外周血造血干细胞不同保存方法的比较

　3收稿日期:2006205209;修回日期:2007206218

作者简介:黄友章(19562),男,副主任技师,主要从事血液学研究。

外周血造血干细胞不同保存方法的比较3

黄友章1,沈建良1,杨平地1,吴南海2,唐湘凤2,宫立众1,岑　坚1,王立新1,王　宁1,郑培浩1

(11海军总医院血液科,21儿科,北京100037)

摘要　目的:为造血干细胞低温保存选择合适的方法。方法:20例外周血单个核细胞加入DMSO 或DMSO 加

HES ,280℃冰箱(简称冰箱)或程控降温,冰箱或液氮保存,定期检测标本的CFU 2GM ,L TC 2IC ,CD34+,TBR ,计回

收率。结果:冰箱降温并保存,5%DMSO 26%HES 为保护剂的CFU 2GM 、L TC 2IC 、CD34+、TBR 回收率分别为:

8212%±1417%、8310%±1212%、9412%±413%、9717%±319%,比10%DMSO 者具体回收率明显高(P <0105);同一种保护剂下:冰箱降温并保存与程序降温冰箱保存比,差异不显著(P >0105),冰箱降温并保存、冰箱降

温液氮保存及程控降温液氮保存,在一年内,各种回收率差异不显著(P >0105),二年时,只有冰箱降温并保存者其各种回收率指标明显下降(P <0105);细胞复温后,标本不稀释也不洗涤,室温下放置,细胞活力的各指标均下降

(P <0105),以含10%DMSO 为保护剂者影响最大。结论:造血干细胞优选保存方法是:保护剂用5%DMSO 26%HES ,保存时间不超过一年时,用冰箱降温并保存,长期保存时,冰箱降温则需液氮保存,细胞复温后,标本内保护

剂应立即稀释(临床应用)或去除。

关键词:　造血干细胞;　外周血;　低温冻存;　二甲基亚砜;　羟乙基淀粉中图分类号:R331.1233

文献标识码:A

文章编号:100026834(2008)012125204

造血干细胞移植在恶性血液病,实体瘤等病人中有肯定价值。为了移植的需要,很多情况(如自体造血干细胞移植,脐血造血干细胞移植等)下,造血干细胞必须较长时间的保存。本实验旨在选择有效、简便而经济的造血干细胞保存方法。

1　材料与方法

111　造血干细胞来源

经造血干细胞动员剂动员,CS30002Plus 血细胞

分离机(Bexter ,美国)分离的外周血细胞(淋巴瘤12例,缓解期急性白血病8例,另文报道)0105L 为造血干细胞,用含20%人血白蛋白(广东佰易药业)的RPM I1640(GIBCO ,美国,下简称保存稀释液)调整有核细胞浓度至(529)×1010cells/L ,4℃预温。112　低温保护剂

有两种,一种是DMSO 保护剂,临用前取二甲基亚砜(DMSO ,美国,Baker )012L ,加入RPM I1640培养液内至1L ,置4℃冰箱待用。另一种是DMSO 2HES 保护剂,临用前取DMSO 011L ,12%羟乙基淀粉(HES ,W/V ,MW ≥20万,日本,极东制药工业株式会社)磷酸盐缓冲液015L ,加入RPM I1640培养液内至1L ,置4℃冰箱待用。113　造血干细胞与低温保护剂的混合

取(529)×1010cells /L 外周血有核细胞,在4℃下,混合方式分为两种,一种是加入等体的DMSO 保护剂(DMSO 终浓度10%,V/V )。另一种是加入

等体积的DMSO 2HES 保护剂(DMSO 终浓度5%、

HES 终浓度6%)。将这两种含保护剂的细胞液分别分装于2ml 的聚丙稀管(NUNC ,丹麦)内,置4℃冰箱30min 。114　低温保存上述含保护剂细胞小管降温方法有三种,一种

是“程控降温液氮保存”[1]

:取标本小管,置程控降温仪(Cryomed1010B ,美国)内,以1℃/min 的降温速率降至-40℃,再以10℃/min 的降温速率降至-80℃,投入液氮内保存(A 组)。第二种是“低温冰箱降温并保存”:取标本小管,置低温冰箱(-80℃,K elvinator ,美国,以下简称冰箱))降温并保存(B 组)。第三种是“低温冰箱降温液氮保存”:采用第二种方法降温与保存24h 后,取出标本,投入液氮内保存(C 组)。115　复温

待检定时,取出上述保存标本,投入40℃水浴,小管内细胞全部融化后,常规操作(TC 组)是立即吸出细胞悬液,以10倍保存稀释液稀释,1800r/min 离心5min ,去上清,细胞内加入保存稀释液,如此重复2次,制备细胞悬液检测;另有一种是在20℃-24℃(室温)下放置15min (T1组)、30mim

(T2组)、60mim(T2组)再吸出细胞,按上述常规操作稀释、离心洗涤细胞3次,制备细胞悬液上检测。116　造血干细胞培养[2]

