基于海马神经元细胞研究宁神灵抗抑郁作用机制

基于海马神经元细胞研究宁神灵抗抑郁作用机制

发表时间：2019-03-07T16:26:29.280Z 来源：《心理医生》2019年第4期作者：王赫霆

[导读] 研究宁神灵对抑郁症大鼠行为学及海马神经元细胞的影响

（哈尔滨市第十一中学黑龙江哈尔滨 150000）

【摘要】目的：研究宁神灵对抑郁症大鼠行为学及海马神经元细胞的影响。方法：正常大鼠随机分为空白组、模型组。采用慢性、不可预知性温和刺激（CUMS）结合孤养模型制作抑郁症大鼠模型，分中药治疗组（高、中、低剂量），对照组，各组15只，于第0、7、14、21、28天观察行为学指标（体重、糖水消耗实验、敞箱得分、大鼠活动延迟时间）。28天取大鼠海马组织，观察CA1、CA2、CA3、CA4区形态学变化及HE染色后脑组织的病理改变(Figure)。结果：相同时间点组间比较第7、14、21、28天行为学指标空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组。组内比较行为学指标高、中、低剂量组与时间呈正相关，空白组与对照组与治疗时间无差异。抑郁大鼠海马CA1区锥体细胞偶见散在的胞体固缩,深染或胞质溶解、空泡变性。CA4区可见少量锥体细胞胞体固缩,深染。治疗组大鼠

海马区神经元排列整齐，细胞体呈椎体形，较大，核大而圆，且与中药剂量呈正相关。结论：宁神灵可能通过作用于大鼠海马神经元细胞，引起相关蛋白及递质的改变，具有抗抑郁作用。

【关键词】宁神灵；抑郁症；慢性不可预知刺激；行为学；海马神经元

【中图分类号】R749.05 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2019）04-0045-02

抑郁症是一种以显著而持久的情绪失常为特征的综合征，该病具有高患病率、高致残率、高自杀率的特点。据世界卫生组织进行的全球疾病负担调查估计，到2020年由抑郁症造成功能残疾的人数将仅次于心血管疾病，上升至所有病种的第2位，并将占到全球因精神因素致残患者的1/3，因此，抑郁症已成为亟待解决的最重要的精神障碍[1]。近年来，关于抑郁症发病机制的研究很多，大多集中在神经递质、基因和社会因素等方面，但对于抑郁症发生和发展的分子生物学机制仍尚不明确[2]。

1.材料与方法

1.1 实验材料

健康雄性大鼠75只，正常大鼠随机分为空白组、模型组，采用慢性、不可预知性温和刺激（CUMS）结合孤养模型制作抑郁症大鼠模型，模型组分中药高（宁神灵5.04g/kg）、中（宁神灵2.52g/kg）、低剂量组（宁神灵1.26g/kg）、对照组。

1.2 研究方法

1.2.1行为学指标观察

（1）体重测定

实验过程中每周称量一次体重观察各组大鼠体重变化及增长情况以判断抑郁状态与体重变化的关系。

（2）糖水消耗实验

根据文献所有大鼠首先受训饮用1%的蔗糖水在开始的48小时内将蔗糖水放入笼中以代替自来水接着禁食禁水24小时通过称饮水瓶重量测量大鼠在1小时内蔗糖水的饮用量此后每间隔一周均进行禁水禁食及1小时蔗糖水测试，此过程贯穿于整个实验。

（3）敞箱得分实验

将大鼠置于高40cm，直径80cm周壁为黑色底面被分成面积相等的25块方格组成的旷场里，60W灯泡照明观测每只大鼠3min内水平活动和垂直活动得分。7:30～12:00之间在安静的房间内进行此项试验观察将大鼠置于敞箱中间观察大鼠穿越方格数（四爪均进入的方格可记数，为水平活动得分）、后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分）、清洁运动次数（理毛次数）、粪便次数。彻底清洁敞箱后再进行下一只大鼠的观察。每只大鼠测试3分钟。分别在造模前、给药前及给药后进行敞箱实验。

1.2.2标本采集

（1）HE染色

取大鼠脑组织，在4%甲醛溶液中固定24-48小时，用模具测量并用刀片切取海马区，石蜡包埋，进行切片和HE染色。使用光学显微镜对大鼠海马组织切片拍照，供分析使用。

（2）电镜显微结构观察

解剖获取大鼠脑组织，将脑组织迅速放入3%戊二醛固定液在4℃条件下固定过夜。用模具测量并用刀片切取海马区作为标本进行俄酸包埋，使用电子显微镜对大鼠海马组织切片拍照，供分析使用。

2.结果

本实验表明相同时间点组间比较第7、14、21、28天大鼠体重指数：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；糖水消耗实验：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；敞箱得分：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；大鼠活动延长时间：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组。组内比较行为学指标、高、中、低剂量组与时间呈正相关，空白组与对照组与治疗时间无差异。脑组织HE染色后，显微镜拍照观察脑组织的病理改变（Figure）。结果显示，模型组大鼠海马CA1区锥体细胞偶见散在的胞体固缩，深染或胞质溶解、空泡变性。CA4区可见少量锥体细胞胞体固缩，深染。治疗组大鼠海马区神经元排列整齐，细胞体呈椎体形，较大，核大而圆，且与中药剂量呈正相关。

