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invitrogen Trizol中文说明书

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TRIZOL? Reagent

Cat. No. 15596-026 Size: 100 ml

Store at 2 to 8°C.

警告:在与皮肤接触及吞咽有毒。可导致烧伤。与皮肤接触后,应立即用洗涤剂和大量水冲洗。如感到身体不适,应就医(如需要,应出示本产品标签)。本产品含有苯酚(108-95-2)和其他成分(NJTSRN 80100437-5000P)。

已经证明TRIZOL 在室温下可稳定保存12个月。不过,我们建议在储存于2-8°C,以保证最佳性能。

描述:

TRIzol试剂(美国专利号,5346994)是即用型细胞和组织总RNA提取试剂。该试剂是一步法苯酚和异硫氰酸胍解决方案,是对Chomczynski和Sacchi开发的单步RNA提取法(1)的改善。在匀质化或溶解样品中,TRIzol试剂可保持RNA的完整性,同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后,裂解液分离成水相和有机相。RNA存在于水相。水相转移后,RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后,样品中DNA和蛋白质可通过相继沉淀回收(2)。用乙醇沉淀可从中间相得到DNA,加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质(2)。与DNA的共纯化可能对不同样品得到的RNA的归一化有用。

此技术可完美应用于少量人类、动物、植物或细菌来源的组织(50-100毫克)和细胞(5×106),以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)。该TRIzol试剂方法简单,允许大量样本同时处理。整个过程可在一小时内完成。用TRIZOL提取总RNA可避免蛋白质和DNA 污染。可用于Northern blot分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。聚合酶链反应(PCR反应)中,当两条引物位于单个外显子时,推荐使用扩增级DNA酶I(Cat. No. 18068)处理分离出的RNA。

TRIzol试剂方便提取不同种类、不同分子大小的RNA。例如,从大鼠肝中提取RNA,

经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色,高分子量RNA离散带其长度可高达7 kb和15 kb,(组成mRNA’s和hnRNA’s),两个主要的核糖体RNA带在~5 kB(28 S)和~2 Kb(18 S)。低分子量RNA介于0.1和0.3 kB之间(tRNA,5S)。分离出的RNA用TE稀释,其A260/A280比值≥1.8。

防止RNA酶污染的注意事项

通过不当的技术操作,RNA酶可在任何提取程序中意外引入RNA的制备中。由于酶的活性难以抑制,所以必须防止其引入。进行RNA工作时,下列准则应予以遵守。

? 总是戴着手套。皮肤上通常包含的细菌和霉菌,可污染RNA的制备,同时也是RNA 酶的一个来源。良好的微生物操作技术可防止微生物污染。

? 使用无菌制品,专为RNA工作准备的一次性塑料器皿和自动吸管可以避免与共用设备的RNA酶交叉污染。例如,一个实验室正在使用的RNA探针可能用得上RNA酶A或RNA酶T1以减少过滤背景,其中任何非一次性物品(如自动吸管)可能是大量RNA酶的来源。

? TRIzol试剂的存在,可保护RNA酶对RNA的污染。下游样品处理要求非一次性的玻璃器皿或塑料器皿无RNA酶。玻璃物品可以在150 °C烘烤4小时,塑料制品,可浸泡10分钟的0.5 M NaOH溶液,然后用清水彻底冲洗,并高压蒸汽灭菌。

其他需要注意的事项:

? 用小于2毫升体积的TRIZOL试剂工作时,建议使用一次性透明聚丙烯管。

? 对于较大的体积,用玻璃(Corex)或聚丙烯管,并测试以确保该管装满TRIzol试剂和氯仿时可承受12,000×g的离心力,不要使用泄漏或有裂纹的管子。

? 离心前小心平衡管子的重量

? 玻璃管必须用封口膜密封,密封时封口膜要覆盖有螺丝处,聚丙烯管离心前必须盖好。RNA提取的指导:

警告:当使用TRIzol试剂工作时,应使用手套,并保护眼睛(屏蔽、安全护目镜)。避免与皮肤或衣服接触。使用化学通风橱。避免吸入蒸气。

除非特别注明,所有程序均在15 -30°C下进行,试剂也放置于15 -30°C。

需要的试剂为:

? 氯仿

? 异丙醇

? 75% 酒精(溶于DEPC处理的水中)

? 无RNase 的水或0.5% SDS溶液[RNase-free水的准备:把水加入到RNase-free的玻璃瓶中,加入diethylpyrocarbonate (DEPC)至0.01% (v/v). 静置过夜,高压蒸汽灭菌。SDS溶液必须使用DEPC处理的水,并高压灭菌。]

1. 均质化(see notes 1-3)

a. 组织

均质50-100毫克组织样本需要1毫升的TRIzol试剂,使用特富龙玻璃?或强力均质机(Polytron, or Tekmar's TISSUMIZER? TISSUMIZER ?或相当的仪器)。均质时样本体积不应超过TRIzol试剂体积的10%。

b. 单层细胞

直接在培养皿中裂解细胞,3.5厘米直径的皿中加入TRIzol试剂1毫升,并通过抽吸几次促进细胞裂解。TRIzol试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目(每10平方厘米加入1毫升)。TRIzol试剂量不足可能会导致分离出的RNA有DNA的污染。

c. 悬浮细胞

离心沉淀细胞。在TRIzol试剂中重复吹打以裂解细胞。1毫升试剂用于5-10×106的动物、植物或酵母细胞,或1×107细菌细胞。使用TRIzol试剂前应避免洗涤细胞,因为这增加了mRNA降解的可能性。一些酵母和细菌细胞的裂解可能需要使用均质器。

可选: 一些样品可能需要额外的分离步骤,这些样品蛋白质、脂肪、多糖或细胞外基质含量高,如肌肉、脂肪组织、以及部分植物块茎。同质化之后,2-8°C、12000 × g离心10分钟,移除不溶物。由此产生的沉淀含有细胞外膜结构、多糖、分子量高的DNA,而上清含有RNA。从脂肪组织等脂肪过多的样本收集的上层脂肪应弃去。在每种情况下,均应转移净化后的均质溶液到新管,加入氯仿进行下述相分离。