造血干细胞培养:一种是粒单系造血祖细胞(CFU2GM)培养:皿内含2×105cells/ml待测细胞, 013%琼脂,20%FCS,G2CSF100ng/ml的RP2 M I1640,培养14d后计集落数。另一种是长期培养起始细胞(L TC2IC):取骨髓制备骨髓单个核细胞(BMMC),在IMDM(GIBCO,美国)培养液内加入20%FCS、5×10-7mol/L氢化考的松,1×109 BMMC/L,注入24孔培养板(1ml/well),33℃,5% CO2孵箱内培养,每周半量换液1次,将14d孔底形成良好的基质细胞层,X线15GY照射去除上清液,加入2×105待测细胞、20%FCS、5×10-7mol/ L氢化考的松IMDM培养液,终体积1ml,33℃, 5%CO2孵箱培养,每周半量换液一次,于第4周移去孔内上清,用胰酶消化,加入IMDM血清培养液,充分混匀,不再细胞计数,进行琼脂半固体培养。1 ml/well内含013%琼脂,20%FCS和G2CSF100ng 的IMDM培养液,14d后计数集落为L TC2IC。117　台盼兰拒染(TBR)计数

常规方法TBR计数。

118　CD34+细胞计数

流式细胞仪(Epics XL2AD2517,Beckman Coul2 ter,美国),细胞免疫表型CD34单克隆抗体为PharMingen公司产品(深圳晶美)。

119　计算和统计学处理

造血干细胞和CD34+细胞回收率(%)=冻后值/冻前×100%。

台盼兰拒染回收率(TBR,%)=冻后有核细胞数/冻前有核细胞数×台盼兰拒染率。

结果用均数±标准差(珔x±s)表示,组间差异用t检验。

2　结果

211　外周血细胞冻前CFU2G M、LTC2IC、CD34+及TBR水平

2×105有核细胞冻前CFU2GM,L TC2IC分别是:4815±1816(30-88),6612±2915(33-92); CD34+是212%±111%(016%-310%),TBR是9910%±112%(9810%-100%)。

212　细胞保护剂的比较

细胞分别用5%DMSO-6%HES和10%DMSO为保护剂,冰箱降温并保存48h,复温后, CFU2GM、L TC2IC,CD34+、TBR回收率,前者明显高于后者,二者差异明显(P<0105,表1)。

T ab11　Influence of various cryopreservatives on recovery rates (%,珔x±s,n=20)

Group CFU2GM L TC2IC CD34+TBR 5%DMSO26%

HES

8212±14178310±12129412±4139717±319

10%DMSO7819±111237914±121639318±4169719±313 3P<0105vs5%DMSO26%HES

213　冰箱降温并保存与程控降温液氮保存造血干细胞的比较

细胞用5%DMSO26%HES或10%DMSO为保护剂,冰箱降温并保存与程控降温冰箱保存48h,复温后,CFU2GM、L TC2IC生长均良好,CD34+细胞、TBR计数均高,以5%DMSO26%HES为例,冰箱降温并保存与程控降温冰箱保存比,二者差异不明显(P>0105,表2)。

T ab12　Comparisons of recovery rates between two kinds of cryopreservation systems(%,珔x±s,n=20) Group CFU2GM L TC2IC CD34+TBR

18212±14178310±12129412±4139717±319 28317±10188415±14189415±5129716±318 1:Low temperature refrigerator;2:Autocontrolled programmed cryo2 genic system

214　保存时间的比较

细胞不管是用10%DMSO还是用5%DMSO2 6%HES作保护剂,在一年(360d)内,用同一种保护剂的程控降温液氮保存(A组)或冰箱降温并保存(B组)或超低温冰箱降温液氮保存(C组),三者的造血细胞活力无明显差异,但二年(720d)时,B组造血细胞活力有下降的趋势,B组与A、C组比,差异明显(P<0105),A、C组比,无明显差异,以5% DMSO26%HES为保护剂,保存不同时间的各种细胞活力回收率(表3)。

215　细胞复温后室温放置不同时间的比较

加低温保护剂的细胞低温保存复温后,常规(TC)是立即加稀释液稀释、离心洗涤,若细胞复温后,标本不稀释也不洗涤,在20℃-24℃放置15 min(T1)、30mim(T2)、60mim(T3),则细胞活力明显下降,以10%DMSO为保护剂者对造血细胞活力影响最大(表4)。

T ab13　Recovery rates of different cryopreservation systems by cryopreservation time(%,珔x±s,n=20)

Time Group CFU2GM L TC2IC CD34+TBR A7919±10158012±12129415±3169810±210 180d B7818±10188011±13139411±3179717±319 C7913±11168019±11199418±3199813±212

A7817±11127917±11149412±4129719±312 360d B7618±15127712±14169410±3197415±413 C7814±11158013±12109413±3159711±311

A7815±8197914±12109410±3199717±313 720d B7116±191037219±171739318±4109213±5103 C7811±10117916±11109411±3179712±312

3P<0105vs A and B

T ab14　E ffects of cryopreservatives on recovery rates by time after being thawed(%,珔x±s,n=20)

Group　CFU2G M L TC2IC CD34+TBR TC8212±14178310±12129412±4139717±319 5%DMSO T17214±131537119±151539311±41138619±11193 26%HES T26913±191636716±211239119±51638016±16153 T35617±211935514±221238812±61788013±18193

TC7818±12137915±13199318±4199716±317

T16815±20123#7013±17163#9217±5103#8114±10123# 10%DMSO T24515±23133#4617±24123#9013±5153#6013±18153# T33014±23153#3214±26193#8710±8163#4218±20123#

