菌种诱变方法
微生物诱变育种的方法
摘要:介绍了几种常用的物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等,为微生物诱变育种提供了一个总体的方法框架。
关键词:诱变; 微生物育种
微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以选育优质、高产的微生物菌株十分重要。微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。作为育种途径之一的诱变育种一直被广泛应用。目前，国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。
1 物理诱变
紫外照射
紫外线照射是常用的物理诱变方法之一，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm，因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。紫外辐射的作用已有多种解释，但比较确定的作用是使DNA 分子形成嘧啶二聚体[1]。二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡[2]。
马晓燕[3]等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克
鲁维酵母菌株ZR-20，比优化前的酒精产率提高%，较出发菌株提高了68%。顾蕾[4]等通过紫外诱变红酵母ns-1原生质体，获得类胡萝卜素产量明显提高的突变株，其生物量、色素产量分别为6.15g/L、L，分别比原始菌株提高了%、%。
紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，酵母菌株的诱变大多采用这种方法。
电离辐射
γ-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直接或间接地改变DNA结构。其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键。其间接效应是能使水或有机分子产生自由基，这些自由基可以与细胞中的溶质分子发生化学变化，导致DNA分缺失和损伤[2]。
张伟[5]等将较高产酒精酵母制备成原生质体，经Co60诱变后，采用四级筛选，得到高产酒精酵母菌株Co-158，其遗传性状稳定，其成熟醪酒精体积分数比出发菌株提高了%，比ADY提高了%，残还原糖含量亦远远低于出发菌株和ADY。
除γ-射线外的电离辐射还有X-射线、β-射线和快中子等。电离辐射有一定的局限性，操作要求较高，且有一定的危险性，通常用于不能使用其他诱变剂的诱变育种过程。
离子注入
离子注入是20世纪80年代初兴起的一项高新技术，主要用于金属材料表面的改性。1986年以来逐渐用于农作物育种，近年来在微生物育种中逐渐引入该技术[6]。
离子注入时，生物分子吸收能量，并且引起复杂的物理和化学上的变化，这些变化的中间体是各类活性自由基。这些自由基，可以引起其它正常生物分子的损伤，可使细胞中的染色体突变，DNA 链断裂，也可使质粒DNA造成断裂[7,8,9]。由于离子注入射程具有可控性，随着微束技术和精确定位技术的发展，定位诱变将成为可能[7]。
向砥[10]等用10keVN+诱变产壮观霉素菌株Streptomycesspectabilisb，使产量提高%。于广成等用10keVN+诱变产灰黄霉素菌株Penicellliunpatulum，使产量提高%[11]。除此之外，糖化酶生产菌、不饱和脂肪酸生产菌、维生素生产菌的离子束诱变效果也得到充分肯定。这些表明，离子辐照处理是一种极有潜力的微生物药物的诱变育种新方法[12]。离子注入法进行微生物诱变育种，一般实验室条件难以达到，目前应用相对较少。
激光
激光是一种光量子流，又称光微粒。激光辐射可以通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合应用，直接或间接地影响有机体，引起细胞染色体畸变效应、酶的激活或钝化，以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变。光量子对细胞内含物中的任何物质一旦发生作用，都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发生变异。不同种类的激光辐射生物有机体，所表现出的细胞学和遗传学变化也不同[13]。
激光辐照酿酒酵母(Saccharomycescereisiae)，筛选到胡卫红等[13]采用CO
2
乙醇产量有较大提高的变异株。鲍淑兰[14]以啤酒酵母(Saccharomycescer- evesea)为材料，用He- Ne 激光进行照射，发现随着照射时间的延长，致死率和突变率均明显增加，同时在选择培养基上筛选出多种氨基酸突变型。
激光作为一种育种方法，具有操作简单、使用安全等优点，近年来应用于微生物育种中取得不少进展。
微波
微波辐射属于一种低能电磁辐射，具有较强生物效应的频率范围在
300MHz~300GHz，对生物体具有热效应和非热效应。其热效应是指它能引起生物
体局部温度上升。从而引起生理生化反应;非热效应指在微波作用下，生物体会产生非温度关联的各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下，生物体会产生一系列突变效应[15,16]。因而，微波也被用于多个领域的诱变育种，如农作物育种、禽兽育种和工业微生物育种，并取得了一定成果。这方面的工作贾红华等[17]和雷肇祖等[18]有所报道。
航天育种
航天育种，也称空间诱变育种，是利用高空气球、返回式卫星、飞船等航天器将作物种子、组织、器官或生命个体搭载到宇宙空间，利用宇宙空间特殊的环境使生物基因产生变异，再返回地面进行选育，培育新品种、新材料的作物育种新技术。空间环境因素主要有微重力，空间辐射，以及其它诱变因素如交变磁场，超真空环境等，这些因素交互作用导致生物系统遗传物的损伤，使生物发生诸如突变、染色体畸变、细胞失活、发育异常等。
我国在这方面取得不少进展，自1987年以来先后9次利用返回式卫星，4次利用高空气球搭载了70多种植物，500多个品种的40多公斤种子，涉及到粮食、棉花、油料、蔬菜、瓜果、花卉等作物，经国内20多个省、市、区的50多个研究单位育种工作者的地面种植试验，育成了高产、稳产、优质、多抗的青椒、番茄、水稻、小麦、莲子等作物新品种、新品系，从中还获得了一些有可能对产量和品质等经济性状有突破影响的罕见突变[19]。
航天育种较其它育种方法特殊，是航天技术与微生物育种技术的有机结合，技术含量高，成本高，个体研究者或一般研究单位都难以实现，只能与航天技术相结合，由国家来完成。
2 化学诱变
与物理诱变相比，化学诱变在某种程度上应用更为广泛，是指利用一些化学物质提高生物的自然突变率，这些化学物质就叫做化学诱变剂。化学诱变可操作性强，简单易行;特异性较强，能诱变定位到DNA上的某些碱基;后代较易稳定遗传，一般到F3代就可稳定;应用于遗传标记，是细胞融合技术的基础。
化学诱变剂主要包括4类，他们的特点、机理和应用如下:
烷化剂
烷化剂能与一个或几个核酸碱基反应，引起DNA 复制时碱基配对的转换而发生遗传变异，常用的烷化剂有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、乙烯亚胺、硫酸二乙酯等。