3.讨论

抑郁症患者常伴有一些生物性节律改变，如睡眠障碍、食欲不振、便秘、身体乏力、精力减退、性功能障碍等，这些生理症状应用西药抗抑郁药很难解决，甚至一些西药还会加重上述障碍，在上市销售明确用于抑郁症治疗的天然药物及中药复方制剂中，不是治疗单一，就是疗效不显著，而且用药一段时间极易出现病情反复的现象，同时症状更加严重。传统中药在复杂的抗抑郁治疗方面具有明显的优势，很多研究都表明祖国传统的经方名方对于抑郁症的治疗能够达到很好的疗效[3]。研究发现，柴胡加龙骨牡蛎汤复方具有较强的抗焦虑、抗抑郁作用，其作用机制可能与增加了脑内单胺类神经递质的含量密切相关[4]。宁神灵冲剂由二组药组成，一组舒肝郁、平肝火、清痰热，另一组扶心阳固心气。收敛神气之浮越，合之调节心、肝二脏之功能，使之趋于平衡，神志之病，脏腑辨证在于此二脏，二脏平和，消除各种精神神经症状。与西药作用迥然不同，它针对神经抑制和兴奋过程失调而组方，通过双向调节大脑皮层兴奋和抑制神经的过程，消除

原代海马神经元细胞培养

原代海马神经元细胞培养 溶液的配制： (1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤， 室温保存。 (2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol?l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4?12H2O，1.7g；KCl， 0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。用0.2μm滤膜过滤，4℃保存。 (3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液 冻存。使用时，用解剖液稀释至0.25%。 (4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。将上述多聚赖氨酸 放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。 (5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04?7H20，0.18g； KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。 (6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。 (7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。 (8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg?ml-1的母液储存。用0.2μm滤膜过滤，-20℃ 储存。使用时，取6μl母液加入2ml培养液中，终浓度为3μg?ml-1。（根据实验情况调整浓度） 大鼠原代海马神经元细胞的培养 (1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解 剖液的培养皿中。 (2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。在分离出全 部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。 (3) 将培养皿中的海马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎 片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。

海马神经干细胞激活疗法简介

海马神经干细胞激活疗法简介世界卫生组织最新的一份统计调查报告显示，全世界86%的患有心理障碍、精神障碍疾病的患者久治不愈，其首要原因就是他们在接受治疗的初期就没能得到迅速精准的诊断，在这种病因不明、病理不合、病灶不准的情况下，该患者所接受的一切个性化诊疗都缺乏了严谨科学的准绳，以至于治疗的方向南辕北辙，治疗的最佳时机不断延误，治疗的成果微乎其微，患者们非但病情得不到有效缓解，而且还要饱经痛苦，高频率的遭受病情的恶化和反复! 国际脑组织权威机构研究发现：人体大脑海马区的功能性休眠、损伤、病患以及萎缩，都能导致各类心理障碍、精神障碍疾病的产生!而不同程度、不同位置的人体大脑海马区的病患，所诱发的疾病种类也各不相同!因此，如果能够成功精确的检测出人体大脑海马区的健康状态，并且有针对性对其进行康复性治疗，那么各种心理障碍、精神障碍类的疾病就毋庸置疑的拥有了彻底痊愈、不再反复的条件!而辽宁省精神卫生防治基地的“海马神经干细胞激活疗法”正是在这样一种需求背景下应运而生。 辽宁省精神卫生防治基地介绍该疗法体系传承自国医精华，结合现代西方医学尖端科技，利用国际先进的诊疗仪器产生电流，通过激活大脑海马区萎缩的神经干细胞产生神经递质受体，并利用中、西药的神经递质受体酶激活神经递质受体，通过药物

平衡患者体内分泌紊乱的神经递质，自神经类疾病的源头疏理，纠正脑细胞的功能元，营养大脑长期处于休眠状态的脑细胞，改善其活性，提高其自身代谢力，最终实现脑细胞的正常兴奋态，使患者的神经干细胞在平衡的神经递质环境中恢复到正常，达到彻底痊愈。 随着我国经济的高速发展和社会压力的加剧，精神疾病状况也愈发严峻。根据最新精神疾病流行病学调查，我国精神疾病总患病率高达15%，世界卫生组织(WHO)保守估计，我国各类精神疾病患者已达一亿人以上，精神病在我国疾病总负担中排名首位，约占中国疾病总负担的20%。在各类精神疾病中，抑郁症患者约有3000万。研究精神疾病、寻找战胜精神疾病的方法是全世界医学界的共同目标。 “海马神经干细胞激活疗法”是从中医学、基因学、病理学、心理学等众多学科角度科学诠释了精神疾病的发病机理以及针 对性的治疗措施，能够有效的从源头上根治精神疾病，是广大心理障碍、精神障碍疾病患者的首选技术，它的疗效值得肯定，它的出现使各种失眠、抑郁、神经衰弱、精神障碍等精神类疾病，真正实现了彻底痊愈、不再反复。

新生鼠海马、皮层神经元原代培养

新生鼠海马、皮层神经元原代培养 实验材料 1. 实验动物 新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。 2. 试剂 Hibernate A Neurobasal A B27 serum-free supplements Papin （木瓜蛋白酶） DNAase I OptiPrep Density Gradient Medium Poly-L-lysine （多聚赖氨酸） L-glutamine （L-谷氨酰胺） Penicillin （青霉素） Streptomycin （链霉素） D-Hank’s solution dd H2O 3. 溶液配制 1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。（可配成25×） 2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。 3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。在使用前3h内配制。

