凡纳滨对虾血淋巴_类淋巴细胞培养_罗鹏

海洋通报卷

28 24

果，选定一种培养液，再以 2.5 % 的和的 HCl 7.5 % NaHCO 3调节

至以确定培养液的最佳。四种培养液的成分具体见表。

pH 6.8 ~ 7.4 pH 1实验动物的处理及组织培养对虾在实验前用含有抗生素青霉素、链1.2.3 ( 100 IU/mL 霉素μ的过滤煮沸冷却海水暂养过夜，使用前用灭菌冷却蒸馏水冲洗体表，再投 100g/mL ) 入的酒精中消毒体表，取出后用滤纸吸干体表及鳃的酒精和水分。头胸甲与腹 70 % 10 min 部第一腹节交界处之围心窦抽取血淋巴。采血前预先用半胱氨酸湿润针管或预先

0. 25 % L-抽取的于针管。抽取血淋巴后立即将其注入含有培养液的 1 ~ 1.5 mL BSS 2 mL 25 cm 2玻

璃培养瓶，静置后小心倾去旧液，换入新鲜培养液。

2 ~ 24 h 2 mL 取血后取类淋巴器官，为减少体内可能含菌污染，先用除菌液青霉素、 ( 5 000 IU/mL 链霉素μ或联合除菌液青霉素、链霉素μ 5 000g/mL ) ( 5 000 IU/mL 40 % 5 000g/mL

、碧洁浸泡类淋巴器官、、，漂洗次，剪切成约40 % 20 % ) 102030 min BSS 3 ~ 4 1 mm 3的

小块，植入培养瓶，加入少量培养液，于 CO 2

培养箱中℃密闭培养。待组织有细胞 27 ~ 28 迁出后补加培养液。每天用倒置显微镜观察生长状况，每换培养液一次。

1.5 mL 4 ~ 7 d 细胞死活的检测和观察参照文献，对培养细胞进行台盼蓝染色，结合细胞形态1.

2.4 6学观察，判断细胞的死活和活力。

结果

2 培养液选择

2.1 实验初采用血淋巴细胞对培养液配方进行摸索。发现血淋巴在四种培养液中均能生长，以号培养液含的×培养基，的，的效果较好，故选 4 ( 60 % 2L-15 20 % FBS 20 % SME ) 用号培养液作标准培养液使用，再调节号培养液的至，结果发现，培养液 4 4 pH 6.8 ~ 7.4 维持在时血淋巴和类淋巴细胞生长最好，且类淋巴细胞迁出迅速。而当培养液pH 7.0 ~ 7.2 大于或小于时，血淋巴细胞很快颗粒化并死亡，类淋巴组织块没有细胞迁出。

pH 7.2 7.0 血淋巴细胞培养

2.2 后，大部分血淋巴细胞即贴壁，后贴壁血淋巴细胞均开始伸展成多角样或披针2 h 14 h 形，细胞胞质极薄、透明、核明显。多角样细胞体积较大，内部有一些细小颗粒，披针形细胞体积较小，核小，内部极少颗粒图版Ⅰ。后细胞胞质部分逐渐向细长伸展，并互 ( -1 )7 d 相连接拉伸成网状，细胞开始积累大量折光性强的颗粒，并开始解体死亡。披针形细胞，一般滞后多角样细胞死亡，但偶尔有少数贴壁细胞存活长达以上。

1 ~

2 d 30 d 血淋巴另有一些稚幼细胞，始终呈悬浮状态，圆形。此类细胞大小差别悬殊，但体积小者占绝大部分图版Ⅰ，核质比很大，胞浆极薄，染色可看到染成紫黑色的大核 ( -2 )Giemsa 和外层极薄的粉红色胞浆，偶尔可见分裂相图版Ⅰ，此类细胞存活达以上。

( -3 ) 60 d 培养过程中如未及时去除对虾血清，十几小时后培养液即黑化严重，细胞虽能沉降贴

注：每种培养液均参照等 Chen [4]的方法，添加渗透压调节液，调 节培养液渗透压至左右

650 mOsmol/kg

期罗鹏等：凡纳滨对虾血淋巴、类淋巴细胞培养1 29壁，但伸展差，并迅速衰老死亡。

类淋巴细胞培养

2.3 植块以后，组织块周围即长出

1 d 圆形、光滑透亮的细胞，并有部分细胞

伸展；后，大量细胞迁出，形成

2 ~

3 d 生长晕。来自类淋巴器官不同组织的组

织块，在细胞迁出形态和单层细胞形态

上有明显不同。第一类组织块的生长晕

前哨细胞呈火焰状，后即形成单层，

6 d 单层细胞呈纤维样图版Ⅰ；第二类

( -4 )组织块的生长晕前哨细胞散乱分布，形

成单层细胞呈多角状，细胞间的界线不明，胞质清亮图版Ⅰ。后，淋 (-5 )16 d 巴细胞开始出现较多亮颗粒，细胞轮廊增强，后，单层细胞开始碎裂，脱20 d 落，细胞固缩化。

其它

2.4 为排除对虾体内可能含菌污染以及操作失误，培养中采用除菌液、联合除菌液对组织块除菌。发现除菌液、联合除菌液对组织块除菌、均能减少组织块污染，其中 10 min 20 min 以联合除菌液效果好，极少再发生污染，倒置显微镜下观察未见对细胞有不良影响。但除菌时间超过，细胞受到损伤，组织块无细胞迁出。