甲基磺酸乙酯( ethylmethane sulphonate，EMS)是最常用的烷化剂，诱变率很高。它诱导的突变株大多数是点突变，首先是鸟嘌呤的O6位置被烷基化，在DNA 的复制过程中，烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基的替换，即G:C 变
为A:T[20]。常用浓度为~L，作用时间5~60min。该物质具有强烈致癌性和挥发性，可用5%硫代硫酸钠作为终止剂和解毒剂。
N-甲基- N'-硝基- N-亚硝基胍( NTG)是一种超诱变剂，应用广泛，但有一
定毒性，操作时应该注意。在碱性条件下，NTG会形成重氮甲烷(CH
2N
2
)，它是引
起致死和突变的主要原因。它的效应很可能是CH
2N
2
对DNA的烷化作用引起的[2]。
周希贵等[21]用NTG对多粘类芽胞杆菌进行诱变，获得一株粘杆菌素发酵单位比出发菌株提高105%的菌株。
硫酸二乙酯( DMS) 也很常用，但由于毒性太强，目前很少使用。乙烯亚胺，生产的较少，很难买到。使用浓度%~%，高度致癌性，使用时需要使用缓冲液配置。
碱基类似物
碱基类似物分子结构类似天然碱基，可以掺入到DNA分子中导致DNA复制时产生错配，mRNA转录紊乱，功能蛋白重组，表型改变。该类物质毒性相对较小，但负诱变率很高，往往不易得到好的突变体。主要有5- 氟尿嘧啶( 5- FU)、5- 溴尿嘧啶( 5- BU)、6- 氯嘌呤等。程世清等[22]用5- BU 对产色素菌(分枝杆菌T17- 2- 39) 细胞进行诱变，生物量平均提高%。
无机化合物
诱变效果一般，危险性较小。常用的有氯化锂，白色结晶，使用时配成%~%的溶液，或者可以直接加到诱变固体培养基中，作用时间为30min～2d。
亚硝酸易分解，所以现配现用。常用亚硝酸钠和盐酸制取，将亚硝酸钠配成~L的浓度，使用时加入等浓度等体积的盐酸即可。
其他
盐酸羟胺，一种还原剂，作用于C上，使G- C变为A- T。也较常用，使用浓度为%～%，作用时间60min～2h。此外，诱变时将两种或多种诱变因子复合使用，或者重复使用同一种诱变因子，效果更佳。顾正华等[23]以谷氨酸棒杆菌ATCC- 13761 为出发菌株，经DMS和NTG多次诱变处理，获得一株L-组氨酸产生菌。
常翠贤[24]等以产纤溶酶的根霉Y为出发菌株，通过亚硝基胍、紫外复合诱变，得到一株高产突变株C6，其产酶活性是出发菌株的倍。杜娟[25]等以一株具有较高纤维素酶活性的野生菌株-灰绿曲霉XC9为出发菌株，经氯化锂、紫外、甲基磺酸乙酯等多重诱变处理，获得了抗葡萄糖阻遏的突变株，其CMC 酶活与出发菌株相比提高了2倍左右。
3 结束语
随着遗传学和分子生物学领域的飞速发展，许多新型复杂的技术被应用于菌种选育，如原生质体融合育种技术和基因工程育种技术等，但是诱变育种技术
仍是提供菌株生产能力的重要有效手段。它获得的正突变率相对较高，可以得到多种优良突变体和新的有益基因类型。另一方面，诱变育种存在一定的盲目性和随机性，在实际应用中，研究者应根据出发菌株及实验室条件等具体情况来选择合适的诱变方法。
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菌种活化保存法
附件： 新菌株（乳酸菌）斜面培养法 1.购买新菌株（安瓿瓶装冻干粉） 2.菌种管开启方法一：按购买菌种上的说明进行操作即可。 3.菌种管开启方法二（本次实验方法均在水平层流台进行）： 3.1水平层流台开启风机跟紫外灯，半个小时 3.2 用浸过75 ％酒精的脱脂棉擦净菌种管。 3.3将菌种管顶端在火焰上加热，注意避免直接加热菌体或加热过度。 3.4 将无菌水滴至加热过的菌种管顶端，使玻璃开裂。 3.5 用锉刀或镊子敲下已开裂的菌种管的顶端。 4.用玻璃三角瓶121.0℃灭菌约10-30ml的生理盐水20分钟 5.将开封后的冻干粉倒入生理盐水中，摇匀 6.用接种环沾取生理盐水，转接与MRS培养基平板上，在36.5℃中恒温培养48-72小时 后，得到二代菌。 7.此时可以使用二代菌进行菌株扩大培养，或对其进行保存菌种。 注意事项： 1 菌种活化前，请将冻干菌种管冷藏保存在5 ℃-10 ℃环境下。 3 菌种经过冷冻干燥后，生长延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。 4 菌种活化及使用过程应做好安全防护工作。 第二代第2 代)观察是否具有典型的菌落形态,然后挑取单一的纯菌落,进行革兰染色、镜检,观察其染色特征及菌体形态,并进一步做生化鉴定实验以确定菌种。第三代为工作用菌。 乳酸菌菌种保存法 方法一：斜面保存法（略） 方法二：20%甘油保存法 器材：冻存盒、冻存管(2ml装)、甘油（丙三醇）、MRS肉汤培养基、1ml移液器及枪头、酒精灯、水平层流台、高压灭菌锅 操作步骤： 1.在水平层流台中用接种环挑取所需保存的的菌株放于灭菌过的MRS肉汤培养液，进行 36.5℃恒温培养48小时 2.配制40%的甘油，用移液器移取0.5ml于冻存管中，放于冻存盒 3.用报纸将冻存盒包扎好，放于灭菌锅中灭菌（121.0℃、20Min） 4.在水平层流台中，用移液器移取0.5ml培养后的MRS肉汤培养液加入到冻存管中，拧 紧盖子，摇匀，标识。 5.在冻存盒外也做好操作人，日期，所保存的菌种等信息标记 6.将冻存盒放于保鲜袋中，放入冰箱的冷冻室层进行保存，一般可以保存至两三年。 7.若是需用，那一冻存管样进行培养即可。 实验室菌种激活方法
菌种鉴定手段
菌种鉴定手段 （1）常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和生理生化特征。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应等。 （2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 BIOLOG是一种微生物菌种快速鉴定系统，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 （3）分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。（4）API细菌数值鉴定系统
API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 （5）功能性分析及功能基因 CICC不断致力于工业微生物资源的功能及其功能基因研究，目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定，在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。 （6）RAPD、SSCP技术 随着微生物菌种应用的进一步发展，在食品安全管理、生物产品出口认证、知识产权保护等行业需求日益增加，微生物菌种株水平的鉴别技术成为一个迫切需要解决的问题。 CICC采用随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphism DNA，RAPD）技术和单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技术对微生物菌株进行鉴别。如采用RAPD技术能够对同一菌种原始菌株与诱变菌株进行鉴别，对诱变菌株知识产权保护具有重要意义；采用SSCP技
微生物菌种的选育方法