4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。可一次配好，-20°C保存，每次取用。 4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。现用现配，37°C保存备用。 5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。 5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。现用现配，37°C保存备用。 4．实验方法 1. 包被培养皿 使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。 2. 组织剥离 取出生12 h以内的Wistar大鼠，用75%乙醇擦拭全身消毒。无菌条件下断头，沿正中剪开皮肤和颅骨，向两边分开，小心取出全脑，浸于冰浴的解剖液。首先切除小脑和脑干部分，然后沿正中切为左右两半球，海马位于半球的腹内侧。分别在解剖显微镜下剥离出海马并置于冰浴的解剖液中，完整的海马（半侧）呈月牙形。用精细镊小心除去中脑、纹状体等非皮层结构，剥离出皮层。 3. 消化和分散 用精细剪将海马剪成1~2 mm3的组织块，在6 cm培养皿中用配好的木瓜蛋白酶在37 °C下消化30 min，4个半皮层或16个半海马/10mL消化液，并加入500 μL DNAase I。消化结束后小心吸去消化液，加入2~3mL HABG，200 μL DNAase I，

胎鼠海马神经元培养及其鉴定

［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究 工作. 昆明医学院学报2011，（5）：17～19Journal of Kunming Medical University CN 53-1049/R 胎鼠海马神经元培养及其鉴定 李玉1），王波1），但齐琴2 ） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，云南昆 明650031 ）［摘要］目的建立胎鼠海马神经元体外培养方法，观察细胞生长情况，免疫组织化学染色鉴定神经元特 异性．方法取胎鼠海马，分裂获得细胞悬液，接种于24孔板，经2h 差速帖壁去除成纤维细胞，将细胞液转移并继续培养，以获娶纯度较高的海马神经元．培养第5、11、15天观察细胞和突起生长情况，用NeuN 抗体以免疫组化SP 二步法染色鉴立神经细胞．结果培养头3d ．细胞生长缓慢，5d 时细胞开始生长，可见突起， 11d 时突起连成网状．经Neun 染色培养细胞呈阳性反应，证明是神经元．结论 本方法获取生长良好，纯度 较高的海马神经元． ［关键词］胎鼠；海马神经元；Neun ；培养 ［中图分类号］Q831.1+1［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2011）05－0017－03 I dent ificat ion and Cult ur e of Hippocampus Neur ons in Fet al Rat s LI Yu 1），WANG Bo 1），DAN Qi －qin 2 ） （1）Deat.of Neurosurgery ；2）Institute of Neuroscience ，Kunming Medical University ， Kunming Yunnan 650031，China ） ［Abstract ］Objective To establish the protocol for culturing hippocampus neurons in vitro and explore the neuronal growth character istics ．Methods Tissues from hippocampus of fatal rats were harvested ，then digested into cell suspension by using 0.125%trypsin ．After planted into wells for 2hours ，cell suspension was transferred into next well for continuing incubation ．The cell growth was observed at day 5，11and 15．Neurons specific Enolase （NSE ）antibody ，recognized specifically NSE antigen in cultured cells ，was used to identify neurons by SP-two-step staining method ．Results After incubated for 2hours ，transferred suspensions in wells showed some pure neurons ，which is identified by NSE staining ．However ，they grew slowly during 1～3days ，then grew well from 5th day ，with gradual increasing the neuritis outgrowth ．Conclusion Purified neurons with neurite outgrowth states can be acquired by this method. ［Key words ］Fetal rats ；Hippocampus neurons ；NSE staining ；Culture 海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用（细胞因子）的有效细胞模型，其在神经生物学，发育生物学体外实验研究中已被广泛应用[1-3]．然而，要获得纯度较高， 生长状态较好的海马神经元也不是一件易事．本实验长期从事海马神经细胞生物特性及其应用研究，故需建立该细胞模型．鉴于胚胎来源的细胞 生长状态较成年动物来源者好[4，5] ．本实验建立大

抗抑郁药的合理应用

抗抑郁药的合理应用 抑郁症具有发病率高、患病率高、自杀率高，而知晓率低、治疗率低等特点，给社会造成了重大的负担。随着抗抑郁药的发展，针对不同的抗抑郁药的药理特性，结合患者的临床特征，合理选择应用，对提高药物疗效具有重要的临床意义。 一、概念 抗抑郁药物 (antidepressant drugs) ：是一类治疗和预防各种抑郁障碍的药物，对强迫症、惊恐障碍、恐怖症和焦虑情绪以及和 5HT 相关的疾患有治疗效果。不会提高正常人的情绪。 （一）抑郁症的病理基础 1. 抑郁症与 5- 羟色胺能、去甲肾上腺素能、多巴胺能、胆碱能等系统功能障碍有关； 2. HPA 轴活性增高和甲状腺轴功能降低； 3. 神经发育障碍和细胞凋亡； 4. 其它。 （二）抗抑郁药物的机制假说—单胺递质理论 抑郁症与脑内生物胺的缺乏有关， 5- 羟色胺的作用是心境、冲动控制；去甲肾上腺素的作用是内在驱动力和动机；多巴胺的作用是奖赏。这些神经递质的耗竭如用利血平，可以导致抑郁；长期抗抑郁药物治疗可以改善这种情况。以下是 5-HT 和 NE 在中枢神经系统的功能。

第一代抗抑郁药其作用机制是怎样的？主要的代表药物有哪些，其不足主要表现在哪些方面？ 二、种类 （一）第一代抗抑郁药 1. 单胺氧化酶抑制剂 代表药物是苯已肼和反苯环丙胺，是第一个抗抑郁药，疗效与 TCAs 相当，可能存在严 重的不良反应和药物相互作用。使用时应注意：禁食含丰富酪胺食物，以免引起高血压危象。 禁与交感胺、 TCAs 、 SSRIs 等，以防引起 5-HT 综合症。 2. 新一代可逆性单胺氧化酶抑制剂 RIMAs 代表药物是吗氯贝胺，抑制作用具有选择性，新一代 RIMAs 对 MAO-A 选择性强，保留 了抗抑郁疗效，避免了诸多不良反应，对多种与抑郁相关的障碍有效，副反应小。