3P<0101vs TC;#P<0101vs5%DMSO26%HES

3　讨论

造血细胞的保存始于上世纪70年代末80年代初。短期保存是在4℃下进行,在这种温度下,离体细胞仍然保持着新陈代谢,通常只能保存48h～72 h,而深低温(-80℃～-196℃)时,细胞内新陈代谢减慢乃至停止,则可以较长时间保存。深低温保存时,细胞经过降温和复温过程,其内外环境会发生一系列改变,造成冷冻损伤,加入保护剂和改变降温速率可减轻这种损伤,使细胞复温后维持初始形状和生理功能。保护剂一般分为高分子的非穿透性保护剂(如HES,白蛋白等)和低分子的穿透性保护剂(如DMSO,甘油等)。由于造血细胞为核细胞,在进入液氮内温度前,除加入保护剂(如10%DMSO)外,还需特殊的程控降温仪以1℃/min-2℃/min 降温速率降温至-60℃或-80℃(释放热期需超速降温)[1],它操作费时,成本大,特别是对小样本的保存很不经济,限制了它的使用,因此,我们开展了-80℃冰箱降温并保存骨髓[2,3],首次用5%DM2 SO26%HES为细胞保护剂者见于Stiff1PJ等[4]保存骨髓造血干细胞,近十几年来,国内外学者进行了大量相关研究[5],取得了良好成绩。

本研究提示:从保护剂的角度看,5%DMSO2 6%HES优于10%DMSO,这一效果在用冰箱降温并保存中更能得到充分体现,可能与DMSO对细胞的毒性有一定关系,低浓度的DMSO对细胞损伤降低。从降温和保存的角度看,程控降温液氮保存、冰箱降温液氮保存和冰箱降温并保存,在一年内造血细胞保存效果均良好,但细胞如需长期保存,选用冰箱降温则要液氮保存,推测细胞置入280℃冰箱降温能达到慢速降温效果,但细胞在这种温度下可能仍保持一定程度的新陈代谢。细胞复温后,细胞内保护剂应立即稀释或去除,如果细胞是给患者治疗用,含保护剂的细胞尽量在半小时内输入体内,本研究20例患者的外周血干细胞在一年内均已进行了移植,输注安全,全部重建造血,另有报道。上述结果还提示:CD34+细胞指标并不能完全代表造血干细胞活力,细胞表面虽有CD34+表达,但细胞可能已经没有了造血活力。

值得强调的是,骨髓、外周血、脐带血等造血细胞移植越来越普及,对其应用何种保护剂、如何降温、保存、复温等,报道不一。根据保存效果好、省时、省力、经济、方便的原则,在保存造血细胞时,我们推荐使用5%DMSO26%HES为保护剂,-80℃冰箱降温24h后,液氮液态或气态保存。

4　参考文献

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COMPARISON OF DIFFERENT CR YOPRESERVATION

SYSTEMS FOR PERIPHERAL B LOOD STEM CE LLS HUAN G Y ou2zhang1,SHEN Jian2liang1,YAN G Ping2di1,WU Nan2hai2,TAN G Xiang2feng2,

G ON G Li2zhong1,CEN Jian1,WAN G Li2xin1,WAN G Ning,ZHEN G Pei2hao1

(11Department of Hematology,2.Department of Children,Navy G eneral Hospital of PLA,Beijing100037,China)

ABSTRACT

Aim:To explore proper cryopreservative systems for hematopoietic stem cells1Methods:Peripheral blood mononuclear cells from 20persons were mixed with different cryopreservative agent,dimethyl suflfoxide(DMSO)or combination of DMSO and hydroxyethyl starch(HES),then cooled in280℃low temperature refrigerator(Refr)or autocontrolled programmed cryogenic system(PCS),pre2 served in Refr or in liquid nitrogen1GM2CFU,L TC2IC,CD34+cells and typeran blue resistance(TBR)were assayed after differ2 ent period of cryopreservation1R esults:The recovery rates of CFU2GM,L TC2IC,CD34+cells and TBR in peripheral blood mononu2 clear cells which were cooled and preserved in Refr with5%DMSO26%HES were8212%±1417%,8310%±1212%,9412%±413%and9717%±319%res pectively,significantly higher than that in Refr with10%DMSO(P<0105)1When cells were cryop2 reservated with the same cryopreservatives,there was no significantly difference of recovery rate in group of Refr and group of Refr with PCS1Meanwhile,there was not significantly difference of recovery rate among all three groups,preserved in Refr ahead of liquid nitrogen,in Refr merely,in liquid nitrogen with PCS within one year(p>0105)1However,the recovery rate of CFU2GM,L TC2 IC,CD34+cells and TBR decreased dramatically if cells were cooled and preserved in Refr for two years1After cells were thawed, the cell activity declined gradually at room temperature if the cryopreservatives were not removed or diluted1The cell activity of10% DMSO group was affected more than that of5%DMSO26%HES group1Conclusion:5%DMSO26%HES is better than10%DMSO as cryopreservatives for hematopoietic stem cells1Refr cryopreservation is a simple and effective method if cells would be cryopreserved for less than one year1If cells would be cryopreserved for more than one year,liquid nitrogen cryopreservation should be recommend2 ed1The cryopreservatives should be diluted or removed immediately after cells were thawed1

KE Y WOR DS:　hematopoietic stem cells;　peripheral blood;　cryopreservation;　dimethyl suflfoxide;　hydroxyethyl starch

(上接第29页)