2. 相分离

15-30 °C孵育5分钟,以利于匀浆样品中核蛋白体完全分离。每1毫升的TRIzol试剂添加0.2毫升氯仿。小心盖好样品管。用手大力摇管15秒,15-30°C孵育2-3分钟。2-8°C,不超过12,000 ×g离心15分钟。离心后,混合物分离为红色下层(酚-氯仿相)、中间相以及上层的无色水相。RNA存在于水相。水相体积约为60%均质时使用的TRIzol试剂量。

3. RNA沉淀

水相转移到一个新管,并保存有机相(如希望分离DNA或蛋白质)。混合异丙醇以从水相中沉淀RNA。每1毫升用于初始的同质化的TRIzol试剂使用0.5毫升异丙醇。15到30℃孵育样品10分钟,2-8°C,不超过12,000 ×g离心10分钟。往往离心前RNA沉淀不可见,离心后在管侧面和底部形成一个凝胶样沉淀。

4. RNA洗涤

弃上清。用75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂使用至少1毫升75%的乙醇。涡旋混合。2-8°C,不超过7,500×g离心5分钟。

5. 重新溶解RNA

在该过程结束时,简单干燥RNA沉淀(空气干燥或真空干燥5-10分钟)。不要真空离心干燥RNA。重要的是不要让RNA沉淀完全干燥,因为这将大大降低其溶解度。部分溶解RNA 样品,其A260/280比值<1.6。在无RNA酶的水中或0.5%SDS溶液中吹打几次溶解RNA,并在55-60°C孵育10分钟。(如RNA将用于之后的酶反应,应避免使用SDS。)RNA也可以用100%甲酰胺(去离子)再溶解并保存于-70℃(5)。

RNA Isolation Notes:

1. 从少量组织(1-10毫克)或细胞(102-104)分离RNA:加入800μl TRIZOL 到the tissue or cells.样品裂解后,加入氯仿,遵循上述步骤2进行相分离。在异丙醇沉淀的RNA之前,加入5-10微克无RNA酶的糖原(Cat. No 10814),以承载水相。为了降低粘度,加入氯仿前以2-26号针头剪切基因组DNA。糖原保留在水相,与RNA一起沉淀下来。浓度高达4 mg/mL的糖原既不抑制第一条链的合成,也不抑制PCR。

2. 同质化后,加入氯仿前,样品也可以存放在-60至-70℃至少一个月。RNA沉淀(步骤4,RNA洗涤)可以存储在75%乙醇中2-8℃至少一周,或在-5至-20 ° C至少一年。

3. 最大离心力只有2,600 × g的桌面型离心机也适合用于这些程序,只是在步骤2和3中,其离心时间应提高到30-60分钟。

DNA提取的指导:

如RNA分离方法所描述,完全除去水相后,位于中间相和苯酚相的DNA可被能分离。经沉淀和系列洗涤,DNA可溶解于8 mM氢氧化钠。使用TRIzol试剂可从组织和培养细胞完全回收DNA,可用于分析样品DNA含量(2)。同时提取的基因组DNA可用于每个基因组northern结果的归一化分析,而不是使用变动更大的总RNA或组织的重量。(根据来源,在进行其他程序之前,获得的DNA沉淀可能需要额外纯化(如酚提取))。

需要的试剂:

? 100%乙醇

? 0.1 M 柠檬酸钠in 10% 乙醇

? 75% 乙醇

? 8 mM NaOH

除非特别注明,所有程序均在15 -30°C下进行。

1. 沉淀DNA

移去水相后,用乙醇沉淀中间相和有机相中的DNA。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加0.3 毫升100%乙醇,颠倒混合。然后,15-30℃静置2-3分钟,2-8°C,不超过2,000×g 离心5分钟以沉淀DNA。

仔细移去水相,对于分离DNA的质量很重要。

2. DNA洗涤

移去苯酚-乙醇上清液(如需要,保存上清用于蛋白质分离)。用0.1M的柠檬酸钠溶液(溶于10%乙醇)洗两次沉淀的DNA。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加1 毫升溶液。每次清洗时,15-30℃静置30分钟DNA沉淀(间歇混匀),2-8°C,2, 000×g离心5分钟。洗涤2此后,用75%乙醇悬浮沉淀的DNA(每毫升TRIzol试剂加入75%乙醇1.5-2毫升),在15-30 °C静置10-20分钟(间歇混匀),然后2-8°C,2, 000×g离心5分钟。

对于包含> 200 μg DNA或大量非DNA物质的大沉淀,需要0.1M柠檬酸钠-10%乙醇溶液额外的洗涤。

3. 重溶DNA

打开离心管口,空气干燥DNA 5-15分钟。(不要离心干燥,因为溶解更难。)用8 mM氢氧化钠溶解DNA,至DNA浓度为0.2 – 0.3 μg/μl。通常添加300 – 600 μl of 8 mM NaOH to DNA isolated from 107 cells or 50 – 70 mg of tissue. 强烈推荐在弱碱中重悬,因为分离的DNA在水中或Tri缓冲液中不能重悬。8 mM NaOH 的pH值只有~9,一旦DNA溶解于其中,可以很容易的用TE或HEPES进行调节。在此期间,DNA(尤其是来自组织的DNA)中可能含有不溶性胶状物(膜碎片等等),>12,000 × g离心10分钟去除不溶物。将含DNA 的上清转移到一个新管。在8 mM NaOH 中溶解的DNA可储于4 °C过夜。如长期贮存,样品液应使用HEPES调整pH值至7-8(见表)并添加1 mM EDTA。一旦pH值调整后,DNA 就可以储存在4 °C或-20 °C。

溶于8 mM NaOH的DNA可在4℃保存数月,-20℃保存一年,-70℃未测定。

DNA定量与产量预测:

在8 mM NaOH中溶解的DNA,取出一部分与水混合,并测量其A260的值。用A260的值计算双链DNA含量。1 A260单位=50 μg双链DNA /mL。按照样本细胞数计算,每1×106人、大鼠或小鼠二倍体细胞可分别产生:7.1μg,6.5μg和5.8μg的DNA(3)。每mg肝和肾组织产生3-4 ug DNA,每mg骨骼肌、脑和胎盘可产生2-3 ug DNA;每106人、大鼠和小鼠来源的培养细胞可产生5-7 ug DNA。