应激对成年海马神经发生的影响

应激对成年海马神经发生的影响【关键词】神经 近年来越来越多的研究表明成年中枢神经系统（CNS）的神经干细胞能不断地增殖分裂产生新的神经元，即在成年CNS仍存在神经发生（neurogenesis）。侧脑室的室管膜下区和海马齿状回的颗粒细胞下层是脑中两个主要的神经发生的区域。海马齿状回部位终生保持了生成新神经元的能力，在正常成年动物，每天有数以千计的新神经元形成。神经发生受到包括应激在内的多种因素的影响，这些区域的新生神经元会迁移，侧脑室的室管膜下区，大概在28d后几乎都迁移到嗅球，而海马齿状回的颗粒细胞下层的新生细胞部分迁移到颗粒细胞层，分化为颗粒细胞，产生树突、轴突，形成突触联系，整合到海马功能的神经环路中，参与海马的学习记忆等功能活动。我们结合近年来研究进展就应激对成年海马神经发生的影响作一综述。 1 海马区的神经发生 从结构上讲, 海马可分为海马回和齿状回(dentategyrus, DG) 两个部分。前者包括CA1、CA2、CA3、CA4 四部分, 主要由一些锥体神经元组成；后者则基本由颗粒细胞构成。早在20世纪60年代，采用[3H]胸腺嘧啶核苷标记方法就发现在成年大鼠海马、大脑皮质以及嗅球存在着神经发生现象。但是由于没有有力的证据证明新产生的细胞是神经元而非胶质细胞，并且具有神经元的相关功能，神经发生这一说法备受争议，在随后的20年间神经发生这一现象似乎被遗忘了。直到90年代随着技术方法的改进，成年脑神经发生进一步得到证

实。大鼠、猴子以及人类的神经细胞均具有终身增殖的能力，其增殖主要位于两个重要的脑区：海马齿状回和室管膜下区。各种细胞类型的分子克隆和免疫识别的新进展也证明了在成年哺乳类脑内存在着神经发生。新神经元产生于哺乳类和人类脑的两个脑区，即室下区和齿状回的颗粒下区。齿状回内新产生的颗粒神经元对学习与记忆很重要。新神经元来源于前体细胞，在细胞培养和组织原位中也转化为星形胶质细胞和少突胶质细胞的前体细胞。 早期研究利用[3H]胸腺嘧啶核苷标记分化细胞，其在细胞周期的S期能掺入进复制的DNA中通过放射自显影检测出来。后来用人工合成的BrdU（5溴3脱氧尿嘧啶核苷）取代了[3H]胸腺嘧啶核苷，BrdU是胸腺嘧啶脱氧核苷的类似物，胸腺嘧啶的碱基嘧啶环与5位C原子连接的甲基被Br取代，当细胞处于DNA合成期而同时有BrdU 存在时，BrdU就掺入到新合成的DNA中，BrdU用免疫细胞化学方法就能检测。这种技术通过改变BrdU注射和动物处死之间的时间差可以对新生细胞的增殖、分化、存活进行定量分析。由于BrdU有潜在的毒性作用，后来人们又找到其它的标记物，如增殖细胞核抗原（PCNA，DNA 聚合酶的辅因子）和Ki67（反映肿瘤增殖的标记物）作为反映细胞增殖的良好指标[1]。 在海马的齿状回颗粒下区，神经前体细胞增殖分裂产生新的颗粒细胞，新产生的细胞在分化成熟期进入颗粒细胞层，其轴突越过海马裂与CA3区锥体神经元树突发生突触联系，整合到海马的基本突触回路中，参与海马的功能活动。有报道显示，在哺乳动物的其它脑区，

小鼠海马神经元细胞使用说明

小鼠海马神经元细胞 小鼠海马神经元细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠海马神经元细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠海马神经元细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠海马神经元细胞产品简介： 产品名称：小鼠海马神经元细胞(Mouse hippocampal neuron cells)组织来源：小鼠海马组织区 产品规格：5×105cells/25cm2 培养瓶 小鼠海马神经元细胞简介： 海马椎体神经元是海马区的主要成分，主要功能是参与近期记忆、情绪及内脏功能调节、是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一。海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用(细胞因子)的有效细胞模型,其在神经生物学,发育生物学体外实验研究中已被广泛应用。 本公司生产的小鼠海马神经元细胞采用胰酶消化制备而来，细胞总量约为 5×105 个/瓶，细胞纯度可达 80%以上，且不含有 HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定