微生物菌种的选育方法 菌种选育Loremreferentibus（英语：Strain selection 日语：ひずみの选択法语：la sélection des souches 俄语：Штаммвыбор 德语：Stammselektion ）微生物菌种是决定发酵产品的工业价值以及发酵工程成败的关键，只有具备良好的菌种基础，才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想的发酵产品。菌种用途广泛涉及食品、医药、工农业、环保等诸多领域。 自然选育
自然选育的菌种来源于自然界、菌种保藏机构或生产过程，从自然界中选育菌种的过程较为复杂，而从生产过程或菌种保藏机构得到菌种的自然选育过程较为简单。 自然选育的步骤主要是：采样，增长培养，培养分离和筛选等。采样筛选的菌种采集的对象以土壤为主，也可以是植物、腐败物品和某些水域等。土壤是微生物的汇集地，从土壤中几乎可以分离到任何所需的微生物，故土壤往往是首选的采集目标。微生物的营养需求和代谢类型与生长环境有很大关系。富集培养由于采集样品中各种微生物数量有很大差异，若估计到要分离的菌种数量不多时，就要人为增加分离的概率，增加该菌种的数量，称为富集培养。纯种培养尽管通过增长培养的效果很好，但是得到的微生物还是处于混杂状态，因为样品中本身含有许多种类的微生物。所以，为了取得所需的微生物纯种，增殖培养后必须进行分离。平板分离法由接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。分离方法有三种：即划线分离法、稀释法和组织分离法。稀释分离法在溶液中再加入溶剂使溶液的浓度变小。亦指加溶剂于溶液中以减小溶液浓度的过程。浓溶液的质量×浓溶液的质量分数=稀溶液的质量×稀溶液的质量分数生产能力考察初筛一般通过平板稀释法获得单个菌落，然后对各个菌落进行有关性状的初步测定，从中选出具有优良性状的菌落。例如，对抗生素产生
菌种活化_操作方法
低温保存管（cryotube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryotube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 ?l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环
（2）平板划线法 冷冻干燥管之开管说明 下列步骤请在无菌环境下操作： 1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。 2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。 3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。 4、( a ) 适用于细菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。 ( b ) 适用于霉菌、酵母菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml 无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 5、取0.1-0.2 ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L 型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。 6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期( lag period ) 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养(Subculture) 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。 8．未开封之冷冻干燥管，请冷藏于4℃冰箱，切勿冷冻保存。
菌种活化-操作方法
菌种活化-操作方法-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
低温保存管（cryotube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryotube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环 （2）平板划线法
2018-大肠杆菌菌种活化步骤-推荐word版 (6页)
本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！ == 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ == 大肠杆菌菌种活化步骤 篇一：抑菌实验步骤 抑菌实验：待测菌金色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌；大肠杆菌；绿脓杆菌 菌种活化：菌种，进行活化，可以划线，也可以涂布， 划线：直接用接种环在酒精灯上烧过之后，等之冷却，蘸 取进行划线！ 涂布：用枪头吸取100ul的菌液涂布既可！本实验采用涂 布法 1.金色葡萄球菌最佳生长条件(过夜培养一般为12h) 2. 枯草芽孢杆菌培养条件（过夜培养） 3.绿脓杆菌最佳培养条件（14-17h） 培养基 MH（A）培养基( Mueller-Hinton Agar)成分：牛肉浸粉（牛肉膏） 5g；酪蛋 白水解物 17.5g；淀粉 1.5g；琼脂 12.5g MH液体培养基配制方法：称取本品36.5克，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸 溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。 牛肉膏蛋白胨固体培养基（LB培养基）：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，琼脂15g，NaCl 5 g，双蒸水1000mL，pH 7.2-7.5，121℃灭菌20min。 牛肉膏蛋白胨液体培养基：不加琼脂，其他同牛肉膏蛋白胨固体培养基。 菌悬液的配制