应用

PCR扩增DNA :

在8 mM NaOH中溶解DNA后,用HEPES调整pH值为8.4(见表)。添加0.1-1.0 μg DNA 样本至PCR反应混合物,执行标准PCR程序。

限制酶反应:

用HEPES调整DNA溶液的pH至希望的值(见表)。样本也可用1 mM EDTA,pH 7-pH 8.0进行透析。每μg DNA使用3-5个units的酶。对特殊的酶,使用酶制造商建议的条件,并让反应持续3-24小时。在一般实验中,80-90%的DNA可被消化。

溶解于8 mM NaOH的DNA样品的pH调整:

(1 ml 8 mM NaOH 使用以下量的0.1 M或1 M HEPES调整,不用酸)

DNA Isolation Notes:

1. 苯酚相和中间相可在2-8°C保存过夜。

2. 溶解于75%乙醇的样品可在2- 8°C下保存数月。

3. 溶解于8 mM NaOH 的样品可在2-8°C下保存过夜。为长期保存,应调整其pH to 7-8,并调整EDTA浓度至1 mM。

蛋白质分离指导:

用乙醇沉淀DNA(步骤1,DNA沉淀)后,蛋白质可从苯酚-乙醇上清中获得。由此产生的蛋白质可用于Western blotting分析(2)。

需要的试剂:

? 异丙醇

? 0.3 M 盐酸胍(溶于95%乙醇)

? 100%乙醇

? 1% SDS

1. 蛋白沉淀

酚-乙醇上清液(每毫升TRIzol试剂上清体积大约0.8毫升)中加入异丙醇可沉淀出蛋白质。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加1 .5毫升异丙醇。15-30 °C静置样品10分钟,然后2-8°C,12, 000×g离心10分钟以沉淀蛋白质。

2. 蛋白洗涤

弃去上清,用0.3 M盐酸胍溶液(溶于95%乙醇)洗涤蛋白质沉淀3次。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加2毫升洗涤液。每次洗涤中,15-30 °C静置蛋白沉淀20分钟,2-8°C,7,500×g离心5分钟。最后清洗后,加入2毫升乙醇,漩涡混匀蛋白沉淀。15-30 °C静置蛋

白沉淀20分钟,2-8°C,7, 500×g离心5分钟。

3. 重溶蛋白沉淀

真空干燥蛋白质沉淀5-10分钟。吹打溶于1%SDS。蛋白质沉淀的完全溶解可能需要在50 °C 孵育样品。2-8 °C,10,000×g离心10分钟,沉淀任何不溶物,并转移上清至新管。该样品可直接用于Western blotting或可储存在-5至-20℃以备将来使用。

Protein Isolation Notes:

1.用0.3 M盐酸胍溶液(溶于95%乙醇)或乙醇悬浮的蛋白质沉淀可在2-8°C保存至少一

个月,或-5至-20℃保存至少一年。

2.为更有效地回收蛋白,可采用下述替代方法:在2-8℃,更换3次0.1%SDS,透析苯酚-

乙醇上清。透析物10,000 × g离心10分钟。上清用于Western blotting。

3.如果SDS浓度足够低(<0.1%),蛋白质可用Bradford法量化,这样SDS它就不会对

结果有干扰。如没有出现洗涤剂-界面问题,就不应依赖A260/A280比值的测量(痕量的苯酚就可能导致蛋白质浓度被高估)。

问题与解答:

RNA ISOLATION

?每mg组织或1 × 106培养的细胞RNA产量的估计

肝脏和脾脏:6-10 μg

肾脏:3-4 μg

骨骼肌和脑:1-1.5 μg

胎盘:1-4 μg

上皮细胞(1×106个培养的细胞):8-15 μg

成纤维细胞(1×106个培养的细胞):5-7 μg

?产量低

样品均质化或裂解不完全。

最终的RNA沉淀没有被完全重溶。

?A260/A280比值<1.65

进行分光光度分析之前,RNA样品溶于水中而不是TE中。低离子强度和低pH值溶液可升高280 nm的吸光度(6,7)。

使用太小体积的试剂进行均质化。

均质化后,样品没有在RT放置5分钟。

水相中包含有苯酚相。

最终的RNA沉淀没有完全溶解。

?RNA降解

从动物身体取得组织后没有立即处理或进行冷冻。

用于分离的样品,或分离后的RNA保存在-5 to-20°C, 而不是-60 to -70°C。

用胰蛋白酶消化时细胞被破坏。

水溶液或管子不是RNase-free。

用于琼脂糖凝胶电泳的甲醛,其pH低于3.5。

?DNA污染

使用太小体积的试剂进行均质化。

用于分离的样品含有有机溶剂(e.g., ethanol, DMSO)、强buffers、or碱性溶液。

? 蛋白多糖和多糖污染

经修改的下述RNA的沉淀步骤(步骤3)可从分离出的RNA中去除这些污染物。每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加0.25 ml异丙醇到水相中,然后加入0.25 ml高盐沉淀液(0.8 M柠檬酸钠和1.2 M氯化钠)。混合溶液,离心,然后按照正常描述的程序进行分离。修改后,可有效沉淀RNA,并把多糖和糖蛋白保持在可溶状态。从含有很高多糖物质的植物样品中分离、纯化RNA,需要在初始匀浆后使用修改后方法进行沉淀,并额外离心(RNA分离程序note 2)。

DNA ISOLATION

?每mg组织或1 × 106培养的细胞DNA产量的估计

肝脏和肾脏:3-4 μg

骨骼肌、脑、胎盘:2-3 μg

培养的人、大鼠、小鼠细胞(1×106):5-7 μg

成纤维细胞:5-7 μg

?产量低

样品没有完全均质化或裂解。

最终的DNA沉淀没有完全重溶。

?A260/280比值<1.70

进行分光光度分析之前,DNA样品溶于水中而不是TE中。

苯酚没有从DNA中有效去除。用溶于10%乙醇的0.1 M柠檬酸钠再洗涤DNA一次。?DNA 降解

从动物身体取得组织后没有立即处理或进行冷冻。

用于分离的样品,或分离后的RNA保存在-5 to-20°C, 而不是-60 to -70°C。

样品使用Polytron或其他高速均质器进行均质。

?RNA 污染

水相没有完全去除。

DNA沉淀没有用溶于10%乙醇的0.1 M柠檬酸钠进行有效洗涤。

?其他应用

进行PCR扩增之前,调整pH至8.4。

对于DNA的限制性内切酶消化,调整pH值为所需的值,,每μg DNA使用3-5个units 的酶。对特定的酶,在酶作用最佳条件下,反应3-24小时。通常80-90%的DNA会被消化。

PROTEIN ISOLATION

?产量低

样品没有完全均质化或裂解。

最终DNA沉淀没有完全重溶。

?蛋白质降解

从动物身体取得组织后没有立即处理或进行冷冻。

? PAGE电泳时条带变形

蛋白质沉淀没有有效洗涤。

References:

1. Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162, 156.