20 min 讨论

3 对虾细胞培养采用的组织多种多样，从报道来看，类淋巴组织细胞培养较易成功。本实验也得到相同的结果。在本文实验条件下，类淋巴组织细胞迁出，可形成单层，单层细6 d 胞可维持存活以上，且类淋巴组织是、等多种对虾病毒感染的敏感组织， 16 d MBV WSSV 因此本实验结果可以满足病毒体外感染实验要求。

,在本实验中，培养液的高于或小于，血淋巴细胞不能生长且类淋巴细胞不能 pH 7.2 7.0迁出，这说明保持培养液适宜并维持稳定对于原代培养十分重要。对虾血清提供了对虾pH 细胞生活的内环境，理论上应该更有利于对虾细胞生长，但在本文血淋巴细胞培养中，对虾血清的存在极易使培养液变黑，细胞迅速衰老死亡，因而对血淋巴细胞培养反而起一种毒害

作用。高玮等 [7]对斑节对虾血淋巴进行培养也得到相同的结果。等 Owens

[8]在斑节对虾多 种组织培养液中添加的对虾血清，结果细胞均不能存活，因此推测体外暴露环境下， 10 % 血淋巴中的一些促生长因子与培养基的某些成分作用，而使其失去促生长作用。也不排除血清中某些因子在体内时以前体形式存在，体外暴露条件下，前体被激活而破坏了血清中的促生长因子，并改变培养基的颜色。体外对虾血清对自身组织细胞的抑制作用原因尚需进一步探讨。

培养基提供了对虾细胞生长的基本营养，是影响培养结果最重要的因素之一。目前尚没

有适用于对虾的商业性专用培养基，多采用哺乳动物或昆虫细胞培养基，已使用的培养基

血淋巴细胞贴壁所形成的单层×；呈悬浮状态的血淋巴1 ( 340 ) 2 细胞×；少数悬浮状态的血淋巴细胞可见到分裂相 (340 ) 3 (1 000

×；第一种类淋巴组织所形成的单层×；第二种类淋) 4 ( 340 ) 5 巴组织所形成的单层× ( 340 )

图版Ⅰ血淋巴、类淋巴组织细胞培养

ⅠPlate Cell culture from hemolymph and lymphoid tissues

海洋通报卷30 24 有：－＆和－等。其中

L 15, M199, ACM, GIM, M M, TC100, SDM, LHM, CMPLT RPMI 1640 以

－和使用最为广泛 L 15 M199 [9]。虽然在本文中使用了培养基并添加了和 L-15 FBS ，但均不能支持体外培养的凡纳滨对虾细胞长期存活及增殖。显然仅通过培养SME L-15 基、和提供营养和生长因子是不充分的，开发出适用于对虾的商业性培养基以及FBS SME 探索新的对虾细胞生长因子将极大加快对虾细胞培养的研究进展。

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[9] Toullec J Y. Crustacean primary cell culture: A technical approach [J]. Methods in Cell Science, 1999, 21: 193-198.作者简介：罗鹏—，男，在读博士生，主要研究方向：水生动物病害。

( 1977 )Cell Culture from Hemolymph and Lymphoid Tissues of Shrimp,

Litopenaeus vannamei

LUO Peng 1, QIU Dequan 2

( 1. South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, Guangdong ,China;

2. Zhanjiang Ocean University, Zhanjiang 524025, Guangdong, China )

Abstract : Primary cell culture from hemolymph and lymphoid tissues of shrimp,

L itopenaeus van namei × was carried out in this article. Culture media was based on 2L-15 medium, supplemented with fetal bovine serum (FBS) and shrimp muscle extract (SME) at different proportions. The ×result of cell culture was better when the proportions of 2L-15 medium, FBS and SME are 60 %, 20 % and 20 %, respectively. Cells from hemolymph and lymphoid tissues grew best and lymphoid cells emigrated quickly when pH of the media was kept at the range from 7.0 to 7.2. Most of hemolymph cells attached fast and stretched into multiangular or acerose shape with an average life span of 7-9 days. Few round cells suspended and survived over 60 days. In the hemolymph cell culture, cells would age and die soon unless shrimp serum was removed . Lymphoid cells formed a single layer within 6 days and they were mainly classified into two types according to the attaching shape: multiangular and fibroid. These cells could survive more than 16 days.