昆明医学院学报2011，（6）：29～32 CN53-1049/R Journal of Kunming Medical University 成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定 李玉1），但齐琴2），习杨彦彬2） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所， 云南昆明650031） ［摘要］目的观察体外培养成年小鼠海马神经细胞生长情况及其形态学变化．方法获取成年海马组织，制成细胞悬液，接种于培养板，分别于1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，用神经元特异烯醇化酶抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元．结果成年海马神经元接种后1～3d，有较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少量．每隔3d半量换液后，杂质不断减少，但第1周细胞生长缓慢，第7～10d才见细胞生长良好．培养15d后，大部分细胞出现有明显的颗粒等早期退化征象．免疫组化染色证实培养细胞呈现神经元特异烯醇化酶染色阳性染色，免疫阳性产物主要分布于细胞质；证明是神经元．结论体外培养成年海马神经元早期生长缓慢，7～10d才显示良好的生长状态，2周左右细胞则开始退变．提示10d以前的细胞是供体外研究用的理想细胞． ［关键词］大鼠；神经细胞；海马；细胞培养；免疫组化 ［中图分类号］Q813.1+1［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2011）06－0029－04 Cult ur e and Ident ificat ion of Hippocampus Neur ons in Adult Rat s LI Yu1），DAN Qi－qin1），XIYANG Yan－bin2） （1）Dept.of Neurosurgery，The1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650032；2）Institute of Neuroscience，Kunming Medical University，Kunming Yunnan650031，China） ［Abstract］Objective To observe the morphology and characteristics of hippocampus neurons in adult rats in vitro．Method The hippocampus tissues from adult rats were collected，then digested into cell suspension by using0.125%trypsin．Cell suspension was planted into wells and observed at day1，3，7，10，13，and15 after incubation．Neurons specific Enolase（NSE）antibody，recognized specifically NSE antigen in cultured cells，was used to identify neurons by SP-two-step staining method．Results During1-3days，the extensive bodies of floating cells and tissue blocks were seen，but a few cells attached to the bottom of well．The growth of attached cells was also extensively slow，specifically within1week，while it began to grow quickly after7days，and maintained till15days．Amazingly，cells exhibited aging character with more particles in cytoplasm after15 days．NSE staining showed that cultured cells were positive staining by neuronal specific enalose antibody．Conclusion Adult hippocampus neurons grow slowly during the first week，but they are better from7day to15，then begin to degenerate after15days in vitro．This suggests that neurons from hippocampus of adult rats cultured in10days could be better for related neurobiological studies. ［Key words］Adult rats；Hippocampus neurons；NSE staining；Culture ［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.

抑郁症背后一部分具体的生物学机制

抑郁症背后一部分具体的生物学机制。 某些怪病，想想都害怕。新闻版面被埃博拉病毒、疯牛病或早衰症之类疾病引起的悲剧占据，但在说到日常疾病的时候，几乎没有什么比重性抑郁更加普遍。它让生命失去光彩，让数以百万计的人（约占总人口的15%）变成残疾，并有可能在10年之内成为全球医学残疾的第二大原因。 很多因素都会增加罹患重性抑郁的风险，包括几种基因的变异、幼年精神创伤、内分泌异常和免疫功能异常等。压力是一个常见的诱因。近来的研究揭示了压力可能导致重性抑郁的机制。 从压力这个角度出发就要涉及到“快感缺乏”(anhedonia)这个心理学术语。它是重性抑郁之经典定义——“恶性悲伤”——的关键。 期待、追求和感受快乐的能力，关键在于大脑“伏隔核”(nucleus accumbens)区域内一种名叫多巴胺的神经传递素。华盛顿大学(University of Washington)的茱莉亚·莱默斯(Julia Lemos)、马修·瓦纳特(Matthew Wanat)、保罗·菲利浦斯(Paul Phillips)及其同事在《自然》(Nature)和《自然神经科学》(Nature Neuroscience)杂志上发表论文，探索了老鼠身上压力对多巴胺的影响。他们并没有简单地研究性或甜食等乐事的奖励属性，而

是考察了一种更加细微的快感。 在鼠笼里放一件新奇的物体，比如说一个球。当老鼠发现这个球并对其进行探查的时候，神秘、困惑、挑战的感觉出现，导致伏隔核中释放出一种名叫CRF、促进多巴胺释放的分子。如果意外出现的新奇物体是一只猫，老鼠大脑的工作机制就会大为不同。但获得最优数量的挑战（也就是我们所说的“刺激”）让老鼠感觉良好。 CRF协调这样一种反应：用一种药物屏蔽CRF的行为，那么便不再有多巴胺的激增，老鼠也不再会有探查行为。或者根据另一种实验方法，每逢老鼠溜达到笼子的某一个角落时就将CRF喷进伏隔核，那么老鼠就会反复回到那个地方；也就是说，CRF具有“强化特性”。 但如果将老鼠连续几天暴露于重性、持续的压力之下，一切就都不一样了。CRF不再增强多巴胺的释放，老鼠会避开新奇物体。另外，现在CRF有了嫌恶特性：把它喷进伏隔核，现在老鼠就不会再去笼子里那个角落。论文作者指出，这是缘于“糖皮质激素”(glucocorticoids)这种压力激素产生的作用。一切都反转过来了，一般情况下会激起积极探索行为与奖励感觉的刺激，现在激起的是相反的东西。值得一提的是，那几天的压力导致老鼠的快感缺乏状态持续了至少三个月。 和所有的好研究一样，更多的问题被提了出来：糖皮质激素是怎样引