将冰箱保存的大肠杆菌移接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于37℃恒温培养 箱中培养24 h，用接种环挑取少许菌体与装有无菌生理盐水的试管中，震荡均匀，制成菌悬液。具体为用接种环挑取一环（本实验是吸取100uL菌悬液）于 5 mL的无菌生理盐水中，每10倍稀释一次地逐级稀释，取（10-8、10-9、10- 10 、10-11）的浓度100μL做涂布实验，每个梯度平行三组，加100μL药品 溶剂（二甲基亚砜）的空白对照3个平板，完全不加任何样品即只是LB培养基的完全空白对照1个平板，调整菌悬液浓度，用平板菌落法测定其菌液浓度， 使其含菌体数为103 cfu/mL，即为供试菌悬液。 抑菌作用初步筛选 将灭菌固体培养基加热至熔化，待冷却至50℃时，每20ml培养基倒入无菌培 养皿中。待平板自然晾干后，分别移取0.1ml待测药品，0.1 mL供试菌悬液， 均匀涂布于加药平板上，每个处理3次重复。(涂布30min后再倒置)另设置对 照组，涂菌，以等量无菌水（溶解药品物质）代替药液。上述操作在超净工作 台内进行。将做好的细菌平板在37℃恒温培养24 h，统计菌落个数，按照下式计算抑菌率。 抑菌率=对照菌落数-处理菌落数?100% 对照菌落数 实验结果表示为：平均数±标准误差（Mean±SDE）。 菌种活化：37℃培养；约24H 挑取两环于50ml 液体培养基上活化：先恒温150r/min震荡12h,再静置培养 8-12h。达到稳定期后，4度保藏，备用。 生理盐水：8.5gNaCl加入到1000ml 蒸馏水中，121度高压蒸汽灭菌15-20min 即可。 篇二：大肠杆菌电击转化流程 大肠杆菌感受态制备及电转化流程 1. 细菌电转化感受态细胞的制备 准备：50mL离心管3个 10%甘油≥200mL 灭菌蒸馏水≥100mL 冰盒（50mL离心管预冷）2个 1）由-80℃冰箱保存的菌种划单菌落，过夜培养16-20h。晚上将新鲜的菌落接 种于装有20mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养过夜（约12h），转 速控制在200rpm； 2）第二天，取过夜培养物以1%接种量（可适当加大）转接入2个含50mLLB培 养基的 250mL三角瓶中，37℃剧烈振荡（200rpm）培养至OD600约为0.5~0.6；
菌种鉴定方法
1. 菌落形态观察 观察菌落的大小、形状、隆起度、边缘、表面性状、颜色与透明度、质地和干湿度。 2. 革兰氏染色 按照革兰氏染色方法进行制片、初染、媒染、脱色、复染、干燥、镜检；干燥后，用油镜观察。 3. 鞭毛染色 挑取18~30 h新鲜平板培养物制备菌悬液，制片，室温自然干燥。滴加硝酸银染色A液覆盖3~5 min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。 4. 糖类分解试验 将被检菌接种于糖发酵培养基中，37℃培养2－3天。如果培养基变黄，说明产酸；如变黄的同时，还有气泡，说明既产酸又产气。培养基仍呈蓝色，说明未产酸。选取木糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖。 5. 吲哚（靛基质）试验 将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中，37℃培养1－2天。于培养液中加入戊醇或二甲苯2－3ml，摇匀，静置片刻后，沿管壁加入试剂2ml，如出现红色沉淀，表示为阳性。 6. 淀粉水解试验 将LB琼脂加热融化，使冷到50℃，加入淀粉溶液，混匀后，倾注平板。将细菌划线接种于平板上，37℃培养24小时，生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，培养基呈深蓝色，能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环。 9. V－P试验 将被检菌接种于试验培养基中（葡萄糖、K2 HPO4、蛋白胨各5g，溶于1 000ml 水中，分装于试管中，0.075MPa灭菌10分钟），培养2－7天后，于培养物中加入1ml 10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性。 10.甲基红（M.R）试验 接种细菌，于37℃培养2－7天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（0.1g 甲基经溶于300ml 95%乙醇中，加蒸馏水至500 ml），如呈红色，表示阳性。 11. 柠檬酸盐利用试验 将被检菌接种到Simmons固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2－4天，能利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长，培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。 12. 硝酸盐还原试验 将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1－2天，每管中先加入甲试剂0.1ml，再加乙试剂数滴，如出现红色，表示阳性。 13. 接触酶试验 将1ml 3%的H2O2倾注于生长物（菌落或菌苔）上，有气泡（O2）发生者为阳性。也可于清洁小试管中加少量H2O2（30%），再用清洁无菌的细玻棒（或火焰封口的毛细管或镍铬做成的接种环）醮细菌少许，插入H2O2液面下，有气
菌种诱变方法
微生物诱变育种的方法 摘要:介绍了几种常用的物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等,为微生物诱变育种提供了一个总体的方法框架。 关键词:诱变; 微生物育种 微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以选育优质、高产的微生物菌株十分重要。微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。作为育种途径之一的诱变育种一直被广泛应用。目前，国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。 1 物理诱变 1.1紫外照射 紫外线照射是常用的物理诱变方法之一，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm，因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。紫外辐射的作用已有多种解释，但比较确定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体[1]。二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡[2]。 马晓燕[3]等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克 鲁维酵母菌株ZR-20，比优化前的酒精产率提高10.5%，较出发菌株提高了68%。顾蕾[4]等通过紫外诱变红酵母ns-1原生质体，获得类胡萝卜素产量明显提高的突变株，其生物量、色素产量分别为6.15g/L、6.41mg/L，分别比原始菌株提高了67.6%、54.1%。 紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，酵母菌株的诱变大多采用这种方法。 1.2电离辐射 γ-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直接或间接地改变DNA结构。其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键。其间接效应是能使
细菌鉴定方法