Keywords : L itopenaeus vannamei ; hemolymph; lymphoid; cell culture

淋巴细胞培养后主动免疫治疗反复自然流产疗效评价

#生殖医学# 淋巴细胞培养后主动免疫治疗反复自然流产疗效评价 武美丽 柳肃芬 作者单位:730050 甘肃,甘肃省妇幼保健院生殖免疫诊疗 反复自然流产(recurrent sp i n taneous abo rtion,RSA )是妇科常见病之一,除遗传、内分泌、感染、自身免疫、解剖因素外,80%以上原因不明 [1] ,成为临床难治性不育症。近年来国内外学 者根据Beer 等[2] 在1981年创立的淋巴细胞主动免疫疗法,对原因不明的反复自然流产(unexpla i n ed recurrent spontaneous aborti o n ,URSA )患者大胆采用丈夫和无关个体淋巴细胞进行主动免疫治疗,大大提高了URSA 的临床诊治水平。2006年3月~2007年6月,我们运用配偶淋巴细胞培养后皮内注射法对40例URSA 患者进行治疗,并观察妊娠预后,取得了较好的治疗效果,现报道如下。 对象与方法 11对象:2006年3月至2007年6月,就诊本院生殖免疫诊疗中心门诊的RSA 患者。详细询问病史、经妇科检查、子宫输卵管造影或宫腔镜检查证实无生殖器器质性病变,内分泌化验正常,体温双相,黄体期不少于12d,且较平稳,夫妻染色体核型正常,TORC H 常规检查无异常,排除血型不合,自身免疫无异常(抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗精子抗体、抗透明带抗体等阴性),配偶精液常规在正常范围者诊断为URSA 。对其符合条件的66例URSA,经征求意见表示愿意参加研究,并签知情同意书,根据患者的自愿分为3组,孕前实行主动免疫治疗(孕前治疗组)20例,确诊妊娠后实行主动免疫治疗(孕后治疗组)20例,对照组26例。对照组采用黄体酮保守治疗。3组年龄(23~35岁,平均年龄29岁)、健康状况、流产次数(既往曾发生自然流产2~10次,平均流产次数314次)及流产时间(流产时孕周为5~12周,平均孕周7周),差异无统计学意义(P >0105)。 21淋巴细胞的培养:全部采用RSA 患者配偶 为供血对象,身体健康,传染病4项正常(甲肝病毒、乙肝病毒、梅毒螺旋体、爱滋病病毒检测阴性)。无菌技术抽取配偶外周抗凝全血30m ,l 常规肝素抗凝,与等量磷酸缓冲液(phosphate ba-l anced so l u ti o n ,PBS)混合,使用Fico ll-H ypaque 法密度离心分离外周血单个核细胞(periphera l b l o od m ononuc lear cel,l PB M C)。用RP M I 1640培养液洗涤离心2次,加入培养液后置于培养瓶中于37e 5%CO 2培养箱内。培养液配制,每1m l 含RP M I 1640为0173m ,l 其中含重组人C -干扰素0105万U /m ,l 植物血凝素(phytohe m agg l u ti n i n ,P HA )0102m g /m ,l 5%小牛血清(012m l)。培养细胞内毒素和细菌培养阴性,酚红染色细胞活率\85%,培养72h 后的细胞再用019%氯化钠溶液洗涤2次,调整至细胞数为20~30@106 /m l 方可用于治疗。 31免疫治疗方法:孕前治疗组20例孕前治疗3次后嘱其妊娠,如3月内未受孕,行输卵管通液,并在排除不育症的情况下重新加强1次主动免疫治疗。妊娠35d 加强免疫1次,此后每3周治疗1次。孕后治疗组20例在确定怀孕后开始主动免疫治疗。2组均每3周给患者双侧前臂皮内多点免疫注射1次,每次每点为013~015m ,l 直至妊娠14周。课题组人员固定,接受本免疫疗法者不接受对该病的其它治疗。对照组26例URSA 患者再次妊娠后仅以黄体酮常规保胎药物治疗到妊娠12周停药。 41疗效判断标准:妊娠达28周以上,或分娩正常新生儿为成功妊娠,再次流产、死胎及新生儿畸形作为妊娠失败。 51统计学处理:采用SPSS 1010软件进行数据 分析,分析方法为V 2 检验,P <0105判定差异有统计学意义。 结果 40例URSA 患者经配偶淋巴细胞免疫治疗后,

人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析完整版

人体外周血淋巴细胞培 养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科

淋巴细胞分离液说明书

Lonza Walkersville, Inc. https://www.sodocs.net/doc/977309390.html, biotechserv@https://www.sodocs.net/doc/977309390.html, Tech Service: 800-521-0390 Document # INST-17-829-1 06/07 Walkersville, MD 21793-0127 USA ? 2007 Lonza Walkersville, Inc. Lymphocyte Separation Medium Instruction For Use 17-829E Introduction Lymphocyte Separation Medium (LSM) is a mixture of Ficoll? and sodium diatrizoate (Hypaque) with density adjusted to 1.077 g/ml. This sterile filtered product is intended for laboratory/manufacturing use, and is not for in vitro diagnostic use. It is commonly used to isolate lymphocytes from human blood. One protocol to accomplish this is presented here. Protocol 1. Anticoagulated blood (citrated or heparinized) should be used. Note: Always treat human and other primate source material as potentially infectious and take safety precautions. 2. Dilute blood 1:1 with calcium-magnesium-free PBS and layer 9 ml onto 6 ml LSM. Use a clear plastic centrifuge tube with a cap. For large volumes use a similar ratio of diluted blood to LSM. 3. Centrifuge at 400xg for 15 minutes. 4. Remove plasma-PBS without disturbing the interface. 5. Collect the interface with a cannula and dilute to 20 ml in serum-free medium, such as RPMI 1640. 6. Centrifuge at 70xg for 10 minutes. 7. Discard supernatant fluid and resuspend pellet in 2-3 ml serum-free medium. 8. Count nucleated cells on a hemocytometer or electronic counting device. 9. Lymphocytes will be concentrated at the interface, along with some platelets and monocytes. Granulocytes will be found mostly in the Lymphocyte Separation Medium and erythrocytes will pellet at the bottom of the tube. References 1. Boyum, A. 1968. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 97:77-89. 2. Boyum, A. 1976. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 5:9-15. 3. Boyum, A. 1977. Separation of lymphocytes, lymphocyte subgroups and monocytes: a review. Lymphology. 10-2:71-6. 4. Boyum, A. 1984. Separation of lymphocytes, granulocytes and monocytes from human blood using iodinated density gradient media. Methods Enzymol. 108:88-102. 5. Boyum, A. et al. 2002. Separation of Human Lymphocytes from Citrated Blood by Density Gradient (NycoPrep) Centrifugation: Monocyte Depletion Depending upon Activation of Membrane Potassium Channels. Scand. J. Immunol. 56-1:76-84. 6. Koistinen, P. 198 7. Human peripheral blood and bone marrow cell separation using density gradient centrifugation on Lymphoprep and Percoll in haematological diseases. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 47-7:709-14. 7. Rola-Pleszczynski, M. and W.H. Churchill. 1978. Purification of human monocytes by continuous gradient sedimentation in ficoll. J. Immunol. Methods. 20:255-62. Product Use Statement THESE PRODUCTS ARE FOR RESEARCH USE ONLY. Not approved for human or veterinary use, for application to humans or animals, or for use in clinical or in vitro procedures. INST-17-829-1 06/07 Ficoll is a trademark of GE Healthcare. All other trademarks herein are marks of Lonza Group or its subsidiaries. 1