2. Chomczynski, P. (1993) Biotechniques 15, 532.

3. Ausubel, F.M., et.al, eds. (1990) Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New York, p.A.1.5.

4. Simms, D., Cizdziel, P.E., Chomczynski, P. (1993) FOCUS? 15, 99.

5. Bracete, A.M., Fox, D.K., and Simms, D. (1998) FOCUS 20, 82).

6. Wilfinger, W., Mackey, K. and Chomczynski, P. (1997) BioTechniques 22, 474.

7. Fox, D.K. (1998) FOCUS 20, 37.

Teflon? is a registered trademark of E. I. Du Pont de Nemours & Co. TISSUMIZER? is a registered trademark of Tekmar Co.

TRIZOL ? is a registered trademark of Molecular Research Center, Inc.

*PCR is covered by a patent held by Hoffman LaRoche Corporation.

TRIZOL说明书

trizol 中文说明书 trizol 试剂是一种从组织及细胞中提取总rna的专用试剂。这种试剂是一种酚和硫氰酸 胍的单相溶液,是将chomczynski 和sacchi发明的一步rna提取法的改进。在样品匀浆或 分析过程中,trizol 试剂可在分裂细胞及溶解胞膜的同时保持rna的完整。在匀浆后加入氯 仿,可将溶液分为水相和有机相。rna均在水相中。吸取水相加入异丙醇,得到rna沉淀。 去除水相后,样品中的dna及蛋白质可通过进一步连续的沉淀而得到。中间相加入乙醇可沉 淀dna而有机相加入异丙醇则能沉淀出蛋白质。dna的再纯化可能对标化样品的rna产量有 作用。 2.这一技术可以用于人,动物,植物或细菌株的微量组织(50—100mg)及细胞(5 ×106),也可以用于大量检材(≥1g)及细胞(﹥107).该方法简便易行,可用于同时检测大量 样品,全部过程1小时内可以完成.用trizol 试剂分离的rna 没有dna及蛋白质成分.这种 rna可用于northern印迹分析,斑点杂交,多聚(a)+检出及vitro转移, rna酶蛋白分析及分 子克隆.用于pcr反应时,当两个引物位于同一外显子时应用扩增特异dna酶i处理提取出的 rna. 3. trizol 试剂可用于分子量从大到小的各种rna的提取.例如,大鼠肝脏提取出的rna, 经琼脂糖凝胶电泳,eb染色后可显现出7kb和15kb的大分子量的rna谱带(包括mrna和 hnrna), 位于~5kb(28s)和~2kb (18s)的两条主要的核糖体rna谱带及大小在0.1kb-0.3kb 之间的低分子量rna(trna,5s).分离出的rna当溶于双蒸水中时a260/280为1.6-1.8之间. 每毫克组织所能提取的rna量约为:肝和脾,6-10μg;肾,3-4μg;骨骼肌和脑,1-5μg;胎 盘,1-4μg.从1×106培养细胞中提取的rna量约为:上皮细胞,8-15μg;成纤维细胞,5-7μg. 需要但未提供的试剂: 1. 氯仿 2. 异丙醇 3. 75%乙醇(depc处理水配制) 4. 无rna酶水或0.5%sds溶液(制备无rna酶水:将水倒进无rna酶的玻璃容器中,加入 depc至0.01%(v/v)放置过夜后高压灭菌). sds溶液必须用depc处理后高压灭菌的水配制. rna分离提取步骤: 1.匀浆 a. 组织每50-100mg组织加入1ml的trizol 试剂后用匀浆机或玻璃棒匀浆。样品的 体积不要超过匀浆使用的trizol 试剂体积的1/10。 b. 单层培养细胞在一个直径3.5cm的培养皿中加入1mltrizol 试剂来溶解细胞,用 移液器反复吸打细胞溶液。加入的trizol 试剂的量取决于培养皿的表面积(每10cm2加入 1ml)而不是取决于细胞的数目。如果trizol 试剂的量不足,提取的rna中会混有dna。 c. 悬液中培养细胞离心沉淀细胞,吸取细胞,反复吹打使溶解于trizol 试剂中。每 5~10×106个动物,植物或酵母细胞,每1×107个细菌细胞加入1ml trizol 试剂。应该避 免在加入trizol 试剂前洗细胞,因为会增加mrna的变性。破坏某些酵母或细菌细胞需要使 用匀浆机。 2.选择采用的步骤:对于含有大量蛋白质,脂肪,多糖或其他细胞外物质的样品如 肌肉,脂肪,植物的块茎等可能需要再加上一个步骤。匀浆后,2℃~8℃条件下12,000×g 离心10分钟去除不溶物质。沉淀中包含有细胞外膜,多糖,大分子量dna,rna在上清中。 来源于脂肪组织的样品,最上层是脂肪层应该弃去。在每一种情况下,将纯净后的匀浆溶液 放在一新管里,加入氯仿即可以有如后面所描述的分层。 3.有机相与无机相的分开将匀浆后的样品在15℃~30℃孵育5分钟使核酸蛋白质混 合物分裂彻底。每1mltrizol 试剂加入0.2ml氯仿。小心盖上离心管盖,用手剧烈振摇15