1.2.1 形态学特征 按照东秀珠和蔡妙英编《常见细菌系统鉴定手册》（1999），中科院微生物所编著《一般细菌常用鉴定方法》（1978）的方法进行鉴定。芽孢杆菌属鉴定到种，参照了蔡妙英等译《芽孢杆菌属》（1980）的方法。 （1）革兰氏染色：挑选少许菌苔，涂布于干净玻片的蒸馏水中，风干固定，结晶紫染色（结晶紫2g，草酸铵0.8g，95%乙醇20 ml，加水至100 ml）1min，水洗后碘液（碘1g，碘化钾2g，水300 ml）作用1min，水洗，脱色，用番红O 液染3min，水洗，风干，光学显微镜观察。 （2）鞭毛染色：将16~24h菌龄的菌苔在载玻片上的水滴中轻蘸几下，将玻片倾斜，使菌液缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。干燥后滴甲液（丹宁酸5g，FeCl3 1.5g，15%福尔马林2ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100 ml）染6~10min，水洗，干燥后，用乙液（2%AgNO3溶液）加热复染30min，蒸馏水冲洗，干燥，镜检，菌体为深褐色，鞭毛为褐色。 （3）运动性：半固体琼脂穿刺法，将菌种接在可使鉴定菌生长良好的培养基中，其中含0.3~0.6%的琼脂。适温培养，运动性可用透射光目测，如生长菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表明鉴定菌无运动性；如生长菌由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示鉴定菌有运动性。 （4）芽孢染色：孔雀绿染色法。按革兰氏染色涂片后，用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6%）染20 min，水冲洗后在用0.5%番红O复染20~30s，水洗，吸干，镜检。芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。 （5）抗酸染色：常规涂片，石碳酸复红（10%碱性复红乙醇饱和液10 ml，5%石碳酸水溶液100 ml）加热染色5 min，倾去染液用酸性乙醇脱色，吕氏美蓝（2%亚甲基蓝乙醇饱和液30 ml，0.01%KOH 100 ml。）复染2min，水洗，吸干，镜检。 （6）荚膜染色：在载片一端滴一滴无菌水，取少许菌苔在水滴中制成悬液。取一滴墨汁与菌悬液混合，并用另一载片之一端将此水滴在载片上刮成薄膜风干。用纯甲醇固定1min，加0.5%番红O液数滴滴于涂片上，冲去残余甲醇，并染30s，然后倾去染液，立即吸干，镜检。 1.2.2 培养及生理特性 （1）菌落形态：用划线法将菌种接在平板培养基上，适温培养1~2d，出现单菌落开始观察，包括形状和大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落和培养基的颜色等。 （2）生长温度和耐热性：将菌种转接到几支试管中，分别在不同温度下培养，每处理2管，目测生长情况。
菌种鉴定的分子生物学方法
菌种鉴定的分子生物学方法 ——16S rDNA测序鉴定菌种 一．原理 细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。二．技术路线 该方法包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。具体技术路线如下： 三．方法步骤 （一）细菌基因组DNA提取（酶解法） 1. 挑取单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。
菌种活化方法
低温保存管（cryo tube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryo tube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 ?l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环
（2）平板划线法 冷冻干燥管之开管说明 下列步骤请在无菌环境下操作： 1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。 2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。 3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。 4、( a ) 适用于细菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。 ( b ) 适用于霉菌、酵母菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 5、取0.1-0.2 ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。 6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期 ( lag period ) 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养 (Subculture) 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。
菌种鉴定常见问题解答
菌种鉴定常见问题解答 1.菌种鉴定的方法和步骤是什么？ 菌种鉴定一般就只要提取基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA片段，上GeneBank或者Eztaxon对比即可。一般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌（当然也有例外，DNA序列仅仅是一个参考指标）。 -----消息来源：百度问答 . 2. 微生物的菌种鉴定可以鉴定到“株”一级吗？ 如果你的菌株是自然界中分离得到，就只能鉴定到种，不能鉴定到株，因为多多少少和其他株系的细菌有区别，即便你做了一些特征的鉴定，发现和某一株细菌一模一样，你也没有理由说你的细菌就是那一株细菌，因为你不可能把所有的特征都做完，株和株之间的关系就相当于不同的人之间的关系，世界上不可能有完全相同的两个人。除非你知道你的细菌本来就是某一株细菌扩增出来的（而且要保证没有变异，否则就是一个新株），可是这样就没必要鉴定了。 -----消息来源：百度问答 3．为什么鉴定出来的菌种跟我想象的相差太大？ 答：我们菌种鉴定使用PCR直接扩增的方法，即以客户提供的菌株为模版直接进行PCR扩增，中间不经过传代培养，因此不会引入新的污染，如果出现结果不一致的情况，一般有以下原因导致： 1、您提供的样品未经过三次分离纯化，含有其他杂菌； 2、您提供样品的真实情况确认如此。 建议您提供三次纯化的菌株重新进行鉴定。 4．为什么有时会出现PCR扩增不出的现象； 答：扩增不出的原因主要有以下几种： 1、您提供的菌种从严格意义上讲不是细菌或者真菌，或者是信息有误； 2、您提供的菌种为革兰氏阳性菌，由于细胞壁较厚，采用常规方法不能有效地破壁； 3、培养基或菌体中表达产物含有抑制PCR产物的组份。 对于第二种或第三种情况需要提供基因组DNA。 5．PCR扩增直接测序为什么会出现套峰的现象； 答：1、测序结果个别碱基出现N，是由细菌rDNA多态性造成，对菌种鉴定没有无影响； 2、所有测序反应均出现大面积套峰，是由于您提供的样品模版不纯造成的。这种情况需要重新纯化菌种。 6．PCR产物克隆测序为什么会出现结果分离的现象？ 答：我们以菌种为模版直接进行PCR扩增，然后对PCR产物进行克隆测序，如果出现2种或以上的测序结果，说明您提供的模版不单一，即菌种不纯，含有其他杂菌，这种情况建议您将菌种重新进行三次以上纯化。 7．菌种鉴定可以鉴定到种吗？ 答：利用rRNA的保守区域进行鉴定只是菌种鉴定的一个分子生物学指标，通过鉴定结果可以了解未知菌株和NCBI公布序列的哪个种属比较接近。