响小于阿托品的主要原因。A组虽然在注药后3min内TP、L F、L F/HF不同程度地升高,但随后TP、L F、HF迅速下降,将对心肌的自身调节产生不利影响;B组注药后1min 时L F、L F/HF升高,但没有出现随后的下降;B组注药后TP 无明显变化。长托宁使以上指标维持在较稳定的水平。HF、uHF下降后短时间即恢复至注药前水平,提示长托宁与M2受体结合的短暂性。两组间TP、L F、HF的比较,也提示长托宁较阿托品对M2受体亲和力小。L F/HF的组间比较也显示,长托宁组的交感、副交感平衡性优于阿托品组。Challapalli等[3]还通过与硝普钠的去迷走效应比较,指出迷走张力下降与阿托品拮抗心脏M2受体对HRV的影响有本质的差异。所以,长托宁的意义不仅在于对HR的影响较阿托品小,更主要是维持HRV的稳定性在老年患者术前用药选择中具有优势。

老年人大都有不同程度的心肌弹性降低,心脏收缩力减退,心瓣膜纤维组织增生,冠状动脉硬化等改变,导致循环功能不全[4];高血压、冠心病发生率的增高,限制了术前用药的范围。作为一种新型选择性抗胆碱药,长托宁对中枢和外周均有较强的抗胆碱作用而心血管作用不明显,且对心脏自主神经功能的影响较弱,在老年病人术前用药的选择中,具有

一定的优势。

4　参考文献

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　3收稿日期:2005212206;修回日期:2007207209

作者简介:王开伟(19752),男,从事临床药理学研究。

自体外周血造血干细胞移植的护理

自体外周血造血干细胞移植的护理 ［关健词］造血干细胞移植层流病房护理 ［目的］：造血干细胞移植期间如何将消毒隔离、预防感染和出血、心理护理贯穿整个护理过程中。方法：通过总结我科自2006年10月～2009年7月在我科行自体外周血造血干细胞移植共25人的护理过程。结果：25例行自体外周血造血干细胞移植病人成功出院。结论：造血干细胞移植过程中将消毒隔离、预防感染和出血、心理护理贯穿整个护理过程中至关重要。造血干细胞移植的成功护理工作有着不可抹灭的作用。 外周血造血干细胞移植,因其采集方法简便,移植后造血重建快,痛苦相对较少,易于被患者个人或供者接受,而广泛应用于临床治疗[1]。病人在入层流病房后，我们紧紧围绕加强消毒隔离、预防感染和出血、心理护理来护理病人。在护理自体干细胞移植病人中取的较满意的效果。现总结如下: 1、临床资料： 2006年10月～2009年7月在我科行自体外周血造血干细胞移植共25例。其中男性12例，女13例。其中淋巴瘤17例（霍奇金淋巴瘤2例、非霍奇金淋巴瘤15例）；急性白血病4例(M5型2例、M2型1例、M1型1例)；多发性骨髓瘤4例。 2、护理方法 2、1．五官及全身皮肤的护理 口腔粘膜、牙龈、眼结膜、鼻腔、肛周是造血干细胞移植过程中最

易发生感染的部位，做好口腔、眼睛、鼻腔、肛周的护理至关重要。具体做法：①1.口腔，每日用1：4朵贝氏液及4％碳酸氢钠液交替餐前、餐后漱口,之后以每3 h含漱1次,每次含漱时间为5 min左右,特别注意在两颊部和咽部要充分接触。口腔护理2次/日。②.眼睛、耳、鼻腔，每日用氯霉素和0.1%利福平眼药水交替点眼4次/日，75%乙醇擦外耳道4次/日,用1∶2000洗必泰液擦鼻腔4次/日。③. 会阴、肛周每天及每次便后用1∶2 000洗必泰溶液坐浴,并用红霉素软膏涂抹肛周。会阴抹洗2次/日。④.每日用1∶2 000洗必泰擦浴,饭前和便后用1∶1000洗必泰液毛巾擦手。护理过程中注意口腔粘膜、眼结膜、鼻腔、肛周有无异常。注意全身皮肤有无瘀点、瘀斑。有无血尿、黑便等。 2、2锁骨下静脉置管的护理 注意预防锁骨下静脉导管感染、防止空气栓塞、脱管、管腔堵塞。每日观察导管口有无渗血、渗液；在静脉置管处皮肤直径5 cm～10 cm 每日安尔碘消毒，每日更换无菌敷料及肝素锁。注意输液器与导管衔接紧密,液体不能输空,每日检查导管有无裂痕；各种治疗护理避免牵拉导管,静脉插管时导管插入深度作明确标记,并记录其长度数据。导管与皮肤的缝线要牢固,每日交接留置导管的情况；病人化疗反应恶心呕吐频繁时,特别注意局部固定[2]，导管外脱禁止送回。输入血制品及采集血标本后,立即用理盐水彻底冲洗导管。全天输液结束后用1∶1 000的肝素钠稀释液2～3ml封管。 2、3胃肠道的护理 患者的饭菜、饮料等必须新鲜,每日无菌饮食(食物需经微波炉消毒后方可食用,餐具每次也同时消毒)。进食高营养易消化食物。水果须先用清水洗过后,再用1∶2000洗必泰液浸泡30分,温开水冲洗后用无菌刀削皮食用；口服药片两面经紫外线各照射30min后供患者服用；进食不易