invitrogen trizol试剂盒的说明书

从组织中提取总RNA 1)液氮研磨,组织块直接放入研体中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮, 再研磨,如此三次,按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol,转移入离心管进行第2步操作。 2) 匀浆:组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol,另外,组织体积不能超过Trizol 体积 的10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。 从细胞中提取总RNA 1) 培养贴壁细胞:不须消化,可直接用Trizol进行消化、裂解,Trizol体积按10cm2/ml 比例加入。 2) 悬浮细胞可直接收集、裂解,每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞,或107细菌细胞。 2.细胞或组织加Trizol后,室温放置5min,使其充分裂解。注:此时可放入-70℃长期保持。 3.12000rpm 离心5min,弃沉淀。 4.按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿,振荡混匀15分钟,室温放置15min。注:禁用漩涡振荡器, 以免基因组DNA断裂。 5.4℃12000g离心15min。 6.吸取上层水相,至另一离心管中。 注:1)千万不要吸取中间界面。 2)若同时提取DNA和蛋白质,则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA,则弃下层酚相。7.按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀,室温放置5-10min。 8.4℃ 12000g离心10min,弃上清,RNA沉于管底。 9.按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇,温和振荡离心管,悬浮沉淀。 10.4℃ 8000g离心5min,尽量弃上清。 11.室温晾干或真空干燥5-10min。注:RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解。 12.可用50ul H2O,TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品,55-60℃5-10min。 注:H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。 12、测O.D值定量DNA浓度。 注:1)此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间。 2) 产率估计:组织标本:(ug RNA/mg组织)1-10ug,培养细胞(ug RNA/106 Cell):5-15ug。注:1、组织或细胞量过少,可酌情减少Trizol用量。 2、组织或细胞用量过多,会引起DNA对RNA的污染。 3、高蛋白,脂肪或多糖类组织,肌肉组织或块状植物组织等,组织匀浆或液氮研磨 后须4℃ 1200离心10min去掉不溶物,再进行下面操作,若顶层有脂肪物,则 也须去掉。 4、热天提RNA,带手套是必须的,手是RNase的主要来源。 5、组织块用液氮研磨,效果最好,若没有液氮或电动匀浆器,可用手动匀浆器代替, 此时组织块不宜过大,且需先用眼科剪将组织绞碎,然后再充分研磨。

Trizol法提取RNA实验步骤与原理(新手详细注释版)

Trizol法使用步骤 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库,RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。 二、用户需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、Glycogen(可能需要)、 1.5ml Eppendorf管(RNase-free)、Tips(RNase-free) 三、准备工作 RNase酶非常稳定,是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与RNA制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套。 RNase的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂,一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。 1、料制品的处理 尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明RNase-Free 的塑料制品,如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下: 1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意:DEPC为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用。 2)处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品

的所有部分都浸泡到溶液中。 3)在通风柜中室温处理过夜。 4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。 5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 2、璃玻和金属物品 250°C烘烤3小时以上。 四、从组织中提取总RNA 1)液氮研磨:组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,如此三次,按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol,转入离心管进行第2步操作。 (液氮既能使各种组织成分不易被破坏或降解,又能使组织变硬,脆性增加易于磨碎。终止细胞内外一切生物反应,防止RNA酶的降解反应) 2) 匀浆:组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外,组织体积不能超过Trizol体积的10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。 五、从细胞中提取总RNA 1) 培养贴壁细胞:不须消化,可直接用Trizol进行消化、裂解,Trizol体积按10cm2/ml比例加入。 2) 悬浮细胞可直接收集、裂解,每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞,或107细菌细胞。 六、操作步骤 1、细胞或组织加Trizol后,室温放置5min,使其充分裂解。注:此时可放入-70℃长期保持。

trizol-LS-试剂使用中文说明书

TRIzol LS 试剂(ambion)(中文说明书) 货号规格室温贮存 10296-010 100ml 10296-028 200ml 产品描述 TRIzol LS试剂适用于液体样品,如人、动植物、酵母、细菌或者病毒来源的液体样品,提取高质量的总RNA(DNA和蛋白质也可以)全过程只需1小时。TRIzol LS试剂里含有酚、异硫氰酸胍和其它成分,由于在摇匀样品过程中能很有效地抑制RNase活性,所以TRIzol LS试剂能维持RNA完整性。TRIzol LS试剂允许同时处理大量的样品。 TRIzol LS试剂能从一个样品里有序分离提取RNA、DNA和蛋白质。TRIzol LS试剂均质化样品后,加入氯仿,能看见分层现象,上层是透明的含RNA的水相,中间层,下层是红色的有机相(含有DNA和蛋白质)。水相RNA用异丙醇能沉淀分离;中间层或者下层中的DNA用乙醇沉淀分离;异丙醇沉淀能使蛋白质从酚-醇相的上清液中沉淀出来。沉淀出的RNA、DNA 和蛋白质洗脱杂质,重悬后用于下游。 分离的RNA可以用于RT-PCR, Northern Blot analysis, Dot Blot hybridization, poly(A)+ selection, in vitro translation, RNase protection assay, and molecular cloning 分离的DNA可以用于PCR, and Restriction Enzyme digestion, and Southern Blots. 分离的蛋白质可以用于Western Blots, recovery of some enzymatic activity, and some immunoprecipitation. 注意:TRIzol LS试剂适用于液体样品(如,血液和病毒制品)。TRIzol LS试剂与TRIzol试剂仅在它们成分的含量上不同,TRIzol LS试剂的浓度更高,因此相对于同个样品时,TRIzol LS试剂需要量更少。不要将未稀释的TRIzol LS试剂用于固体样品。处理固体样品时,TRIzol LS 试剂没有TRIzol试剂效果好,收率要低些。 警告 TRIzol LS试剂含有的成分具有毒、腐蚀性和刺激性,如果处理不慎会有危害健康。请在通风橱里操作,并穿好实验服、戴好手套和安全眼镜。避免直接接触TRIzol LS试剂,会导致皮肤、眼睛或者呼吸道等暴露部位的化学灼伤。如果万一接触了皮肤或者眼睛,请立即用大量水冲洗15min,必要时去医院护理。如果吸入了气体,立刻到通风地方呼吸新鲜空气,必要时去医院护理。 内容和贮存 TRIzol LS试剂有100ml和200ml两种规格的,室温运输和贮存。妥善保管,1年内性质都很稳定。 使用目的 仅用于研究,不能用于人或动物的诊断或治疗。 需要材料 分离RNA、DNA和蛋白质还需要下列材料,但是我们未提供 分离RNA时,需要:氯仿;异丙醇;75%乙醇(DEPC水处理过);无RNase水或者0.5%SDS;能达到12,000*g的高速离心机;聚丙烯微量离心管;水浴槽(55-60℃)。 分离DNA时,需要:氯仿;100%乙醇;75%乙醇;0.1M柠檬酸钠(10%乙醇);8mM NaOH;能达到12,000*g的高速离心机;聚丙烯微量离心管。 分离蛋白质时,需要:氯仿;异丙醇;100%乙醇;0.3M盐酸胍(95%乙醇);1%SDS;能达到12,000*g的高速离心机;聚丙烯微量离心管。 样品准备 样品均质化