菌种筛选方法
常用的菌种的筛选方法如下： （1）施加选择性压力分离法 主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势。而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。 （2）随机分离方法 有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。 A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。 B、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。 C、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。 （3）目的微生物分离 A、根据形态筛选突变株 B、根据平板菌落生化反应筛选变株透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。①透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法进行初筛。在选择性培养
EM固体菌种制作方法
EM固体菌种 本品由双岐菌、乳酸菌、芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌、放线菌、醋酸菌等单一菌种复合发酵提纯而成，每克含有益总菌数≥1000亿个。本品促进畜禽增重率提高10～30%。使用本品所产的肉、蛋、奶能延长保鲜和储存。长期应用本品，综合效益极为显著。 【主要成分】双岐菌、乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、醋酸菌、光合细菌、解磷钾菌等 【产品名称】EM菌种 【产品性状】粉剂【批准文号】豫饲添字（2015）09003 【产品规格】10克/瓶；10瓶/盒【生产许可】豫饲添（2014）H07009 【有效日期】3年【贮藏方法】密封避光阴凉处 【制作方法】 第一步：材料准备如下：菌种1瓶；水36斤；红糖4斤；发酵桶1个；食盐20克（选加）；尿素20克（选加）； 第二步：把4斤红糖加入36斤水中后加热烧开去除杂菌；待冷却到40度以下后再装入发酵桶内。并加入1瓶菌种。 第三步：密封好发酵3到7天时间即可制作成功；成功后原液检测标准：PH在3到5之间；镜捡活菌100亿每毫升。 【注意事项】 第一：原液制作时可以加入20克食盐和20克尿素；加入的话会好些。这个是选加的；没有不加也可以。 第二：干净的水源和红糖也可以不烧开加热；但加热可以清除绝大部分杂菌；这样效果好些。 第三：制作过程中会有很强气压产生；可以每天打开放气后接着马上盖起来继续发酵；或安装自动排气阀。 第四：发酵温度最好控制在30到35度最好；低于10度不发酵；高于45度会烫死部分菌。 第五：冬天温度低需要延长发酵时间；但最好用电热毯或电灯；棉被等等包起来加温；或放太阳下晒。 第六：EM菌属于厌氧发酵；也就是说容器必须密封好发酵；密封好坏是发酵成败的关键因素。 第七：EM原液发酵饱和了PH值应在3到5之间；如高于5的话可以再延长发酵几天即可。 第八：黑糖；黄糖；葡萄糖；蜂蜜；都可以代替红糖使用；但白糖不行。 第久：制作好的液体请在12个月内用完；固体原种保存期是36个月。 第十：制作过程会有很大气压，建议使用塑料和不锈钢容器，严禁使用玻璃瓶和陶瓷瓶制作，以免意外。 第十一：瓶底有沉淀物为菌种载体，属正常情况；若瓶内有气体，请缓慢开启，以免菌液外溢。 【养殖专用菌种】 【作用机理】 1、EM有益菌可改善动物肠道内的微生物环境，帮助消化系统对食物的充分消化和吸收。 2、EM有益菌可激活动物体内上万种酶的活性；促进畜禽生长，提高动物繁殖能力。 3、EM菌可提高畜禽特异性免疫和非特异性免疫功能；达到动物抗病防病和减少发病的作用，代替抗生素。 4、EM有益菌可分解动物粪便中的有害微生物，明显消除圈舍粪便恶臭，改善饲养环境。 【作用用途】 1、EM菌种可以发酵微生物饲料、制作EM菌液（EM原露、EM原液）等微生物产品； 2、EM菌种能防治雏鸡白痢，中鸡球虫、脱肛和仔猪黄白痢、腹泻等消化道疾病； 3、EM菌种促进畜禽生长，提高动物繁殖能力，提高饲料报酬率、产蛋率和产肉率； 4、EM菌种可以用于发酵猪床，发酵猪床材料（锯末、秸秆粉、干草粉、黄土）； 【用法用量】 1、用发酵好的EM原液按1：300～500倍稀释后供动物饮用、混入饲料、喷洒到动物粪便上、发酵秸秆等； 2、治疗动物疾病时可加倍使用（1：100倍稀释）。
ITS菌种鉴定方-法
利用ITS进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。ITS是内源转录间隔区（In ternally Tran scribed Spacer）的英文缩写,位于rRNA 编码基因18S,5. 8S和28S之间的小基因片段。其优点有：具有高拷贝数,整个序列的长度在600?800 bp,利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来；同时包含保守与变异序列，能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，rRNA基因（rDNA）在微生物的鉴定应用中，具有检测微生物种水平的多态性特征。这些rDNA高度保守地分布在染色体的不同位置，在每个单倍染色体基因组中的拷贝数超过200个，这使得保守区域能够很容易被扩增出来。每个重复的rDNA序列的存在方式为由一前一后的18S rDNA小亚基单元（SSU）, 5.8S rDNA, 28S rDNA大亚基单元（LSU）组成，已设计出通用引物来扩增ITS序列分析相关真菌种水平之间的差异。本研究通过丝状真菌ITS保守序列的扩增, 同源序列的对比分析，结合传统鉴定方法，对从土壤中分离筛选的一株丝状真菌进行了分析鉴定，并对鉴定结果和方法进行了比较分析。种内变异还显示在rDNA基因间内转录间隔区I和U （分别为ITS I和ITS H）的片段大小上。ITS 区在核糖DNA中进化较快，可在同一属间甚至群体间发生变化。其中ITS U区在种间变异性较高（22%），种内变异性较低（V 3%）。选择的两对引物均以ITS区的序列为靶目标，其中引物①（ITS1和ITS4）扩增的是ITS I区、5.8SrDNA 和ITS U 区的基因序列，可以鉴别出念珠菌属的3个菌种；引物②（ITS4和ITS86）扩增的是5.8S rDNA和28S rDNA之间的ITS H区的保守顺序，可以鉴别出念珠菌属的7个菌种。因而笔者更推荐采用引物②，它不仅有很强的通用性，能识别更多菌种，而且具有更高的属种特异性。 ns r nsn
菌种保存方法