凡纳滨对虾的遗传育种研究现状

研究综述 R EV I EW S 凡纳滨对虾的遗传育种研究现状 A revie w of genetics and breeding of L itopenaeus va nna mei 张灵侠,沈　琪,胡超群 (中国科学院南海海洋研究所,广东广州510301) 中图分类号:Q953.1 文献标识码:A 文章编号:100023096(2008)022******* 凡纳滨对虾(L itopenaeus v annamei Boone),由于其生长快,抗环境变化能力强,对饵料的要求低,肉味鲜美、出肉率高,成为世界上公认的优良养殖对虾品种之一。凡纳滨对虾自1998年从美国夏威夷再次引进到中国华南,并相继突破集约化防病养殖和全人工繁育技术以来[1],已成为中国海水养殖动物中发展最快的一个种类,其养殖产量已达到中国养殖对虾产量的80%～90%。然而目前中国凡纳滨对虾亲虾多数直接从虾塘挑选,造成品质参差不齐,抗病力下降,生产周期延长,严重制约了中国凡纳滨对虾养殖业持续健康发展。凡纳滨对虾亟需形成稳定优良的养殖品系。 对虾的遗传育种工作,起步较晚,基础较差,但近年来由于各种生物技术和分子生物学技术应用于对虾的遗传学和育种研究,研究步伐明显加快。作者主要对凡纳滨对虾的遗传学和育种学研究概况进行总结和评述,为进一步开展凡纳滨对虾的遗传育种学研究提供参考。 1　遗传学 1.1　基因组和染色体数目 细胞遗传学是进行遗传育种的基础,对虾细胞遗传学研究最早是Carnoy报道了褐虾(Crangon cat a p hract us)的染色体。到目前为止,已报道的对虾属虾类共有12种,染色体数目变化范围较小,多数对虾二倍体数目为88,少部分为92,其中凡纳滨对虾染色体数目尚有争议。1982年Mayorga[2]报道凡纳滨对虾染色体数目为2n=92,后来Chow[3]发表的研究表明凡纳滨对虾染色体数目为2n=88,同时Chow[3]用流式细胞仪(flow cytoment ry)测定了凡纳滨对虾的基因组大小,大约是人类基因组的70%。最近邱高峰等[4]统计了凡纳滨对虾的有丝分裂染色体数目(2n)和减数分裂二价体数目(n),报道凡纳滨对虾染色体数目为2n=88,n=44,与Chow 等研究结果相一致。 1.2　数量遗传学 许多具有重要经济价值的遗传性状,如生长速率、体质量、抗逆性、抗病性、饵料转化系数等,均为数量性状,由微效多基因控制。研究和改良数量性状是遗传学和育种的重要内容。但水生动物不像陆生动物,易受到很多条件的制约。如研究重要经济性状需要的大量亲本、明确的家系和相配套的养殖条件[5]。现在凡纳滨对虾、斑节对虾(Penaeus monodon)、日本对虾(Penaeus j a ponicus)已经成功获得了大规模确定交配的家系[6,7],加快了特定选育目标的实现。估算遗传力(heritability)大小对于选择育种具有重要指导意义。根据相关文献,由全同胞来估算对虾生长速度的遗传力是0.3～0.5[6～9],为指导对虾生长性状选育奠定了理论基础,然而凡纳滨对虾经一代选育后,其生长力只有4.4%[6]。暗示估算遗传力受环境的影响很大,且估计值存在较大的标准偏差。凡纳滨对虾有关数量性状的遗传力如表1。最近刘小林等[10]研究了凡纳滨对虾形态性状(头胸甲长、体长、头胸甲宽、尾长等)与体质量之间的关系以及对体质量的直接影响大小,通过形态性状的选择达到选种目的。 收稿日期:2005201206;修回日期:2005203207 基金项目:中国科学院知识创新工程项目(ZKCX22211) 作者简介:张灵侠(19802),女,安徽蒙城人,在读硕士,从事海洋生物学研究;沈琪,通讯作者,电话:020*********,E2mail:zhangling xia1980@https://www.sodocs.net/doc/977309390.html,

最终水产养殖学1213-梁贵福-201221031077-凡纳滨对虾高位池养殖管理

凡纳滨对虾高位池养殖管理 [摘要] 凡纳滨对虾高位池养殖虽适合高密度、高资源利用率、强可控性的养殖模式，但其成功率确无法完全保证，养殖过程中只能通过改进硬件设备、提升养殖管理水平来提高养殖成功率。首先，前期的清塘和消毒工作必须做到位；其次，培育好水色，采用施肥培养微藻类和泼洒微生态制剂相结合来稳定水色是养虾必不可少，其占养虾成功的一半；第三要定期换水，避免大排水大换水，防止水体老化；第四要定期口服解毒剂、抗应激剂和营养与保健物质，保证对虾健康生长；最后，病害要以防为主，当发生病害要及时发现并准确治疗，并采取隔离措施，避免交叉感染。 关键词：凡纳滨对虾高位池养殖管理病害防治