外周血干细胞采集技术及护理

外周血干细胞采集技术及护理 (一) 采集术前准备及护理 (1) 向供者做必要的解释使之有心理准备；要求供者注意营养摄入，应用高蛋白、 高热量、高维生素饮食，于采集前晚和当日晨改用低脂餐；沐浴清洁皮肤并 更衣，上衣袖应宽松。 (2)应用重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)可以有效地达到骨髓或外周血造血干细 胞的扩增。注意观察应用G-CSF的副作用，常见有低热(一般38C 以下)骨骼 肌肉疼痛、乏力、食欲不振、头痛等，轻者不必做处理，严重的给予对症治 疗。 (二)技术配合及护理 ( 1 ) 外周血干细胞采集技术可根据供者的情况在床边进行。 ( 2 ) 主要设备为血液成分分离机、专用导管，另备抗凝剂、生理盐水、血压计、听诊器、急救器材和药品。治疗盘内盛皮肤消毒物品、无菌棉球和纱布、止血带、胶布。 ( 3 ) 供者清洁静脉穿刺部位皮肤，排空二便，通常采用平卧，测量血压、脉搏及呼吸。 ( 4 ) 选择两处静脉穿刺部位(分别为采血和回输血通道)以肘部粗而直的大静脉最适宜。下肢静脉、颈静脉亦可作为回输通道。 ( 5 ) 经皮肤消毒，用16 号穿刺针头依次进行两处静脉穿刺，首先穿刺的一侧连接回输导管，次之连接采血导管。妥善固定针头，局部覆盖无菌纱布。 ( 6 ) 医生操纵血液成分分离机，将供者身高、体重、红细胞比积等数据输入机器电脑，自动调节采集分离血液成分的速度，匀速加入抗凝剂。 ( 7) 供者采血侧上臂间断使用止血带或血压计袖带打气加压，同时手握海绵芯子，反复一松一紧直到采集完毕。 ( 8 ) 遵医嘱补钙。

（ 9 ）随时观察血压、脉搏、呼吸及其有无不适感，注意不良反应和合并并发症。 （10）采集完毕，静脉穿刺局部以无菌棉球按压5min 以上，用无菌纱布保护。供者静卧，继续观察。 （11）外周血干细胞一次采集量一般200?300ml，由检验人员进行细胞计数 （12）采集后嘱患者多饮水，以促进抗凝剂代谢。 【不良反应与并发症及其处理原则】 （一）空气栓塞其原因为采血管连接不严密或回输管空气未完全排除。无论是怀疑还是确定空气进入静脉，应立即压迫穿刺静脉的近心端，拔除针头扎紧止血带，使该静脉的血液回流完全阻断，取左侧卧头低足高位并给予氧气吸入。 （二）感觉异常和肌肉痉挛其原因为枸橼酸钠抗凝剂的应用，降低了血清钙离子 水平。立即减慢回输速度，口服钙剂或静脉补充钙剂。 （三）头晕、恶心及不适其原因为过度紧张、饥饿、低血糖、低血压、过饱、疲 劳过度、睡眠不足、体质虚弱或采血过快。减慢采血速度，去枕平卧；给予解释消除其顾虑及紧张心理；针刺内关、合谷、涌泉穴，前额冷敷等。 （四）血肿其原因为静脉穿刺穿透血管壁，血溢出于皮下，或拔针后局部针眼处压迫力度不够，压迫面积太小，按压时间太短，或拔针后才松解止血带，或袖口太紧，以致静脉穿刺处血外溢于皮下。终止采集技术操作，先松止血带放松袖口。 针眼处用无菌棉球。多个手指，大面积压紧血肿局部10min 以上。将有血肿的手臂举高至心脏水平以上，促使血液回流、吸收及消散，并可局部做冷敷。 （五）局部感染其原因为静脉穿刺局部皮肤洗涤和消毒不严，采集技术中无菌技术操作规程执行不力或针头污染或采集后针眼处未保护好。局部红、肿、热、痛，感染初期可做热敷或用金黄散湿敷；局部感染破溃者定时换药；按医嘱应用抗生

骨髓间充质干细胞移植治疗心血管疾病的临床研究新进展

骨髓间充质干细胞移植治疗心血管疾病的临床研究新进展 自2001年骨髓干细胞被首次用于治疗心肌梗死以来，干细胞移植治疗心血管疾病的临床研究已历经了10余年。近年来，BMSC因其可塑性、遗传稳定性和免疫耐受性而成为用于心肌修复较为理想的细胞。本文主要对BMSC移植治疗心血管疾病的临床研究的现状和进展加以综述。 1 BMSC的特点 BMSC位于骨髓的基质，占骨髓有核干细胞的0.001%～0.01%，能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及心肌细胞等。BMSC的标志物主要为CD29和CD44，研究表明，BMSC具有可塑性、遗传稳定性和免疫耐受性，成为心肌修复的理想细胞。 2间充质干细胞的预处理 移植后细胞成活率较低是影响干细胞移植疗效的主要因素。移植后约90%的干细胞发生细胞凋亡。而细胞移植前的预处理可有效保护细胞，提高其抗缺血和缺氧的能力，提高移植后细胞存活率。 预处理主要有以下几种方法。首先，缺血缺氧预处理。此举可激活SDF-1a/CXCR4轴。基质细胞衍生因子-1（SDF-1）不仅是一种重要的趋化因子，而且具有抑制间充质干细胞的凋亡、增加间充质干细胞的存活率及增殖活性等作用。其次，SDF-1预处理。Liu[1]等通过免疫印迹和PCR技术证实，SDF-1预处理激活了Akt和Erk促生存信号通路，且上调了Bcl-2/Bax的比值。 3 BMSC在心血管疾病治疗中的应用 3.1 BMSC移植疗法的适应症目前主要有以下3种适应症，即：急性心肌梗死，慢性缺血性心力衰竭，扩张型心肌病。 3.1.1急性心肌梗死众多实验研究证明，间充质干细胞移植在减少梗死面积、保藏收缩功能以及缓解左心室重构方面均起到有利作用。而生物材料可作为干细胞的支架，也可用作移植干细胞临时的黏附基质。CUI等[2]将自聚肽纳米纤维支架用于承载骨髓源性心肌干细胞移植，结果表明此法有利于移植细胞在受损心肌内的存活和向功能性心肌的分化，并促进心功能恢复，其疗效优于单纯干细胞移植。 3.1.2缺血性心肌病有关研究表明，治疗的最佳时间为心肌梗死发病后1个月。然而，最佳治疗时间的确定仍需进一步的临床证据。 3.1.3扩张型心肌病先前的临床前研究证实，干细胞移植疗法在动物的特发性扩张型心肌病模型中有显著的作用。临床上应用干细胞移植疗法治疗重度扩张