菌种保存方法 未知 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水 分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 三、器材 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。 2．液体石蜡保藏法 （1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。 （2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。 （3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图Ⅶ-12），使菌种与空气隔绝。
菌种鉴定的几方面特征
菌种鉴定的几方面特征 1、个体形态：镜检细胞形状、大小、排列，革兰氏染色反应，运动性，鞭毛位置、数目，芽孢有无、形状和部位，荚膜，细胞内含物；放线菌和真菌的菌丝结构，孢子丝、孢子囊或孢子穗的形状和结构，孢子的形状、大小、颜色及表面特征等。 2、培养特征：①在固体培养基平板上的菌落和斜面上的菌苔性状（形状、光泽、透明度、颜色、质地等）。 ②在半固体培养基中穿刺接种培养的生长情况。③在液体培养基中混浊程度，液面有无菌膜、菌环，管底有无絮状沉淀，培养液颜色等。3、生理生化特征：生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白的本质和活性直接相关，酶及蛋白质都是基因产物，所以对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。4、血清学试验与噬菌体分型。5、氨基酸顺序和蛋白质分析。 6、核酸的碱基组成【(G+C)%】 7、核酸的分子杂交。 营养缺陷型的应用 从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株，称为野生型菌株。野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长，称为营养缺陷型。营养缺陷型菌株的筛选，在生产实践和基础理论中都有着重要的意义。生产实践中，营养缺陷型可用于工业微生物育种，协助解除代谢反馈调控机制，从而达到大量积累终产物的目的；也可将营养缺陷型菌株作为生产菌种杂交、重组育种时的遗传标记。在基础理论中，营养缺陷型不仅被广泛应用于阐明微生物代谢途径上，而且在遗传学上具有特殊的地位。在遗传规律中的转化、转导、原生质体融合、质粒和转座因子等的研究中，营养缺陷型是最常用的标记菌种。代谢调控的类型 1、初级代谢的调节控制：虽然代谢调节方式很多，由于微生物细胞体内的所有生化反应都是在酶的催化下进行的，因此，对酶的调节控制是最主要、最有效的调控方式。它包括两个方面，一是调节酶的合成量（反馈阻遏），二是调节现成酶分子的催化活力（反馈抑制）。两者密切配合和协调，以达到最佳的调节效果。①酶合成的调节：酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速度的调节机制，这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）的代谢调节。凡能促进酶生物合成的调节，称为诱导，而能阻碍酶生物合成的调节，则称为阻遏。 ②酶活性的调节：酶活性调节是以酶分子的结构为基础的，在酶分子水平上的一种代谢调节。它是通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率，包括酶活性的激活和抑制两个方面。2、次级代谢的调节控制：①次级代谢产物的诱导调节②次级代谢产物碳源分解调节③次级代谢产物氮源分解调节④次级代谢反馈调节⑤磷酸盐调节⑥细胞膜透性的调节原生质体的制备方法 制备大量具有活性的原生质体是微生物原生质体融合育种的前提。为制备原生质体，必须有效地除去细胞壁。去壁的方法有三种：⑴机械法⑵非酶分离法⑶酶法。采用前两种方法制备的原生质体效果差，活性低。酶法分离原生质体的方法：首先选择原始亲株，经过遗传标记筛选，得到直接亲本，采用培养皿平板玻璃纸或摇瓶振荡法培养，取年轻的菌体转入到高渗溶液中，加入有关水解酶，在一定条件下（温度、pH值等）酶解细胞壁。酶解后释放的原生质体和残存菌丝片断的混合液经过滤，除去大部分菌丝碎片。滤液进一步低速离心10min，洗涤后弃去上清液，沉淀悬浮于同一种高渗溶液中，即可得到纯化的原生质体。 融合体的鉴定 融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体的方法有多种，在育种工作中可根据实验目的和微生物不同加以选择，下面是在原生质体融合育种中经常采用的。⑴利用营养缺陷型标记选择融合体，其检出设计的原则是在分离的培养基上只有融合体生长而不能让双亲本原生质体形成菌落。融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，原生质体融合处理后的混合物直接分离到基本培养基上就可检出融合体。⑵利用抗药性选择融合体，微生物的抗药性是菌种的重要特性，是由遗传物质决定的。不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异，利用这种特性也可用于融合体筛选。 ⑶利用荧光染色法选择融合体，荧光染色法是事先使双亲染色体而携带不同荧光色素标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑取同时带有双亲原生质体荧光标记的融合体，直接分离到再生培养基上再生，最后得到融合体。⑷钝化选择法，用灭活原生质体和具活性原生质体融合（营养缺陷型），由于灭活亲株原生质体和营养缺陷型亲株原生质体在基本培养基上都不能生长，只有融合体才能形成菌落。 菌种选育的方法和特点 1、诱变育种：微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥这个变株最佳培养基和培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。基因突变是微生物变异的主要源泉。人工诱变又是加速基因突变的重要手段。以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、收效大、方法简单等优点，它是菌种选育的一个重要途径。 2、杂交育种：微生物杂交的本质是基因重组，优点：第一，通过具有不同遗传性状菌株的杂交，使遗传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种。第二，通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体，不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳” 效应。第三，通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促 进遗传学理论的发展。3、基因工程育种：与传统育种方法不同的是， 基因工程育种不但可以完全突破物种间的障碍，实现真正意义上的远缘 杂交。而且这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还可实现动物、 植物、微生物之间的杂交。广义的基因工程育种包括所有利用DNA重 组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某些优良性状 或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。由于微生物是单细胞，且 结构简单，是基因工程理想的表达载体。