Penaeus vannamei higher-altitude ponds aquaculture management Abstract: Penaeus vannamei ponds high although suitable for high density, high resource utilization, strong controlled breeding patterns, but the success rate is indeed not fully guarantee，the breeding process can only be through improved hardware, improve aquaculture management to improve farming Success rate. First, the Preliminary work clear pond and disinfection must be done bit; secondly, to cultivate good color, the use of fertilizer spilled cultured micro-algae and micro ecological preparation to stabilize the color combination is essential for shrimp, which accounts for half of the success of shrimp; third, we must change the water regularly, avoid large drainage large water changes, prevent water aging; fourth to regularly oral antidotes, anti-stress agent and nutrients to ensure healthy growth of shrimp; and finally, to prevent the main diseases, when disease to discover the event and accurate treatment, isolation and take measures to avoid cross-infection. Key words: Penaeus vannamei Higher-altitude ponds Aquaculture management Disease prevention

美国、欧盟和中国生物技术药物的比较

行业信息[石油化工] 美国、欧盟和中国生物技术药物的比较 05 25 2005 10:34AM 美国、欧盟和中国生物技术药物的比较 胡显文1** 陈惠鹏1 汤仲明2 马清钧1 (1. 军事医学科学院生物工程研究所，北京，100071； 2. 军事医学科学院生物工程研究所，北京，100850) 美国、欧盟和中国的药管部门每年批准的药物中有很大一部分是已上市药物的新适应症，有一部分是不同公司生产的相同产品，许多相同药物重复计算，造成了统计上的很多混淆，使人误认为现在已批准上市的生物技术药物有几百种，而实际上只有不到100种，即人们想象的生物技术药物数量要远高于实际的数量。本文按照以下原则合并归纳生物技术药物，试图全面、准确、科学地统计欧美和中国已批准上市的生物技术药物，以期令人对生物制药有一个详尽准确的了解： （1）本文归纳的生物技术药物是文献定义的狭义生物制药产品，即基因工程产品、抗体工程产品或细胞工程产品，如用大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞表达的重组蛋白、用杂交瘤技术生产的治疗性抗体、用细胞培养技术制备的组织工程产品等，但不包括用细胞培养方法生产的减毒或灭毒疫苗。 （2）本文的生物技术药物不包括从血液、尿液或组织中提取的生物活性物质，如人血清白蛋白Albutein 、血源性凝血因子Alphanate (Factor VIII)、AlphaNine（Factor IX）、血源性CMV特异性免疫球蛋白CytoGam、血源性乙肝免疫球蛋白Nabi-HB、AVENTIS公司生产的链激酶Streptase?（非基因重组产物）等生物制品，也不包括FDA定义的New Biotech Drug中可引起细胞凋亡的物质，如三氧化砷注射液（Trisenox）、硝酸镓注射液（Ganite）等无机盐、Fuzeon等化学合成多肽，小分子有机物质Gleevec、Hepsera、Leustatin等。 （3）由于目前全球只有一种反义寡核苷酸药Vitravene，并且它是化学合成药物，不在本文统计范畴。（4）用同一系统表达的蛋白质序列完全一致的产品视为一种产品，如用E coli.表达的有8个品牌的生长激素产品BioTropin、GenoTropin、Humatrope、Norditropin、Nutropin Depot等，用CHO表达的2个品牌的EPO- 产品Epogen、Procrit等，统计时当作一种产品。 （5）用不同细胞或细菌表达的同一产品视为不同产品，如生长激素，有的用E coli.表达如BioTropin，有的用小鼠C127细胞表达如Saizen；又如胰岛素，有的用E coli.表达如Humulin，有的用Yeast表达如Novolin；再如凝血因子VIII，有用CHO表达的ReFacto，有用BHK表达的Helixate。 （6）突变体视为不同产品，如胰岛素突变体Humulog、Lantus、NovoLog等；又如EPO产品Epogen和EPO突变体产品 Aranesp。 （7）剂型的改变、添加其他成分或化学修饰都视为一种产品。如Novo Nordisk公司生产的速效、中效、长效、混合胰岛素系列产品Novolin、Novolin L、Novolin N、Novolin R、Novolin 70/30等，都是剂型的改变以改变胰岛素的生物吸收和药代动力学。又如干扰素a2b 的产品为Intron A，而在Intron A 中加入病毒唑就成为Rebetron，这两种产品都视为干扰素a2b一种生物技术药物；再如许多PEG修饰的药物如PEG-Intron（PEG化干扰素a2b），都与未修饰的产品归为一种产品。 本文所列的生物技术药物，几乎涵盖了所有美国、欧盟和中国的批准上市的生物技术药物，主要资料来源为美国食品药品管理局(FDA，https://www.sodocs.net/doc/977309390.html,)、美国制药协会(https://www.sodocs.net/doc/977309390.html,)、美国生物技术产业协会(https://www.sodocs.net/doc/977309390.html,)、欧盟医药管理局(EMEA, www.emea.eu.int)，以及每个生产厂商的网站及产品说明书，并且参考了文献。 1 美国FDA批准的生物技术药物