第二十章 造血干细胞移植

第二十章造血干细胞移植 造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantion,HSCT)是指对患者进行全身照射、化疗和免疫抑制预处理后，将正常供体或自体的造血细胞(hematopoieti cell,HC)经血管输注给患者，使之重建正常的造血和免疫功能。HC包括造血干细胞(h omatopoietic stem cell,HSC)和祖细胞(progenitor)。HSC具有增殖、分化为各系成熟血细胞的功能和自我更新能力，维持终身持续造血。HC表达CD34抗原。 经过40余年的不断发展，HSCT已成为临床重要的有效治疗方法，每年全世界移植病例数都在增加，移植患者无病生存最长的已超过30年。1 990年，美国E.D.ThomaS医生因在骨髓移植方面的卓越贡献而获诺贝尔医学奖。 [造血干细胞移植的分类] 按HC取自健康供体还是患者本身，HSCT被分为异体HSCT和自体HSCT。异体HSCT又分为异基因移植和同基因移植。后者指遗传基因完全相同的同卵孪生间的移植，供受者间不存在移植物被排斥和移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)等免疫学问题，此种移植几率仅约占1%。按HSC取自骨髓、外周血或脐带血，又分别分为骨髓移植(bone marrow transplantation,BMT)、外周血干细胞移植(peripheral blood stem cell transplantation,PBSCT)和脐血移植(cord blood transplantation,CBT)。按供受者有无血缘关系而分为血缘移植(related transplantation)和无血缘移植(unrelat ed donor transplantation,UDT)。按人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)配型相合的程度，分为HLA

自体造血干细胞移植(专业知识值得参考借鉴)

本文极具参考价值，如若有用请打赏支持我们！不胜感激！ 自体造血干细胞移植(专业知识值得参考借鉴) 一概述造血干细胞移植是取患者自身骨髓、异体骨髓或脐血转输给患者，通过移植物中的多能干细胞在体内定居、增殖、分化，使患者机体恢复造血功能、形成免疫力的一种治疗方法。自体造血干细胞移植指移植物供者为患者本人。 二适应证1.肿瘤性疾病 找不到合适供者的患者可藉此方法杀灭肿瘤细胞，延续生命。此类肿瘤有：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性白血病、多发性骨髓瘤、乳腺癌、神经母细胞瘤、睾丸癌、卵巢癌、脑瘤等。 2.自身免疫疾病 使病情易于控制，症状改善的疾病：多发性硬化、系统性硬皮病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜、纯红再障等。 三禁忌证年龄＞65岁；心、肺、肝、肾功能不全；不可控制的感染；患其他致命危险疾病者；不能耐受预处理方案；无独立生活能力的精神病患者；无移植适应证者。 四自体造血干细胞移植的步骤1.自体骨髓采集 即应选择白血病已完全缓解，且再经3～4个疗程巩固治疗后，以保证患者骨髓内白血病细胞降至最低负荷，避免移植后白血病复发。抽取的骨髓所含有粒细胞数有严格的要求：①置4℃冰箱保存，72小时内回输，有核细胞数应达到（1～1.5）×108/kg（患者每公斤体重所要求的数量）；②如先冷冻保存，择期再回输，则有核细胞数应达到2×108/kg；③如先进行体外净化，则有核细胞数则应达到3×108/kg。采集骨髓通常是十分安全的，国外3万余例取髓发生严重并发症者仅占0.27%，且大多与麻醉有关，均能恢复，无致死、致残的报告。 2.外周血干细胞采集 近10余年90%的自体移植已从采集骨髓转移至采集外周血中的造血干细胞，因为外周血采集过程安全、简便、减少患者多部位骨髓穿刺的痛苦，也省去了麻醉，避免了麻醉的风险。同时外周血白血病细胞含量远少于骨髓，回输后造血恢复相对较快。但外周血所含造血干细胞仅为骨髓的1%～10%，因此，采集前必须经有效的动员。 （1）外周血干细胞动员大多采用大剂量化疗，继之以粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员的方案。急性白血病使用较多的化疗为中剂量阿糖胞苷（总量为每平方米体表面积3～4克）或大剂量依托