抗抑郁药

抗抑郁药 用途：临床上常用的抗抑郁药指一组用于治疗抑郁症状的精神活性药物，有时也用于治疗某些其他特定状况，如焦虑、惊恐，或强迫症状。主要分为： ①三环抗抑郁药，包括丙咪嗪，阿米替林、氯丙咪嗪及多虑平（多塞平）等，为目前 较好的抗抑郁症药，其中以阿米替林为最常用。 ②四环抗抑郁药，临床常用的有麦普替林等，其作用和三环类相似。 ③③选择性5-羟色胺再摄取阻滞剂（SSRI），包括氟西汀，帕罗西汀（赛乐特）、氟 伏沙明（兰释）、舍曲林（郁洛复）、文拉法辛（博乐欣、怡诺思）等 ④单胺氧化酶抑制剂，如苯乙肼，异卡波肼，反苯环丙胺等。还有较新推出的新型抗 抑郁药，如瑞美隆等。 副作用：使人困倦、口干、视物模糊、便秘、心跳加快、排尿困难和体位性低血压，这类副作用一般不影响治疗，在治疗过程中可逐渐适应；严重的心血管副作用、尿潴留和肠麻痹少见。过量可致急性中毒甚至死亡。 一、经典抗抑郁药 1、单胺氧化酶抑制剂 异丙肼是上世纪50年代问世的第一个抗抑郁药物。异丙肼原是一种抗结核药，因有多说、多动、失眠和欣快感等中枢兴奋作用，1957年试用于抑郁病人并获得成功。动物实验证实其可逆转利血平引起的淡漠、少动，同时，脑单胺含量升高。推测其中枢兴奋和抗抑郁作用是因为大脑单胺氧化酶受抑制单胺降解减少，使突解间隙单受含量升高的缘故。从而提示了动物行为和大脑单受类递质之间的相互关系，有着重要理论和实践意义，为精神药理和精神疾病病因学研究奠定的基础。 属于这一类的还有异卡波肼、苯乙肼、反苯环丙胺等。这些药物曾一度广为应用，不久因陆续出现与某些食物和经物相互作用，引起高血压危象、急性黄色肝萎缩等严惩不良反应而被淘汰。 80年代后期出现了新一代半日受氧化酶抑制剂，即可逆性单胺氧化酶一个亚型（MAO-A）抑郁剂，它的特点是：1对MAO-A选择性高，对另一种同功酶MAO-B 选择性小，故仍可降解食物中的酷胺，从而减少高血压危象风险。2对MAO-A抑制作用具有可逆性，仅8-10小时即可恢复酶的活性，而老的半日胺氧化酶抑制剂抑制时间长达2周之久，因而也降低了与食物相互作用的危险。主要产品有吗氯贝胺，剂量150-450mg/d，分次服。据称疗效与三环类抗抑郁药相当。 虽比老的半日胺氧化酶抑制剂安全，但仍应注意体位性低血压及潜在的食物、药物间相互作用，一般也不作为首选药。 2、三环类抗抑郁药 以丙咪嗪为代表，常用的还有阿米替林。 化学结构：三环类抗抑郁药由两个苯环和一个杂环构成，咪唑类杂环上含氮，这一类衍生物较多，一般简称TCA 药理作用： 1．中枢神经系统正常人口服本药后，出现困倦、头晕、口干、视力模糊及血压稍降等。若连续用药数天，以上症状加重，并出现注意力不集中，思维能力下降。相反，抑郁症患者连续服药后，情绪提高，精神振奋，出现明显抗抑郁作用。但丙米嗪起效缓慢，连续用药2～3周后才见效，故不作应急药物应用。

海马细胞培养与鉴定

3.1海马原代培养操作 准备： 1、取海马：培养皿6个（3对），D-hanks（100ml，提前预冷），75%酒精，眼科镊2把， 小剪刀3把，小镊子4把（三个弯头，一个直头），冰袋3个，中号镊一把。 2、细胞室：小dish，多聚赖氨酸（1个EP），纸抽，细胞剪，胰酶（2个EP），DMEM（10% 胎牛血清+青霉素+链霉素，提前拿出），离心管2个，24孔板1个，细胞筛2个，废液缸1个, D-hanks 3、分装：胰酶：1ml、D-hanks:100ml、青霉素：500ul、链霉素：500ul、胎牛血清：10ml、 DMEM：90ml、B27：40ul、Neurobasal：1.6ml 4、玻璃器皿：移液管，培养皿，24孔板内的玻璃片，泡酸过夜，自来水清洗10遍，一蒸 10遍，三蒸3遍，烤干，高压，再烤干 步骤： 1、培养前30min包被多聚赖氨酸置于培养箱中备用； ↓ 2、75%酒精浸泡鼠，断头取脑（1把中镊，1把中剪） ↓ 3、剥离海马（D-hanks液，冰盒，4把小镊） ↓ 4、去血管、被膜（显微镊2把） ↓（进细胞间） 5、吸去多余D-hanks，剪碎，吸入15ml离心管 ↓ 6、D-hanks：胰酶=1:1，吹打20次 ↓ 7、15-20 min，37℃，期间5min震荡一次 ↓ 8、1:1比例加（DMEM+青链+胎牛血清）终止消化，吹打20次 ↓ 9、配平，1000rpm，5min ↓ 10、弃上清，得沉淀 ↓ 11、加（DMEM+青链+胎牛血清），吹打20次 ↓ 12、100目过筛， ↓ 13、放入15ml离心管，吹打