淋巴细胞培养

淋巴细胞培养 一、严格无菌操作 对实验室以及培养过程中所接触的试剂、液体、器皿、仪器的消毒,均应严格按照有关细胞培养的参考书的要求进行操作。无菌观念要贯穿整个实验的始终,不可松懈。 二、培养器皿的选择 淋巴细胞培养既可选择培养板(24 、48 、96 孔) 、培养瓶,也可选择三角烧瓶、试管等器皿进行培养。有研究表明提取的淋巴细胞用1. 5ml 离心管培养72 小时,细胞生长状况良好,细胞数与培养前比较,差异无统计学意义( P >0. 05) 。用青霉素小瓶进行培养,淋巴细胞生长也非常好。可以认为,对散在的细胞培养来说,用小器皿具有以下优点: (1) 便于操作:1. 5ml 离心管为一次性使用,青霉素小瓶可反复刷洗,而培养板、培养瓶价格偏贵且用过几次之后,便有些模糊不清,尤其是塑料的。更为重要的是,淋巴细胞培养为悬浮培养,在培养过程中需要不断晃动,而大多数实验室没有恒温摇床。我们发现,在培养过程中每隔6～8小时晃动一次培养器皿,便可解决这个问题。青霉素小瓶、1. 5ml 离心管晃动起来相对容易些。(2) 减少污染:因为淋巴细胞培养的液体量较少,一般为100～200μl , 故文献资料中多见用培养板( 48 、96孔) ,少见用培养瓶。对分散的淋巴细胞培养,一方面一次用不了那么多孔,另一方面一旦一孔有污染,其他孔便有可能被波及,使其他孔的培养也失败。而且,晃动培养板时,很容易使液体溅到培养板盖上,增加污染的机会。而使用青霉素小瓶、1. 5ml 离心管等小器皿便可避免这些现象,但缺点是不易观察细胞生长,需取样加到载玻片上观察。 三、血清的选择 淋巴细胞对血清的要求较高,所以选用血清时要注意生产厂家。但胎牛血清价格昂贵,新生小牛血清或小牛血清也价格不菲,而使用自身血清不仅细胞长得好,而且更接近体内环境,避免了外来因素的干扰,使实验设计更严密。血清浓度在5 %～20 %时细胞生长比较好,当超过30 %时反而不利于细胞生长。 四、pH 值 细胞生长的最适pH 为7. 0～7. 2 ,可忍耐的pH 范围为6. 6～7. 8 ,当pH 低于6. 8 或大于7. 6 时, 都会抑制细胞生长。RPMI1640 培养基加入血清后pH 值一般升高0. 2～0.4 ,故配1640 培养液及其他用液时使pH 值达到7. 2比较合适,并且需经常检测pH 值。 五、培养空间 培养液与液面上的空间二者的体积比例一般以1∶10 为宜,培养液液面高度最好维持在2～5mm 的范围,以便于气体交换。 六、恒温培养箱 温度应维持在37 ℃,CO2 浓度为5 % ,O2 为95 % ,100 %的饱和湿度。 七、常见失败原因

总结的七个南美白对虾养殖技术要点

最新总结的七个南美白对虾养殖技术要点 近几年大家养殖南美白对虾都有同感，越来越难养了。“偷死”问题每位养殖者都要面对，很难避免！慢慢地，大家也都习惯了南美白对虾养殖偷死是“迟早”的事，所以只能想方设法让对虾迟点死（注:迟就是60条/斤左右，过了盈亏线），甚至养到更大，养到更高的产量。如何才能做到让对虾迟点死，下面总结一些要点，供大家分享。 一、优质苗种 市场上很多时候，对虾养得不好，好多养殖户第一时间都会怪这个苗种不好，可见苗种对成功养殖的重要性，所以在此也建议大家选择优质苗种来养殖。但实际上也有些老板怕养好苗，觉得长得快，死得快；“偷死”来得急，来得多！为什么会这样？ 1、长得快，蜕壳多，抵抗力差，容易感染有害菌 2、长得快，虾体营养、溶氧要求高 3、长得快，“同时”蜕壳多，水体营养、溶氧要求高 了解了好苗为什么长得快，死得快了，我们选择适合好苗养殖的管控方向，会不会好养些？答案是肯定的。目前南美白对虾养殖只能让虾尽情地长，跑得快，“迟”点死，才能有钱可赚！ 二、壮苗、保苗 选择了优质的苗种，合理的放养密度，下面就要保好苗，有苗才有养下去的意义，有苗中后期水体才好管控，有苗才有产量。保苗首先要想方设法壮苗！保苗操作关注细节和方案： 针对南美白对虾： 1、投苗前2个小时用拜激灵6亩/包速补100 4亩/包沿池塘边泼洒后再投苗。 2、投苗后每5天使用微量元素速补100泼水一次，直到虾体达100条/斤左右；天气突变，速补100加拜激灵一起用，缓解应激。 3、投苗后，“清罾”前7天，关注“转肝期”，拜水安德维乐彼奥酸拌料投喂，调肝护肠，加强虾体质。 针对水质、底质： 1、清塘进水消毒后（欣碘4亩/瓶消毒，无需解毒），投放生物净水剂8亩/ 拜生源4亩/包红糖5斤/亩，注意水色，“黄绿”色为好。

