搞清楚配方的奥秘；但是数十倍于丙烯酰胺粉剂的价格令人却步，不过，对接触丙烯酰胺粉尘严重过敏的人可以选择这个。更加豪华的选择是已经凝好的预制胶，各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，当然更直接方便，更吸引人的是结果漂亮，分辨率高，特别是重复性好，条带真正是"razor sharp"啊！平时都能用这么豪华的东西心情当然超爽啊，实验紧凑又轻松，效率也更高啊！如果实验都能这么“好马配好鞍”，想必更容易出结果，也就更容易拿经费吧！什么时候我们的实验才能实现这种良性循环啊！Invitrogen旗下的Norvex和Cambrex（原来的FMC）PAGEr都是首选预制胶。可是在“社会主义初级阶段”这种奢侈品平时流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了新的优惠活动，买3盒NuPAGE预制胶就送电泳仪或者电转移，面对这种诱惑，你难道就没有一点非份之想的冲动？ 上样电泳：上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer （别小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。 电泳结果检查：如果要做Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng 蛋白。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot

Western Blot 原理和操作方法(详细)资料

Western Blot 原理和操作方法（详细） 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用. SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数

蛋白质印迹法westernblot

蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴

原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色

western转膜

western blot转移电泳一般操作流程 总的来说，半干转、湿转的程序和基本原理是相同的。胶和膜预稀释并用电转缓冲液平衡；滤纸/胶/膜/滤纸三明治放入电转设备中；正确的方向确保蛋白转移到膜上。合适的电压/电流条件对于电转的成败是非常重要的。

电转缓冲液和电转条件的选择 对于不同的电转设备，当选用不同的胶和缓冲液时，要求不同的电压/电流。变性凝胶需要增加电转时间，而低分子量的蛋白需要相应的缩短电转时间。现在实验室常用的Bio-rad 小型Mini Trans-Blot转印槽（湿转）和Trans-Blot半干转印系统转印槽（半干转）相应的电转参数如下表： 槽式转印半干转印 Mini Trans-Blot槽Trans-Blot半干转印系统转印槽印迹区域（宽 x 长）10 x 7.5 厘米24 x 16 厘米 转移参数 凝胶夹数 2 -

缓冲液要求450ml ≤200 ml 电极距离4cm 按夹层结构厚度确定 转移时间（高强度）60分钟15–60 分钟 冷却蓝胶冷却装置/冷却旋管- 凝胶容量 18.3 x 19.3 厘米- 1 块凝胶（2 块凝胶堆叠）16 x 20 厘米- 1 块凝胶（2块凝胶堆叠）16 x 16 厘米- 13.3 x 8.7 厘米- 3 个凝胶并列 8.3 x 7.3 厘米每个凝胶夹1块凝胶共2个 凝胶夹（两种尺寸）4个凝胶并列 8.6 x 6.8 厘米 通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD 以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。所以如果你所需要转印的蛋白分子量差得比较多（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。 而对于半干转，我们一般选择恒流（膜面积的3倍：3 mA/cm2）之间一般60分钟，同样根据蛋白分子量适当调节时间。 需要注意的是：低温对于膜的转印是至关重要的，尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率（胶用考马斯亮蓝加热染色，膜用

western 操作步骤

Western 操作步骤 （三）SDS——PAGE电泳 （1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后放在烤箱里烤干。 （2）灌胶与上样 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左右和下部封边） 2、配10%下层胶（10ml两块胶，每块胶5毫升左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶后胶上加一层甲醇（约1ml）液封，液封后胶凝的更快。 3、当甲醇和胶之间有一条折线时，说明胶已凝了。弃甲醇，并用吸水纸将甲醇吸干。 4、等待胶凝期间，准备好蛋白、细胞裂解液、上样缓冲液，上样总体积一般不超过30ul,上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白质变性，上样前在冰上放置3~5分钟。 5、配5%的上层胶（4ml两块胶，每块胶2ml），加入TEMED后立刻摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。 6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两竖直向上轻轻拔出。电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的伤员（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。 7、上样（注意：最外的两个泳道易跑歪，尽量不用）Marker 3ul （Marker加在最外边上的加样孔中）样本20~30ul （3）电泳：恒流25mA每块胶，两块胶50mA。电泳至溴酚兰刚跑出来即可终止电泳，进行转膜 （四）转膜 （1）转一张膜需准备四张滤纸和一张硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套（以防手上的蛋白污染膜）。将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1×转膜缓冲液浸湿。 （2）夹子黑的一面：海绵—2张滤纸—NC膜—胶—两张滤纸—海绵（刘老师的顺序），将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒来回赶几遍以赶走里面的气泡。在垫子上垫两层滤纸（光滑面临膜），放膜于滤纸上，将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下下层胶盖于膜上，用手调整对齐，再放两张滤纸（光滑面临膜）用玻璃棒赶去其中的气泡。最后盖下另一块海绵垫，擀几下就可以合起来了。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，否则会发生短路。如果同时做两块胶，转膜时要记住样本的位置。 （3）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的红面，夹的白面对槽的黑面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用35V过夜（刘老师）。 转膜时点击方向注意是膜正胶负转膜结束前配制封闭液（3%脱脂牛奶）及1×TBST缓冲液。 （五）免疫反应 （1）封闭：将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭30分钟。 （2）一抗 A.从封闭液中取出膜，1×TBST 5min ×4次 B.将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体，室温下孵育1小时后，4度过夜，次日用1×TBST

westernblot详细图解详细版.docx

Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转 移到固相载体（例如硝酸纤维素薄 膜）上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；

SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提

Western 转膜步骤 操作方法

Western 转膜步骤操作方法 Western转膜步骤(建议用伯乐电泳系统来操作完成) 下面的步骤适用于通过Xcell Ⅱ转印系统进行蛋白印记的大部分应用。为达到最佳效果，用户的优化是必要的。 I. 所需材料：?Xcell SureLock?或Xcell Ⅱ?Mini-Cell以及Blot Module（Cat. Nos. EI10001, EI9001及EI9051） ?电泳后的迷你胶（mini-gel）（最大的尺寸9cm*9cm） ?预先切割好的印记膜： 硝酸纤维素（Cat. no. LC2000或LC2001）， PVDF（Cat. No. LC2002）或Nylon+（Cat. No. LC2003） ?转印垫（Cat. No. EI9052） ?甲醇 ?去离子水 ?转移缓冲液（配方见下文） ?用于平衡膜，滤纸和转移垫的浅盘 II. 规格： 转印槽尺寸：14.5cm x 14cm x 11cm Blot Module容积：约200ml 下缓冲液槽容积：600ml Blot尺寸：约9cm*9cm 注意：在以下步骤中，应该始终使用手套以避免凝胶和膜的污染，并防止接触电泳和电转过程中常用的刺激物。 Ⅲ材料制备 a) 转膜缓冲液- 请注意对大多数转膜我们推荐使用强度减半的Towbin缓冲液，其中含有20％的甲醇。使用Xcell Ⅱ转印系统进行成功的转膜，0.5Xtowbin缓冲液就可以提供足够的离子强度，而不产生过多的热量。这种缓冲液可能不适合其它的转印系统，反过来也是这样。一升的转膜缓冲液制备方法如下（含20％甲醇的0.5X Towbin） 使用我们的Tris-Glycine转膜缓冲液：去离子水760 ml 转膜缓冲液（Cat. No. LC3675）40 ml (25×未稀释液) 甲醇200 ml 总体积1000 ml 自己制备Tris-Glycine转膜缓冲液： Tris 碱(12mM) 1.45 g 甘氨酸(96mM) 7.2 g 甲醇（20％终浓度）200 ml

western的操作步骤Word版

Western Blot操作全过程 一，收蛋白 a（如果要收集死细胞） 1.取冰，将4°C离心机提前降温。 2.将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量 的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。 3.弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。 4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。（1×Cell Lysis Buffer： PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。PMSF 常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。） 5.冰上裂解15min，将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm， 15min。 6.小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。如：100μL。 7.将收集好的蛋白保存与—20°C。（可长期保存） b （如果不收集死细胞） 1．弃上清，孔板PBS洗1-2遍，吸尽PBS。在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。（同上） 2．冰上裂解15min，用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。（不同的孔不能用同一个刮子，刮前用水冲洗，擦干。） 3．将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。

4．小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。 5．将收集好的蛋白保存与—20°C。（可长期保存） 二，测蛋白浓度 BCA法（或者按照自己的试剂盒说明操作） 1.需96孔板，测蛋白浓度的A液，B液，标准蛋白，要测的样品蛋 白。 2.按要测的样品蛋白的数量来配AB液，每孔需AB混合液80μl（A： B=50：1）。例：有5个样品，加上5个标准蛋白和空白对照。共有11个孔。则A液取11×80=880μl，B液取880÷50=17.6两液混匀，加入96孔板，每孔80μl。然后加入标准蛋白及样品蛋白4μl。（标准蛋白先配好浓度125，250，500，1000，2000） 3.将孔板放入37°C温箱孵育30min。 4.用酶标仪测蛋白浓度。 5.记下蛋白浓度，根据要上样的μg量算出μl量。例：蛋白浓度为 1000，需上样15μg。则需上样15÷1000=？上样量不超过20μl。 三，配胶 1.将薄板和厚板用洁净的布擦干净，对齐，夹好。（板必须擦干净， 下端对齐，否则容易漏胶。）

Westernblot实验步骤及注意事项

Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。/凝胶/）将此滤纸3．

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参 考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒 进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要 采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生

Western blot基本操作步骤

Western blot基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ 水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳 将电泳装置与电源连接。调节电压为100-200V，电泳50min，直至溴酚兰接近分离胶的底部，然后关闭电源并撤去连接的导线。