所以许许多多来自于不同界的 物种（人体、动物、植物、微生物等）的基因都被成功地克隆到微生物 细胞中并获得表达。 诱变育种的方法和优缺点 诱变育种具有方法简单、投资少、收获大等优点，但它最大缺点是缺乏 定向性。在诱变育种过程中应注意出发菌株、诱变剂及诱变剂量的选择、 诱变处理方式方法的应用，以及结合有效的筛选方法等来弥补不足，以 提高诱变育种的效率。诱变育种的步骤和方法包括：出发菌株的选择， 单孢子（或单细胞）菌悬液的制备，诱变剂及诱变剂量的选择，诱变的 处理方法，以及纯化分离等。1.出发菌株要求：⑴对诱变因素敏感的菌 株；⑵选择具备一定生产能力，并且在生产过程中经过自然选育的菌株； ⑶采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早 而多的菌株；⑷选择纯种作出发菌株；⑸选择出发菌株应考虑其稳定性； ⑹选择出发菌株的其他因素；2.出发菌株的纯化：确定诱变出发菌株之 后，就要进行纯化，通过菌种纯化分离，从单菌落中挑选所需要的优良 菌株，与具有其他性状的菌株分离开来，从中获得遗传性状基本一致的， 并且稳定的变种。纯种分离方法，常用划线分离法和稀释分离法。 3. 单孢子（或单细胞）悬液的制备：在诱变育种中，所处理的细胞必须 是单细胞、均匀的悬液状态。这是因为，一方面分散状态的细胞可以均 匀地接触诱变剂，另一方面又可避免长出不纯菌落。4.诱变剂及诱变剂 量：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理 因子或化学物质，称为诱变剂。它们包括物理诱变剂、化学诱变剂和生 物诱变剂三大类。诱变的最适剂量，应该使所希望得到的突变株在存活 群体中占有最大的比例，这样可以减少以后的筛选工作量。5.诱变的处 理方法：⑴单因子处理⑵复合因子处理①两个以上因子同时处理②不同 诱变剂交替处理③同一种诱变剂连续重复使用④紫外线光复活交替处 理。 反馈阻遏和反馈抑制的原理 反馈阻遏：主要是通过终产物与阻遏蛋白的亲和力的改变，使阻遏蛋 白与操纵基因结合，不能合成mRNA，从而达到对整个反应过程进行调 节的目的。反馈抑制：主要的作用方式在于末端产物对反应途径中调 节酶的抑制。受反馈抑制的调节酶一般都是变构酶，酶活力调控的实质 就是变构酶的变构调节。变构酶分子具有两个和低分子物质结合位点， 一个是与底物结合的催化中心（活性中心），另一个可与调节因子（又 称效应物）相结合的调节中心（变构中心）。当效应物与调节中心结合 后，可引起酶蛋白分子发生构象变化，从而引起酶的活性中心对底物的 亲和力和催化能力的改变，阻碍了酶和它的底物的结合，促进或抑制了 酶活力，使整个代谢途径的快、慢受到调节，称这种现象为变构效应。 抗反馈调节菌株的筛选 抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其 特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产，如果由于结 构基因突变而使变构酶成为不能和代谢终产物相结合的，便是失去了反 馈抑制的突变，称为“抗反馈突变型”，若是由于调节基因突变引起调节 蛋白不能和代谢终产物相结合而失去阻遏作用的，称为“抗阻遏突变 型”。操纵基因突变也能造成抗阻遏作用，产生类似于组成型突变的现 象。其方法是把结构类似物作为筛选的遗传标记。通常是把结构类似物 和培养基混合制成平板，诱变后菌体分离其上，经培养，那些被解除反 馈调节的突变株可以选择性地生长，并在细胞内合成相应的氨基酸。变 株的菌落在生长过程把氨基酸分泌到培养基中，促使菌落周围敏感菌的 生长，形成一个混淆的增殖圈，挑取增殖圈大而明显的菌落，进一步试 验复证。 建库前的菌种的检定（大肠杆菌表达的工程菌菌种） 1、划种LB琼脂平板，应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长， 2、涂片革兰氏染色，在光学显微镜下观察为典型的革兰氏阴性杆菌， 3、对抗生素的抗性，应与原始菌种相符，大多数为抗氨卡青霉素， 4、 电镜检查，应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生 物污染。5、生化反应，应符合大肠杆菌生物学性状，6目的产物表达 量，在摇床中培养应不低于原始菌种的表达量，7、表达产物的类型， 用免疫学或合适方法证明型别无误，8、质粒检查，质粒的酶切图谱应 与原始质粒相符。 微生物细胞的破碎方法 化学法：1、自溶法，细胞膜结构在一定的条件下，由于细胞自体的各 种水解酶如蛋白酶、酯酶等的酶解作用而发生溶解，2、表面活性剂处 理法，常用十二烷基硫酸钠等阴离子表面活性剂，3、脂溶性溶剂处理 法：用丙酮、氯仿、甲苯等溶解细胞的脂蛋白，4、用低渗溶液，如氨 水、稀盐及含有少量有机溶剂的水溶液处理，是细胞膜胀破。物理法： 1机械磨碎法，2、加压破碎法，在55Mpa的高压下，急速喷射撞击挤 压。3超声破碎法，4反复冻融法。生物学的方法主要是采用酶解法 生物产品浓缩和干燥的方法 浓缩：1、减压干燥浓缩法，是通过降低液面的压力使液体沸点降低， 减压的真空度越高，沸点降得越低，蒸发越快。此法适用于一些不耐热 的生物大分子及生物制品的浓缩。2、吸收法，是通过一种吸收剂直接 吸收除去溶液中溶剂分子，是溶液浓缩的方法。使用的吸收剂必须与溶 液不起化学反应，对生物大分子不起吸附租用，易与溶液分开，吸收剂 除去溶剂后能反复使用（常用的是聚乙二醇）3、超滤法，是使用一种 特制的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法。通过超滤 法，蛋白质和酶的稀释液一般可浓缩到10%~50%浓度，回收率高达90%。 应用超滤法关键是在于滤膜的选择。干燥：1，真空干燥，适用于不耐 高温、易氧化的物质的干燥和保存，其原理与减压浓缩相同，真空度越 高，沸点降得越低，蒸发越快。2、冷冻真空干燥，又称为升华干燥， 除利用真空干燥的原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸 汽压力随温度的下降而下降，故在低温低压下，冰很容易升华为气体。 基因工程产品一般需检测的指标 1、鉴别试验， 2、外观，冷冻干燥制品应为白色薄壳疏松体。加入标量 蒸馏水后应迅速溶解为澄明液体，不得含有肉眼可见的不溶物，3、化 学检定4、pH值5、水分，一般冷冻干燥生物制品应不高于3%，6、效 价测定7、无菌试验8、异常毒性试验9、蛋白质含量，一般用Lowry法 测定10、比活性11、纯度，根据要求用电泳法和高效液相色谱法等12、 分子量，一般用还原型SDS—PAGA法13、外源性DNA法残留量，一般 用固相斑点杂交法，以地高辛标记的核酸探针法测定14、IgG残留量15、 宿主蛋白残量，一般用酶联免疫法测定16、残余抗生素活性17、细菌内 毒素含量18、等电点19、紫外光谱扫描20、肽图21、N—末端氨基酸序 列。 菌种衰退的原因，防止措施和保存方法 原因：1、基因突变－－主要原因：有关基因发生负突变导致菌种衰退， 表型延迟造成菌种衰退，质粒脱落导致菌种衰退，2、连续传代－－加 速衰退，3、不适宜的培养和保藏条件－－加速衰退。防止措施：控制 传代次数，菌种经常纯化，创造良好的培养条件，利用不易衰退的细胞 移种传代，采用有效的菌种保藏方法，讲究菌种选育技术。保存方法： 斜面低温保藏法，石蜡油封藏法，砂土管保藏法，麸皮保藏法，甘油悬 液保藏法，冷冻真空干燥保藏法，液氮超低温保藏法，宿主保藏法