骨髓干细胞移植治疗股骨头坏死疗效分析

骨髓干细胞移植治疗股骨头坏死疗效分析 摘要目的研究对股骨头坏死采用骨髓干细胞移植方法治疗的效果。方法20例股骨头坏死患者，在接受治疗过程中，干细胞动员之后，骨科与血液内科合作对患者进行刮除死骨、植骨和骨髓干细胞移植。所有的股骨头坏死患者经过手术治疗后，均对病理诊断给予证实。结果20例患者经过手术治疗后出院，6个月后，对于股骨头坏死部位进行数字化减影血管造影术复查，发现在股骨头坏死区域的血管有所延伸，股骨头侧支的吻合度提升。所有患者治疗优良率为70.00%。结论对股骨头坏死采用骨髓干细胞移植方法治疗，不仅能够使关节功能在一定程度上得以恢复，而且对股骨头坏死区域的血液供应情况有所改善，是安全、有效的治疗方法。 关键词股骨头坏死；骨髓干细胞移植；创伤性 1 资料与方法 1. 1 一般资料对本院2013年12月～2014年12月20例股骨头坏死患者的临床资料进行回顾性分析。20例患者中，男14例，女6例，年龄22～43岁，平均年龄（31.0±3.2）岁。按照股骨头坏死的Ficat分期[1]，其中双侧股骨头坏死7例，单侧股骨头坏死13例，由于酒精中毒而导致的股骨头坏死8例，由于激素类药物所导致的股骨头坏死12例。股骨头坏死患者临床表现为单侧髋关节疼痛，特别是股骨头关节活动的时候，由于疼痛严重而使得活动受到限制。所有接受研究的股骨头坏死患者都接受过物理疗法、中医治疗和各种药物治疗，均没有获得良好的治疗效果，没有使髋关节的疼痛缓解。 1. 2 方法患者在接受手术的前1 d晚皮下注射300 μg的吉粒芬，进行骨髓干细胞总动员。对骨髓干细胞的采集，在手术前2 h，要对干细胞进行采集、分离和鉴定，采用含有2 ml的肝素钠注射器在髋骨的上棘处抽取20 ml的骨髓。在无菌操作下采集骨髓干细胞，并实施分离术，从髂后上嵴处抽取250～350 ml 的骨髓血，经过对骨髓血的沉淀和离心处理，之后制备成为干细胞悬浊液25 ml。关于干细胞的鉴定，将采集到的骨髓干细胞稀释之后，经过分离，采用流式细胞法进行鉴定，以将CD33、CD34、CD90和CD34检测出来。 股骨头坏死患者的治疗，当股骨头患处的病变被确认后，进行药物灌注。所使用的药物为50 ml干细胞混悬液，35～40 ml的灯盏细辛，25 ml银杏叶注射液，30 min注射完毕。药物注射的过程中还要注意观察患者的反应，如果患者患处有烧灼的感觉，将药物灌注的速度放缓。手术结束后，静脉滴注抗生素，口服复方丹参片3 d。如果患者治疗效果不良而需要重复治疗，要间隔1个月后进行治疗。 术后护理，手术结束后，患者平卧6 h，对患者体温、脉搏、呼吸以及血压等变化情况进行分析。常规采用抗生素以预防感染。手术3 d后，使用运动仪进行被动功能锻炼，3周后患者可拄拐下床活动。在出院3、6、12个月时接

外周血造血干细胞动员及采集术常规程序

中国医学科学院血液病医院 第 页 1 外周血造血干细胞动员及采集术常规程序 1．移植前供者检查常规 2．详问病史（女性供者询问孕产史），如有动脉粥样硬化、静脉血栓、自身免 疫病史者慎用G-CSF ，防止疾病加重，如必须应用，需仔细观察病情变化。脑血管疾病是动员的禁忌征。 3．PBSC 采集时机应于疾病早期，骨髓尚未损伤前；反复接受化疗者，尤其 用过烷化剂者动员效果差。 4．采集外周血干细胞的会诊单必须提前一周（开始用G-CSF 动员时）送血库， 细胞治疗室。 5．用G-CSF 动员前外周血查CD34,淋巴细胞亚群，细胞因子。 6．请护士长提前查看手术者血管情况，预计血管穿刺不良者，请会诊行股静 脉插管。 7．患者PBSC 动员方案：化疗＋G-CSF 5ug/kg/d(一般为300ug,IH,qd,停化疗后 第８天开始)最佳采集时机为WBC>5×109/l,CD34+>1%. 8．供者PBSC 动员方案：G-CSF10ug/kg/d,分两次用（一般为300ug,IH,Bid,-4 天开始），在用药第５～６天采集，不应早于第３天或晚于第７天 9．用G-CSF 后勤查血常规，尤其是WBC>1.0×109/l,后每日查血常规，及时追 查结果，当WBC>5.0×109/l 时开始采集。 10． 供者plt<70×109/l,不得采集干细胞。 11． 供者WBC>70×109/l,G-CSF 应减量。 12． 采集当日6am 查血常规及分类，G-CSF 注射时间以6-7am 为宜，G-CSF 应用３小时后CD34+细胞峰值上升，故应于G-CSF 应用３小时后采集 PBSC. 13． 采集当日查CD34、淋巴细胞亚群、细胞因子；单采物查CD34、淋巴 细胞亚群（自身动员者查干细胞培养）（如采集两天则两次单采物均行上述检查）。 14． 采集前准备糖水饮用，采集当日不得进食油性食物，准备钙片一瓶／ 葡萄糖酸钙８支，采集前口服４支，备用４支，另葡萄糖溶液及生理盐水备用。 15． 采集过程中应有医师在场，可能出现口唇、四肢麻木（枸橼酸中毒、 低钙血症），恶心、呕吐、眩晕（紧张或一过性血循环量减少所致）。 16． 采集量：Allo-PBSCT 需MNC 5～8×108/kg ，CD34+ 2～5×106/kg ， CFU-GM 2～5×104/k g, Auto-PBSCT 需MNC 2～3×108/kg,CD34+>2×106/kg. 17. 如第一天采集量不够，第２天需重复采集，G-CSF 第一天晚上和第二天６ 点应继续应用，用量视采集量而定。 18. 采集结束后每２－３天复查血象直至正常。