↓ 14、配平，1000rpm，5min ↓ 15、弃上清，得沉淀，加DMEM，吹打 ↓ 16、200目过筛 ↓ 17、计数（1×106） ↓ 18、500微升/孔（24孔板） ↓ 19、24孔板放入恒温培养箱中，37℃，5%CO2 ↓ 20、第二天换Neurobasal+B27（N:1.6ml，B27:40ul） ↓ 21、隔三天换液 注意事项：1、取海马的操作过程要迅速，提高神经细胞的存活率。 2、从断头处死鼠到胰酶消化前整个过程都要在冰上进行。 3、如果是胎鼠，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出 放到预冷的液体中。 4、一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。 5、吹打动作要轻柔，以免损伤细胞。 6、种板时密度很重要，过密和过稀都会影响细胞生长。 7、种板后需轻摇晃板，切记！不能圈圈摇晃。应左右平行，上下平行摇晃。 3.2 海马细胞的鉴定： 取培养7-9天的细胞 海马神经细胞特异性抗体：神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白质2（MAP2）、生长相关换蛋白43（GAP-43） NSE：神经元特异性烯醇化酶，血清NSE是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶 GAP-43：GAP-43是一种膜相关的鳞蛋白，与神经纤维生长的调节有关，主要分布于海马神经元的轴突 MAP2：MAP2是一种细胞骨架蛋白，定位于海马神经元的胞体和树突。

抑郁症的发病机制

抑郁症发生机制 摘要：抑郁症作为情感性精神障碍性疾病具有高患病率、高自杀率和低治疗率等特点，对社会危害极大，最近研究表明抑郁症病因复杂，至今尚未研究清楚，本文对最近几年的抑郁症研究进行综述。关键字：抑郁症；机制； 抑郁症是严重的情感障碍性精神疾病，多发病为青年，且发病率逐年上升，在现当代的生活中，生活、学习、工作的巨大压力下，在一定程度上，抑郁症的发病率也逐渐增加，据世界卫生组织的统计数据，预测2020年抑郁症的发病率将达到人口总数的10%，成为全球第二大常见疾病。 最新的研究表明抑郁症是一个涉及多机制复杂的病症，一般认为与生物化学，遗传，社会，环境有关，但至今尚未有统一的认识，近年来，多方面的研究表明，抑郁症是一种涉及多种神经递质、脑区及环路的疾病,脑内其他诸多生化物质及体内菌类或免役系统也参与了抑郁症的病理学过程。 一、免疫系统与抑郁症的关系 1、因子假说 细胞因子假说是关于抑郁症发病机理的重要假说,为探讨抑郁症的发病机理和临床治疗方法提供了新方向.细胞因子分为前炎性细胞因子和抗炎性细胞因子.前炎性细胞因子与抑郁症的发病密切相关，.前炎性细胞因子如白介素 1(interleukin-1,IL-1)、白介素 6(interleukin-6, IL-6)、干扰γ(interferon-γ,IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等参与免疫激活和炎症的发生,与抑郁症的发病有关[ 1］，前炎性细胞因子过度分泌从而导致去甲肾上腺素和5-HT系统功能障碍，引起抑郁症状［2］。 2、单胺假说 在抑郁症治疗过程中，抗抑郁药物多是通过增加突触间的神经递质的利用率来发挥作用的，单胺假说认为抑郁症的发生主要是中枢神经系统中的5-HT、NE释放减少，突出间含量下降所致，抗抑郁药主要基于(单胺策略)而研发,主要包括单胺重摄取抑制剂，单胺氧化酶抑制剂和单胺受体配体药物等"尽管效应明确,但也存在有效率不高、起效延迟等较严重缺陷" 经典单胺类递质理论认为抑郁症主要是突触间的单胺类递质异常减少引起。现代单胺理论认为,5-HT 及其单胺自身受体的适应性和可塑性调节与抑郁症治疗密切相关 ,近些年对 5-HT及其转运蛋白和受体研究取得了系列进展,如对5-HT转运体连锁区域中短( 5) 等位基因在情绪及认知方面积极作用的发现,5-HT相关受体