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Trizol 法使用步骤 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 RNA 质量的高低常常影响 cDNA 库, RT-PCR和 Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。 二、用户需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、Glycogen(可能需要)、 1.5ml Eppendorf 管( RNase-free)、 Tips( RNase-free) 三、准备工作 RNase酶非常稳定,是导致 RNA 降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活, 但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是 RNase 完全失活。它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与RNA 制备有关的分子生物学实验 时,必须戴手套。 RNase 的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。用用 DEPC配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求。取 时必须戴手套。 一般情况下采RNase-free 的物品 1、料制品的处理 尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明 RNase-Free 的塑料制品,如没有开封使用过通常 没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下: 1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入 DEPC使 DEPC的终浓度为 0.1%。注意: DEPC为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用。 2)处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC 水溶液,使塑料制品的所 有部分都浸泡到溶液中。 3)在通风柜中室温处理过夜。 4)将 DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已 DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少 30 分钟。 5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 2、璃玻和金属物品 250°C 烘烤 3 小时以上。 四、从组织中提取总RNA 1)液氮研磨:组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液 氮,再研磨,如此三次,按 50-100mg 组织 /ml Trizol 加入 Trizol,转入离心管进行第 2 步操作。 2) 匀浆:组织样品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol。另外,组织体积不能超过 10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需1-2 分钟。 Trizol 体积的 五、从细胞中提取总RNA 1) 培养贴壁细胞:不须消化,可直接用Trizol 进行消化、裂解,Trizol 体积按 10cm2/ml 比例

Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)

Trizol法使用步骤 一、分离纯化得基本原理 研究基因得表达与调控时常常要从组织与细胞中分离与纯化RNA。RNA质量得高低常常影响cDNA库,RT-PCR与Northern Blot等分子生物学实验得成败。Trizol就是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出得核酸酶。 二、用户需自备得试剂与材料 无水乙醇、氯仿、Glycogen(可能需要)、 1、5ml Eppendorf管(RNase-free)、 Tips(RNase-free) 三、准备工作 RNase酶非常稳定,就是导致RNA降解最主要得物质。它在一些极端得条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规得高温高压蒸气灭菌方法与蛋白抑制剂都不能就是RNase完全失活。它广泛存在于人得皮肤上,因此,在与RNA制备有关得分子生物学实验时,必须戴手套。 RNase得又一污染源就是取液器,根据取液器制造商得要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂,一种RNase抑制剂)配制得70%乙醇擦洗取液器得内部与外部,基本达到要求。取RNase-free得物品时必须戴手套。 1、料制品得处理 尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明RNase-Free 得塑料制品,如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下: 1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使DEPC得终浓度为0、1%。注意:DEP C为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用。 2)处理得塑料制品放入一个可以高温灭菌得容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品得所有部分都浸泡到溶液中。 3)在通风柜中室温处理过夜。 4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已DEPC水处理过得塑料制品得

Trizol使用说明

TRIzol(Invitrogen)试剂的性能描述及注意事项 警告: TRIzol试剂与皮肤接触及吞咽有毒。可导致烧伤。与皮肤接触后,应立即用洗涤剂和大量清水冲洗。如感到身体不适,应就医(如需要,请出示本产品标签)。本产品含有苯酚和其他成分。已经证明TRIzol在室温下可稳定保存12个月。但我们建议在储存于2-8°C,以保证最佳性能。 性能描述: TRIzol试剂(美国专利号,5346994)是即用型细胞或组织总RNA提取试剂。该试剂是利用苯酚和异硫氰酸胍一步完成提取RNA的方法,是对Chomczynski和Sacchi开发的单步RNA提取法的改善。在匀质化或裂解样品中,TRIzol试剂可保持RNA的完整性,同时能破坏细胞并溶解细胞成分。加入氯仿离心后,溶液分离成水相和有机相。仅RNA存在于水相中。将水相转移后,RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后,样品中DNA和蛋白质可通过相继沉淀回收。用乙醇沉淀可从中间相得到DNA,加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。 此技术既可良好的应用于少量组织(50-100mg)和细胞(5×106),也可用于大量的组织(≥1g)和细胞(>107)的处理,组织和细胞不限于人、动物、植物或细菌。TRIzol试剂使用简单方便,可同时处理大量样本。整个过程可在一小时内完成。用TRIZOL提取总RNA可避免蛋白质和DNA污染。提取的RNA可用于Northern blot分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。 TRIzol试剂方便提取不同种类、不同分子大小的RNA。例如,从大鼠肝中提取RNA,经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色,高分子量RNA离散带长度可高达7kb和15kb,(组成mRNA’s和hnRNA’s),两个主要的核糖体RN A 带在~5kB(28S)和~2Kb(18S)。低分子量RNA介于0.1和0.3kB

Trizol法提取RNA实验步骤

T r i z o l法提取R N A实验 步骤 Prepared on 22 November 2020

Trizol法使用步骤 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库,RT-PCR和NorthernBlot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。 二、用户需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、Glycogen(可能需要)、管(RNase-free)、Tips(RNase-free) 三、准备工作 RNase酶非常稳定,是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与RNA制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套。 RNase的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。 1、料制品的处理 尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明RNase-Free的塑料制品,如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下: 1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使DEPC的终浓度为%。注意:DEPC为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用。 2)处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 3)在通风柜中室温处理过夜。 4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。 5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。

trizol提取RNA说明书

Trizol 使用说明书 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化 RNA。RNA 质量的高低常常影响cDNA 库,RT-PCR 和 Northern Blot 等分子生物学实验的成败。Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。 二、用户需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、Glycogen(可能需要)、 1.5ml Eppendorf 管(RNase-free)、 Tips(RNase-free) 三、准备工作 RNase 酶非常稳定,是导致 RNA 降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是 RNase 完全失活。它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与 RNA 制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套。 RNase 的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC 配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求。取 RNase-free 的物品时必须戴手套。 1、料制品的处理 尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明 RNase-Free 的塑料制品,如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下: 1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入 DEPC 使 DEPC 的终浓度为 0.1%。注意:DEPC 为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用。