造血干细胞在外周血干细胞移植中检测的意义和方法 综述 陈明铸

造血干细胞在外周血干细胞移植中检测的意义和方法（综述） 造血干/祖细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)从20世纪40年末发展至今作为一种可以治疗造血系统的多种疾病的治疗方法，已经被广泛在临床上使用。其中外周血干细胞移植（PBSCT）在80年代被应用于临床后大有替代骨髓移植的倾向。外周血干细胞移植（PBSC transplantation, PBSCT）的优势包括：（1）造血功能的快速恢复；（2）减少肿瘤细胞污染；（3）降低病人费用；（4）增加移植物中T细胞和NK细胞数量，产生移植物抗白血病效应(GvL),降低移植后复发；（5）避免麻醉和手术等。[1] 同时PBSC的产物更适于体外调控，如CD34+细胞的筛选、肿瘤细胞的清除和基因移植。PBSCT在近年来得到了迅速的发展。在国外已经成为血液病及部分实体肿瘤患者大剂量放射治疗或化学药物治疗后重建骨髓造血的常规治疗措施。 然而，在进行PBSCT时需要采用不同的动员方案，以将骨髓（BM）内造血干内造血干/ 祖细胞动员到外周血( PB) , 因为外周血采集物中造血干/ 祖细胞( PBSC) 的数量对移植的成功有着直接的影响。所以PBSCT的关键因素为确定移植所需PBSC的小量及采集PBSC的最佳时机。目前主要有4 种检测PBSC的方法: ①早期使用的集落培养法, 其检测粒- 巨噬细胞集落形成单位(CFU- GM ) , 但无法定量计数PBSC , 并因方法的复杂性和不规范性, 致使CFU- GM结果差异较大, 只适用于标本的回顾性分析。②全自动血细胞计数仪检测幼稚细胞( I M I+细胞) 、造血祖细胞( HPC) , 该方法经济、快捷、简便,但特异性较差,存在幼稚细胞干扰。因此,无法用于指导自体外周血干细胞移植。③FCM定量检测CD34+细胞。CD34是与HPC有关的膜表面分子,表达于不同分化阶段的HPC 表面, 其性质为含磷的糖蛋白。CD34+细胞实际上包括所有的HPC , 如CFU- GM , 红细胞暴发形成单位( CFU -E) , 巨核细胞集落形成单位( CFU- Mk) , 混合细胞集落形成单位( CFU - Mix) 和原始细胞集落形成单位( CFU- Blast ) 。利用CD34 抗体, 结合FCM 检测CD34+细胞, 快速、灵敏、特异, 已广泛应用, 并成为分析HPC 的推荐参考方法。④分子生物学方法分析CD34m RNA , 其特异、敏感、快速、准确,但实验条件、技术要求较高,目前临床开展较为困难。[2] 一、集落培养法检测粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM） 集落培养法是指对外周血中单个核细胞（PBMNC）进行体外培养，2周后观察CFU-GM数目，以间接反映PBSC数，CFU-GM可以反映特定系列祖细胞增殖能力。对PBSCT所需的CFU-GM数量有不同报道，即（15-50）×104CFU-GM/Kg体重。如此大量的造血祖细胞（HPC），可在病人经化疗，血象开始恢复后，每天2-5次，连续2-5d进行白细胞过滤而获得。尤其在化疗后给予人类重组粒-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF），病人外周血中可出现HPC 的暴发增殖。此时，可利用集落培养法检测CFU-GM。检测时，通常以肝素抗凝血经离心或溶血去除红细胞，得白细胞富集液，或经白细胞过滤器得到PBMNC采集液，以（2-4）×104个细胞/ml一式3份移入含有各种营养成分和CSF的半固体培养基进行培养。经37℃、5%CO2、95%湿度条件下温育14d，用倒置显微镜观察CFU-GM（定义为≥50个细胞/集落），用CFU-GM 百分数乘以标本中细胞总数即为外周血中的CFU-GM数。Siena等对未治疗的实体瘤病人外周血集落培养法进行重复性研究发现，含有50-150个集落的变异系统(CV)为1%-30%，而大于150个或小于50个集落的CV可超过30%。 尽管集落培养法开展最早，不可直观计数，但其无法定量计数 PBSC。而且，由于方法的复杂性和不规范性，包括使用许多生物试剂，主观性地判断结果（如利用显微镜计数CFU-GM）以及缺乏标准化操作规程等，致使不同实验室得到的CFU-GM结果差异很大，故其只能作为骨髓功能恢复所需细胞数的大致估计。此外，集落培养法主要检测的是分化较为成熟的祖细胞，即粒-巨噬细胞系，而对更为接近PBCS的细胞，如长期培养起始细胞（LTC-IC）和延长