(一)项目的意义、必要性和依据近年来大量的研究证实间充质干细胞

（一）项目的意义、必要性和依据 近年来大量的研究证实间充质干细胞（MSCs）是骨髓微环境细胞的起源细胞，是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞。MSCs因其具有以下特点而日益受到人们的关注：(1)多向分化潜能：在体内/外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞； (2)造血支持和促植入：作为造血微环境主要细胞成分——基质细胞系的干细胞，MSCs通过细胞对细胞的直接作用、分泌细胞外基质及多种细胞因子，实现对造血的精细调控，支持造血干细胞的生长，与造血干细胞共同移植可促进造血干细胞的植入；(3)免疫调控：MSCs表达MHC-I类分子，不表达CD80，CD86，HLA-DR等协同刺激分子，体外可抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受，对于预防和治疗异基因造血细胞移植后引起的移植物抗宿主病，诱导器官移植免疫耐受有较好的应用前景。(4)自我复制：MSCs作为干细胞可以自我复制，体外扩增、增殖能力强，可以作为基因操作的干细胞平台，在基因治疗中有着十分诱人的前景。 在造血干细胞移植治疗恶性血液病的应用研究 促进造血干细胞移植的造血重建：近年来有关MSCs体内、外支持造血，抑制免疫功能的报道有很多，提示MSCs可以作为造血干细胞移植的共移植手段以及应用于临床相关疾病的治疗，可提高造血干细胞移植患者的存活率和移植后生存质量，从而大大提高移植治疗的有效性和适应症，具有良好的应用前景。MSCs经静脉回输后广泛分布于骨髓、肝脏、脾、胃肠道、肾脏、肺脏及肌肉等器官组织，对受体BM-MSCs来源的检测结果发现，供体来源的MSCs能够定植于受体骨髓。Maitra等体外扩增人MSCs，与造血干细胞（HSC）共移植给NOD/SCID小鼠，对照研究结果显示，当HSC数量有限时，只有同时给予MSCs输注才能获得更为有效的造血植入。黄绍良等进行了自体和异基因MSCs联合脐血移植的I期临床试验，结果显示异基因MSCs联合UD-UCBT具有明显促进造血恢复的作用。Lazarus等对MSCs 自体输注进行了I期临床试验，从23例造血系统肿瘤包括急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病（ALL）、多发性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤缓解期患者中分别抽取骨髓10ml-15ml，体外培养扩增MSCs，15例患者经2-3次传代后给与3个

外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备实验教学方法

107 第 30 卷第 1 期2012 年 2 月广东医学院学报 JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE V ol. 30 No. 1Feb. 2012 实验教学是高校教学的重要组成部分，在培养了使学生更好地了解和掌握消毒灭菌知识和技能，学生分析和解决问题能力、培养严密的思维方法和通过在PPT 上讲解后，再由带教老师用实物进行操踏实肯干的工作作风等方面具有不可替代的作用。作演示。这个过程加强了学生的无菌操作意识，树要使实验室成为推行素质教育、培养学生创新精神立学生的无菌概念。 和实验能力的主要阵地，必须突破传统的教学观念 1.2　通过实际操作，培养学生动手实践的兴趣，确和教学模式，探讨不同层次、具有特色的、多样化立严格的无菌操作观念 的实验教学方法。《医学遗传学》是高等医学院校在经过适当改装后的实验室里，带教老师向学的一门必修课，外周血淋巴细胞培养和染色体制备生讲解细胞培养基的配制方法及要求后，由学生自是这门课程的重要实验教学项目之一，是综合性实己操作。配制培养基是实验的重要环节之一，要求验项目。该实验包括灭菌技术、培养基配制、采血在无菌条件下操作。以往因为实验室条件所限，必接种、细胞培养、收集细胞制备标本、Ｇ显带处理 须用预先在无菌实验室里配制好的培养基给学生做[1-2] 和镜下观察分析等内容，实验过程繁琐，耗时实验，如果使用市售的培养基则成本费用高，并且长。根据目前学生人数多以及本实验的特点，我们学生都没有动手的机会。由于配制培养基是一项细进行了以下教学方法的探索和改进：微且繁琐的实验过程，一旦失败则后面的实验无法进行，要求带教老师把每一个细小的环节都仔细向1　多种实验手段结合，使繁琐的实验简单化学生交代清楚，包括一些操作的动作要领和容易出现的问题。有些学生会忘记按无菌操作要求用酒精1.1　运用现代教学手段，了解实验中使用器械、物灯高温消毒试管口和玻璃器皿，或者忘记消毒玻璃品的清洗消毒灭菌程序 安培，教师要预先强调并密切观察学生的操作，及由于学生初次接触本实验使用的仪器设备和试时纠正其错误，避免培养基被污染。学生们通过自剂，例如CO 培养箱、抽滤器、培养基(所需的药品2己动手配制培养基，了解了细胞培养的实验过程，及试剂)和秋水仙素、离心机、显微镜及玻璃器皿认识了每个操作环节的重要性，培养了高度的责任等，感到非常的陌生，因此我们应用多媒体教学手心和严谨的科学态度。 段介绍它们的作用、原理和正确的使用方法，让学 1.3　开放实验室，使每个学生参与整个实验过程，生容易理解和掌握。 激发其学习兴趣 外周血淋巴细胞培养是在体外条件下的细胞培在完成了以上实验课后，根据实验要求分2次安养技术，整个过程必须在严格无菌条件下进行，对排学生回实验室完成以下2个实验步骤。(1) 采血接实验所需的器皿(如烧杯、量筒、培养瓶、抽滤器、种及培养：在老师的指导下，由学生自己互相采静胶塞等)的消毒灭菌是进行细胞培养最重要及最基本脉血，注入配制好的培养液内进行培养。让学生互的条件，这个过程包括洗、煮、烤、高压灭菌。为 相采血进行实验，学生会更加关心实验的结果，更认真地进行后面阶段的实验，激发他们对这个实验的兴趣。(2) 在收获细胞前4 h ，尚要进行一个很关 摘　要：由于外周血淋巴细胞培养和染色体制备这一实验教学课程耗时长，步骤繁琐，要求学生完成全部实验过程并达到较好的教学效果操作起来不容易。经过多年的摸索，我们将普通实验室加以改造，采用集中采血、分批分阶段进行实验的方法开展实验教学，结果绝大多数学生均能顺利完成该实验，达到预期的教学效果。 关键词：细胞培养；染色体；实验教学 中图分类号：G 624.4 文献标识码：B 文章编号：1005-4057(2012)01-0107-02DOI: 10.3969/j.issn.1005-4057.2012.01.044 外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备实验教学方法的探索 廖　霞，陈小萍，周汝滨 （广东医学院生物学教研室，广东湛江 524023） 收稿日期：2011-11-12；修订日期：2012-01-30作者简介：廖　霞(1959－)，女，大专，实验师。