2)处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入 DEPC 水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 3)在通风柜中室温处理过夜。 4)将 DEPC 水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已 DEPC 水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少 30 分钟。 5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 2、璃玻和金属物品250°C 烘烤 3 小时以上。 四、从组织中提取总 RNA 1)液氮研磨,组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,如此三次,按 50-100mg 组织/ml Trizol 加入 Trizol,转入离心管进行第 2 步操作。 2) 匀浆:组织样品按 50-100mg/mlTrizol 加入 Trizol。另外,组织体积不能超过 Trizol 体积的 10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需 1-2 分钟。 五、从细胞中提取总 RNA 1) 培养贴壁细胞:不须消化,可直接用Trizol进行消化、裂解,Trizol体积按 10cm2/ml比例加入。 2) 悬浮细胞可直接收集、裂解,每 1ml Trizol可裂解 5×106动物、植物或酵母细胞,或 107细菌细胞。 六、操作步骤 1、细胞或组织加 Trizol 后,室温放置 5min,使其充分裂解。注:此时可放入-70℃长期保持。 2、12,000rpm 离心 5min,弃沉淀。 3、按 200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿,振荡混匀后室温放置 15min。注:禁用漩涡振荡器,以免基因组 DNA 断裂。 4、4℃ 12,000g 离心 15min。 5、吸取上层水相,至另一离心管中。注:千万不要吸取中间界面;若同时提取

trizol说明书

TRIzol? Reagent Catalog Numbers 15596026 and 15596018 Doc. Part No. 15596026.PPS Pub. No. MAN0001271 Rev. A.0 WARNING! Read the Safety Data Sheets (SDSs) and follow the handling instructions. Wear appropriate protective eyewear, clothing, and gloves. Safety Data Sheets (SDSs) are available from https://www.sodocs.net/doc/9610078558.html,/support. Product information Invitrogen? TRIzol? Reagent is a ready-to-use reagent, designed to isolate high quality total RNA (as well as DNA and proteins) from cell and tissue samples of human, animal, plant, yeast, or bacterial origin, within one hour. TRIzol? Reagent is a monophasic solution of phenol, guanidine isothiocyanate, and other proprietary components which facilitate the isolation of a variety of RNA species of large or small molecular size. TRIzol? Reagent maintains the integrity of the RNA due to highly effective inhibition of RNase activity while disrupting cells and dissolving cell components during sample homogenization. TRIzol? Reagent allows for simultaneous processing of a large number of samples, and is an improvement to the single-step RNA isolation method developed by Chomcynski and Sacchi (Chomczynski and Sacchi, 1987). TRIzol? Reagent allows to perform sequential precipitation of RNA, DNA, and proteins from a single sample (Chomczynski, 1993). After homogenizing the sample with TRIzol? Reagent, chloroform is added, and the homogenate is allowed to separate into a clear upper aqueous layer (containing RNA), an interphase, and a red lower organic layer (containing the DNA and proteins). RNA is precipitated from the aqueous layer with isopropanol. DNA is precipitated from the interphase/organic layer with ethanol. Protein is precipitated from the phenol-ethanol supernatant by isopropanol precipitation. The precipitated RNA, DNA, or protein is washed to remove impurities, and then resuspended for use in downstream applications.?Isolated RNA can be used in RT-PCR, Northern Blot analysis, Dot Blot hybridization, poly(A)+ selection, in vitro translation, RNase protection assay, and molecular cloning. ?Isolated DNA can be used in PCR, Restriction Enzyme digestion, and Southern Blots. ?Isolated protein can be used for Western Blots, recovery of some enzymatic activity, and some immunoprecipitation. TRIzol? Reagent can also be used with Phasemaker? Tubes to isolate RNA. Refer to TRIzol? Reagent and Phasemaker? Tubes Complete System User Guide (MAN0016163) for the full protocol. Contents and storage Required materials not supplied Unless otherwise indicated, all materials are available through https://www.sodocs.net/doc/9610078558.html,. MLS: Fisher Scientific (https://www.sodocs.net/doc/9610078558.html,) or other major laboratory supplier. Table 1 Materials required for RNA, DNA, and protein isolation Table 2 Materials required for RNA isolation Table 3 Materials required for DNA isolation Table 4 Materials required for protein isolation USER GUIDE

invitrogen trizol rna抽提说明书

RNA抽提全过程(TRIZOL) 一,准备工作 1,实验器具与材料: (1)移液枪:1ml、200ul、10ul (2)吸头:1ml、200ul、20ul (3)吸头台:放置1ml吸头的一个,放置200ul和20ul的吸头一个 (4)EP管1.5ml、100ul (5)玻璃研磨器 (6)容量瓶:1000ml (7)盐水瓶:100ml (8)15ml塑料管一个(配75%乙醇用) 2,实验器具的处理与准备 (1)塑料制品:(包括吸头、EP管等) 将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。或直接购买经DEPC处理的枪头和EP管,每盒大约30元,基本上试剂公司都可以购买。 (2)玻璃制品:(主要是玻璃研磨器) 先泡酸过夜,冲洗干净后,在1‰DEPC水中泡8小时左右,37℃烘干,用蒙锡纸包裹送至干烤3次(或180度干烤)。 (3)金属制品:(镊子等) 先洗干净,再送干烤3次。(不需要泡DEPC水)