人不同胎龄胎脑海马神经干细胞发育规律初探

文章编号:1000-5404(2004)22-2061-03论著人不同胎龄胎脑海马神经干细胞发育规律初探 尹晓娟,杜　江,封志纯 (第一军医大学附属珠江医院儿科,广州510282) 提　要:目的　探讨人不同胎龄胎脑海马部位神经干细胞的发育规律。方法　收集胎龄16～32周的水囊引产胎儿100例,采用免疫组织化学和光镜技术对人胎脑海马部位神经干细胞的分布、形态、存在方式以及数量进行检测。结果　不同胎龄胎脑海马均存在神经干细胞,神经干细胞位于海马多形细胞层、锥体细胞层、颗粒细胞层及分子层,以多形细胞层、锥体细胞层及颗粒细胞层多见。细胞呈圆形、椭圆形、三角形及星形,以圆形和椭圆形多见,未见明显突起。细胞胞浆丰富,核呈圆形及椭圆形,染色质疏松,2～6个核仁不等。多数单个散在分布于其它神经元间,可见对称分裂现象,但有的神经干细胞呈簇状及群状分布,各组神经干细胞随着胎龄的增加呈减少趋势。结论　人不同胎龄胎脑海马广泛存在神经干细胞,各胎龄神经干细胞在分布部位、形态、存在方式及数量上存在一定的差异,海马可能是神经干细胞新的生发区。 关键词:神经干细胞;神经巢蛋白;人脑;海马 中图法分类号:R321;R322.81;R329.2文献标识码:A Development of neural stem cells in human hippocampus in the fetal brain at different developmental stages YIN Xiao-juan,DU Jiang,FE NG Zhi-chun(Department of Pediatrics,Zhujiang Hospital,First Military Medical University,Guangzhou 510282,Guan gdong Province,China) Abstract:Objective　To study the development of neural stem cells fr om human fetal brains at different devel-opmental stages.Methods　A total of100cases of embr yos at16-32gestational weeks by induction of labor with water ba g were collected for the determination of the distribution,forms,existing modes,and the number of neural stem cells in the hippocampus by SABC immunohistochemical method and light microscopy.R esults　Neural stem cells wer e found in the hippoca mpus at different fetal ages and located in the polymorphic layer,pyramidal,granular and molecular la yers of hippocampus,mainly in polymorphic layer,pyramidal layer,and granular layer.Neural stem cells in hippocampus were round,ellipse,triangle,and stellate,particularly round and ellipse.No obvious enation was found.Neural stem cells had plenty of cytoplasm.The nuclei were round and ellipse with rare chromatin and nu-cleoli from2to6.Most of neural stem cells were distributed among other neurons,and symmetric cleavage was found in some of them,but some neural stem cells were distributed in cluster and nest.The number of neural stem cells in hippocampus were different between gr oups and gradually decreased with the increasing gestational age.Conclusion Neural stem cells exist widely in the hippocampus at different gestational ages.Ther e are differences in distribu-tion,for ms,existing modes,and number of neural stem cells in hippocampus at different gestational ages.Hipp-ocampus may be the ne w originating region of neural stem cells. Key words:neural stem cell;nestin;human brain;hippocampus 神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的发现彻底打破了神经不能再生的传统观念,不仅将神经科学研 基金项目:广东省科技联合攻关项目(B30502) Supported by t he Key Sc i&T ech Research Proj ect of Scie nt ific Co mm ittee of Guangdong Pro vince(B30502) 作者简介:尹晓娟(1966-),女,湖南省邵阳市人,博士研究生,主治医师,主要从事新生儿疾病、遗传性疾病及胚胎神经发育方面的研究,现在 在第三军医大学西南医院儿科,重庆400038。电话:(023)66359952 通信作者:封志纯,电话:(020)61643369,E-mail:zhjfe ngzc@sohu.co m 收稿日期:2004-03-04;修回日期:2004-07-03究推向了前沿,为神经发育和神经组织移植等领域开辟了广阔前景,同时给临床颅脑损伤或其它神经系统退行性疾病等治疗带来新的希望。国外研究表明,哺乳动物成年脑在未受损部位出现了间断性神经生发,诱导因素能使在体的脑组织发生内源性神经再生[1]。目前采用神经干细胞植入脑组织已经在临床取得了肯定的疗效,但激活脑内源性的神经干细胞实现自我修复仍然处在实验研究的初期[1,2]。迄今对于神经干细胞的原位调节仍然是一无所知,这负面影响了细胞移 2061 第26卷第22期2004年11月 第　三　军　医　大　学　学　报 ACTA　ACADE MIAE　MEDICINAE　MILITARIS　TERTIAE Vol.26,No.22 Nov.2004 DOI:10.16016/j.1000-5404.2004.22.032

小鼠海马神经元的培养

小鼠海马神经元的培养 一、实验材料： 1、所有用于细胞培养的器械、器皿剂溶液必须灭菌消毒。 2、多聚赖氨酸铺板以磷酸盐缓冲液(PBS)或蒸馏水溶解多聚赖氨酸（分子量为30-70KD）至1mg/ml。分装储存。临用前稀释至终浓度为20-60mg/ml过滤备用。在培养板或皿中加少量多聚赖氨酸溶液，以覆盖底部为宜，在37℃、CO2孵箱中过夜。次日，用移液管吸取多聚赖氨酸，并用水洗2-3遍，晾干备用，如果培养目的适用于电生理的单细胞记录或者免疫组化和荧光染色，则在培养皿的底部加上盖玻片，多聚赖氨酸铺于盖玻片上，则更易得到强烈的荧光信号。 3解剖液（HEPES平衡盐溶液）取100ml10x平衡盐溶液（Hank’s balance salt solution,HBSS） HEPES 3.9g, NaHCO30.84g， 青霉素104U, 链霉素100mg， H2O800ml。 以1mol/LHCl调节PH至7.2，再加H2O之后总体积为1L，以0.2μm 直径的滤菌器过滤，4℃保存。 4、DMEM培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）DMEM培

养基500ml，加小牛血清和或马血清各10%（血清需经56℃，30min灭活）1%的青/链霉素. 5、无血清培养基最常用的一种无血清培养基为，Neurobasal+2% 的b27+1%抗生素 6、2.5%胰蛋白酶（typsin）溶液临用前以解剖液稀释至终浓度0.125%。 7、台盼蓝(typan blue)溶液终浓度为0.2%-0.4%。 8、阿糖胞苷终浓度为8-10μmol/L。 9、动物妊娠天数的选择通常选择出生24h之内的乳鼠。 二、实验步骤： 1、脱臼处死乳鼠，75%的酒精浸泡3-5min，将清洗完的乳鼠放入含预冷解剖液的培养皿中。 2、用两把尖镊逐个去除鼠的头部皮肤和颅骨，取出全脑，置于另一含预冷解剖液的（PBS）培养皿中，小心剥离并去除脑膜及脉络丛。 3、在中线处用尖镊分离大脑半球，在解剖显微镜下小心去除嗅球、中隔、丘脑及下丘脑，剥离脑膜及脉络丛，在大脑皮层下方小心取出海马，置于含冰冷解剖液的6cm培养皿中。 4、用弯头尖镊把海马剪成小碎片，收集全部海马碎片，置于一含有0.25%胰蛋白酶溶液的培养皿中（该溶液必须在37℃孵箱中预暖）,在孵箱中消化5-7min。 5、收集全部海马碎片，置于10ml预暖的DMEM培养基的试管中（培养基中含有10%的胎牛血清和或马血清各，1%抗生素，以及谷氨酰胺）。