T淋巴细胞提取

淋巴细胞提取 一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取 二实验对象：B／C 小鼠 三实验器材： 1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基 2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台 四实验步骤： 1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。 3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果） 4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。 5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示

6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。 五、注意事项： ①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。 ②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。 ③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些 ④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。

凡纳滨对虾的选育与家系的建立

研究报告　REPOR TS 凡纳滨对虾的选育与家系的建立 陈　锚1,2,吴长功3,相建海3,黄　皓2,刘小林4,刘翠红1,何建国1,孙成波5 (1.中山大学生命科学学院,广东广州510275;2.海南南疆生物技术有限公司,海南三亚572536;3.中国科学院海洋研究所海洋生物学开放实验室,山东青岛266071;4.西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨陵712100;5.广东海洋大学水产学院,广东湛江524088) 摘要:采用对虾阶段式种群选育与家系选育相结合的方法,以三个不同来源的14个凡纳滨对虾(L itopenaeus vannamei)养殖群体为基础进行个体选育、家系选育和家系内选育。共建立了206个不同的凡纳滨对虾家 系,养殖过程中根据不同的生物学指标,逐渐淘汰了126个生长、抗逆性状较差的群体,在80个家系养殖到 150日龄的商品虾期,对各家系的生长状况和畸形率进行了统计分析。结果表明,各家系在相同或相近的养 殖条件下生长速度、成活率和畸形率差别较大,150日龄对虾的体质量呈现明显的正态分布。最终保留了40 个生物学性状较好的群体进行F2代的繁育。创造性地进行了对虾的家系选育和个体选育,并首次将对虾的 畸形率作为选育的指标之一进行了研究,初步建立了对虾的家系选育体系,为生产实践和理论研究提供了很 好的技术平台,同时也为我国未来的对虾健康养殖提供了潜在的良种。 关键词:凡纳滨对虾(L itopenaeus vannamei);选育;家系 中图分类号:Q111.22 文献标识码:A 文章编号:100023096(2008)1120005204 凡纳滨对虾(L itopenaeus v annamei)近年来已在全国沿海及部分内陆地区形成规模化养殖,是我国目前养殖规模最大的对虾种类。海南省1998年以前以养殖斑节对虾(Penaeus monodon)为主,2000年以后则逐渐以养殖凡纳滨对虾为主,2001年面积及产量均为70%左右。但是,随着养殖代数的增加和养殖环境的日趋恶化,其周期短、生长速度快、饵料系数低及抗病能力强等优势愈来愈不显著。因此对优良品种的选择显得格外重要。 选择育种是培育具有特定经济性状的品种或品系的经典的、基本的育种方法,在水产动物中进行了大量的研究。目前对虾的选择育种已在国内外迅速展开。Lester[1]1983年报道了美国进行海产对虾选择育种规划,主要包括的物种有L itopenaeus aztecus, L itopenaeus seti f erus,L itopenaeus st y li rost ris和L itopenaeus v annamei。在过去的10年间,美洲和亚洲都已启动了对虾的育种项目,1995～1998年,美国国家农业部(U SDA)和海洋研究所(O I)[2,3]执行了凡纳滨对虾的选择育种项目,基于对生长性能和桃拉综合征病毒(Taura Syndrome Virus,TSV)抗性等权重的综合选择指数进行选择育种。Moss 等[4]1999年报道,514个全同胞家系的生产性能与TSV感染的家系存活率呈负相关(r=-0.45)。1998年两个独立的育种品系建立起来,一个是完全选择生长性能,另一个以70%为权重选择TSV抗病性和30%为权重选择生长性能。Argue等[5]2002年研究了凡纳滨对虾生长和抗桃拉综合征病毒的选择育种,经过一代选择,选择育种后代比对照组生长速度提高21%;半同胞遗传力为0.84±0.43,现实遗传力为1.0±0.12。G oyard等[6]2002年研究了红额角对虾(Penaeus st y li rost ris)的快速生长的选择育种。第五代选择反应为21%。Hoang等[7]2002年研究了池塘养殖墨吉对虾生长、性成熟和产卵性能的选择效果。Hetzel等[8]2000年研究了日本对虾生长的选择反应以及遗传力,一个世代的选择反应平均为10.7%,向上选择的选择反应为8.3%,向下选择的选择反应为13.1%,6月龄平均现实遗传力为0.234,与子亲回归估计的遗传力0.277没有显著差异。Tang等[9]2000年报道了选育的超级蓝对虾(Super shrimp(注册商标))与SPF凡纳滨对虾的幼体和稚虾抗IH HNV的能力。喂饲感染病虾30d,结果证明超级蓝对虾不感染,具有抗IH HNV的能力,而SPF凡纳滨对虾受到感染。Benzie等[2]1997年报道了斑节对虾半同胞家系的遗传力。通过人工授精的办法获得18个半同胞家系,认为在6～10周的早期发育中,母性遗传力起到关键的作用。哥伦 收稿日期:2005209213;修回日期:2008209208 基金项目:中国科学院知识创新工程项目“蓝对虾凡纳滨对虾优质苗种培育技术”;中国科学院实验海洋生物学重点实验室开放课题 作者简介:陈锚(19752),男,山东泰安人,博士研究生,从事对虾健康养殖研究;相建海,通讯作者,E2mail:jhxiang@https://www.sodocs.net/doc/977309390.html,