3,试剂配制和准备: (1)DEPC水:泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml 容量瓶中静置4小时后备用。配75%乙醇的DEPC水的配制:100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压。 (2)75%乙醇(要在抽提时现配):用无水乙醇和DEPC水配制(DEPC水:无水乙醇=1:3),然后放于-20℃备用。 (3)异丙醇:放入棕色瓶 (4)氯仿:放入棕色瓶 (5)Trizol:100ml/瓶存放于4℃ 二,抽提时注意事项: 全程佩戴一次性手套和口罩,手套要勤换,避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。三,抽提步骤 1.匀浆化作用 取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内,先加0.2ml的Trizol溶液,研磨组织后,倒入1.5mlEP管中,再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗,后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下,室温静置5分钟。 2.分离阶段 每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15秒,使其充分混匀,室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。 3.RNA的沉淀 将上层水相转入新的1.5mlEP管中(约400-500ul),加入0.5ml异丙醇,混匀后放于-20℃中1小时,后12000rmp离心10分钟。 4.RNA的洗脱

Trizol说明书

Trizol说明书 产品简介: 本公司生产的Trizol试剂适用于从细胞或组织中分离总RNA,结果产量高、完整性好、纯度高,省时、省力。提取的总RNA可用于cDNA合成、RT-PCR、Northern Blot、Dot blot、Primer Extension、Poly A RNA筛选、体外翻译或其他基因工程用途。 该试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如,从大鼠肝脏抽提 (mRNA 的RNA琼脂糖凝胶电泳时,可见许多介于7kb和15kb之间不连续的高分子量条带, 和hnRNA成分)两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S),28S与18S 电泳条带亮度比值约为2:1,低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8。 TRizol试剂保存于4℃可达12个月。 下图从K562细胞总提取的总RNA电泳效果图 下表从组织和细胞中提取的总RNA量 组织或细胞(mg、1×106 )总RNA产量(ug) 肝、脾8~20 肾3~5 骨骼肌、脑组织1~5 胎盘1~5

上皮细胞8~20 纤维母细胞5~20 试剂盒组成 产品编号131904 131905 保存条件 Trizol 50ml 100ml 4℃ 说明书 1 份 操作者提供及注意事项 1、新的氯仿、异丙醇、70%酒精(0.1% DEPC-H2O配制)、4℃离心机(速度约12000rpm) 2、1.5ml离心管,1ml、200ul、20ul的吸头,需经过0.1% DEPC-H2O 37℃处理过夜,高压消毒烤干待用;研磨器用水洗干净后,需要180℃高温干烤3小时。 3、在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA 酶的活性很难完全抑制,预防其污染十分必要。全程佩戴一次性手套、口罩。皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。 4、请勿接触皮肤或不慎吞服,会导致灼伤。一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。若感不适,看医生并寻求正确的治疗方案。 操作步骤 1、根据样品的类型,在室温(冰浴更佳)下,选择下面合适的处理方法,样品的体积请勿超过加入Trizol的10%,否则会引起裂解不充分,导致DNA污染RNA。 (1)组织匀浆或研磨 用匀浆器匀浆组织样品,每50~100mg组织加1ml Trizol。如果裂解物中,未研碎的组织过多,12000rpm离心3分钟,再取上清继续操作后续步骤。 (2)单层生长的贴壁细胞 吸掉培养基,用无菌的PBS液或Hank’s液轻轻冲洗后,弃掉上清,直接往培养瓶或培养板中加入1ml Trizol,用移液器或滴管吹打均匀。根据培养板的面积决定所需的Trizol的量,每10cm2加1ml Trizol。

Trizol总RNA抽提试剂盒

Trizol使用说明书 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库,RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。二、用户需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、Glycogen(可能需要)、 1.5ml Eppendorf管(RNase-free)、 ips (RNase-free) 三、准备工作 RNase酶非常稳定,是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与RNA制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。 1、料制品的处理尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明RNase-Free 的塑料制品,如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下: 1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意:DEPC 为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用。 2)处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 3)在通风柜中室温处理过夜。 4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。 5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 2、璃玻和金属物品 250°C烘烤3小时以上。 四、从组织中提取总RNA 1) 液氮研磨,组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少 量液氮,再研磨,如此三次,按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol,转入离心管进行第2步操作。

invitrogen_TRIZOL_中文说明书

TRIZOL? Reagent Cat. No. 15596-026 Size: 100 ml Store at 2 to 8°C. 警告:在与皮肤接触及吞咽有毒。可导致烧伤。与皮肤接触后,应立即用洗涤剂和大量水冲洗。如感到身体不适,应就医(如需要,应出示本产品标签)。本产品含有苯酚(108-95-2)和其他成分(NJTSRN 80100437-5000P)。 已经证明TRIZOL 在室温下可稳定保存12个月。不过,我们建议在储存于2-8°C,以保证最佳性能。 描述: TRIzol试剂(美国专利号,5346994)是即用型细胞和组织总RNA提取试剂。该试剂是一步法苯酚和异硫氰酸胍解决方案,是对Chomczynski和Sacchi开发的单步RNA提取法(1)的改善。在匀质化或溶解样品中,TRIzol试剂可保持RNA的完整性,同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后,裂解液分离成水相和有机相。RNA存在于水相。水相转移后,RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后,样品中DNA和蛋白质可通过相继沉淀回收(2)。用乙醇沉淀可从中间相得到DNA,加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质(2)。与DNA的共纯化可能对不同样品得到的RNA的归一化有用。 此技术可完美应用于少量人类、动物、植物或细菌来源的组织(50-100毫克)和细胞(5×106),以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)。该TRIzol试剂方法简单,允许大量样本同时处理。整个过程可在一小时内完成。用TRIZOL提取总RNA可避免蛋白质和DNA 污染。可用于Northern blot分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。聚合酶链反应(PCR反应)中,当两条引物位于单个外显子时,推荐使用扩增级DNA酶I(Cat. No. 18068)处理分离出的RNA。 TRIzol试剂方便提取不同种类、不同分子大小的RNA。例如,从大鼠肝中提取RNA,

Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)

Trizolxx使用步骤 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库,RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。 二、用户需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、Glycoge(可能需要)、1.5ml Eppe ndof 管(RNase-free)> Tips(RNase-free) 三、准备工作 RNase酶非常稳定,是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规的咼温咼压蒸气火菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与RNA制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套。 RNase的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC焦炭酸二磷脂,一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。 1、料制品的处理 尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明RNase-Free的塑料制品,如没 有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下: 1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意: DEPC为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用。 2)处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

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