细胞培养用液的配制
实验3 、细胞培养用液的配制
【实验目的】
1. 掌握DMEM培养基、胰酶的配制
2. 学习针头滤器的使用方法
【实验原理】
一．细胞培养的基本条件
1. 气体环境
气体是细胞生存的必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生能量和合成各种成分。二氧化碳主要维持培养基的pH，并作为碳源。一般用5%的空气和5%CO2来提供动物细胞的气体生长环境。氧分压过大，不利于细胞生长。植物组织或细胞一般不需要额外提供CO2。
2. pH环境
细胞生长的pH环境为：7.2-7.4，不同细胞有所差异。一般细胞耐酸性比耐碱性大些。CO2对培养基pH的影响： CO2是细胞的代谢产物， CO2的释放必然会影响培养基的pH。
CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3-
所以，培养基中要加一些缓冲剂，以保持 pH的稳定，如 NaHCO3 、HEPES等
3. 糖类
葡萄糖------细胞的主要营养物质，为生命活动提供能量
糖类在生物体内的功能不仅仅是提供能量，与蛋白质和脂类共同构过程结构材料和生物活性物质。
体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基中都以葡萄糖作为能源材料，根据不同细胞的代谢特点，所加葡萄糖浓度有所不同。植物细胞培养一般以蔗糖作为能源物质。
4.氨基酸
所有细胞多需要以下12种氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸另外所有细胞都需要谷氨酰胺，其具有特殊作用—促进氨基酸进入细胞膜，参与核酸合成，也是能源和碳源。5.维生素
在细胞代谢中起调节作用，虽然所需甚微，但为机体正常代谢不可缺少。
6.促生长因子
培养基中除上述营养成分外，还需要促细胞生长因子，已知有许多激素具有促细胞增殖作用。
血清是提供促细胞生长因子和其他细胞所需物质的来源。
二．天然培养基与合成培养基
1.天然培养基
常用的天然培养基有血清、血浆、水解乳蛋白和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）、鼠尾胶原等。
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺点：来源受限。
成分复杂，影响某些实验产物的提取和结果的分析
易发生支原体污染
2.合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如DMEM、 RPMI-1640、 TC199、MEM等。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低
缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
培养基的主要种类（基础培养基）：
单纯的基础人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基
完全培养基的组成
基础培养基 80％一95％
血清 5％一20％
碳酸氢钠 2.0 g/L
青、链霉素各100单位／毫升
血清的功能：提供基本营养物质、提供贴壁及扩展因子、激素及各种生长因子，有一定的保护作用无血清培养基
三，消化液
1.胰酶溶液：0.1-0.25% ,pH一般在8左右，受Ca2+、Mg2+、血清的抑制。
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。
胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。
胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks缓冲液配制,常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。
胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
2.EDTA溶液：解离细胞，0.02%，可以和胰酶混合使用
3.胶原酶溶液：用于上皮细胞的原代培养，作用于胶原，
对细胞影响很小。
4.pH调整溶液：常用的有HEPES和NaCO3
5.谷氨酰氨补充溶液：最好配成100?的母液
6.抗生素溶液：常用青霉素和链霉素（双抗），配成 100?的溶液
四．培养基的选择：
比较不同的培养基的细胞生长曲线、生长状态、集落形成率等，选择最佳培养基
建立某种细胞株的培养基，通常也是首选培养基
根据细胞的特点、实验需要，查阅文献、询问同行专家等
【实验步骤】
(一） DMEM培养基的配制
1. 三袋DMEM粉末用双蒸水溶解（先加入2/3DDW，再用DDW冲洗袋子）、磁力搅拌
器搅拌半小时以上。
2. 加入1.2g/袋 NaHCO3定容3000 mL、搅拌30分钟。
每人在超净台内用大滤器过滤、分装、写好种类、名字。（留取少许做污染测试放CO2
培养箱72小时）
3. 每8个人为一组，每人过滤90 mL，其余的过滤到100 mL试剂瓶中，每瓶90mL培养
基备用。
使用前在超净台内加入56℃灭活好的FCS 10 mL，使血清的终浓度为10%，4℃保存待用。（二）胰酶的配制
1. 取实验一中准备好的D–Hanks 液 200 mL （8人一组）
2. 称取0. 5g胰酶（0.25%）放入研磨器中并加入少量D –Hanks液成为糊状，研磨200次，再加入D –Hanks液终体积为200ml，合并胰酶，加0.02%EDTA助消化，磁力搅拌
使之完全溶解。（8人一组，分别研磨，再合并）
3. 用NaHCO3 调pH至8.0。
4. 小滤器（实验一中已湿热灭菌过的）过滤除菌至小瓶内,(不能装的过满,防止冷冻后瓶爆裂)、检查滤器、贴好标签、-20℃保存。每人过滤20 mL 。
（注意：1.拧紧滤器2.注射器吸液体3.注射器插好滤器4.对着烧杯慢推压针芯看是否漏5.
如不漏对小瓶过滤。6.滤器放在小瓶瓶口上，取下针头再吸液体，反复多次，滤完。7.检
查滤器滤膜是否完好。）
【实验结果】
配胰酶的时候因为研磨不好又做了一次。
【思考题】
1.细胞培养中为什么添加血清？
答：加血清是为了：提供基本营养物质、提供贴壁及扩展因子、激素及各种生长因子，有
一定的保护作用无血清培养基
2.使用血清需注意哪些方面？
答：血清质量好坏是实验成败的关键。
常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量
最好。
优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。
血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃，30 分钟
血清的消毒：过滤除菌
3.消化液胰酶的浓度是多少？
答：浓度是0.25％
4.使用小滤器过滤要注意哪些？
答：小滤器要灭菌后使用；
一般适合于少量液体过滤，液体量不能过多；
有些有机物质可以溶过滤器的膜，所以小滤器不适合过滤有机物；
使用前要用推注气体的方法检验过滤膜是否完好无存。
肿瘤细胞培养方法和培养基
肝癌细胞培养 一、培养基 1、RPMI-1640+10%胎牛血清培养基 2、DMEM+15%胎牛血清培养基 成分表
二、实验前准备工作: 操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。 1、玻璃器皿的清洗灭菌（5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml）：（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。 （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干。 （3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。 （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。
2、橡胶制品清洗消毒： 0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用 3、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）： 使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。 三、细胞复苏： 冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。 实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台（1）取一15ml离心管用滴管在其内滴加5--9ml培养液（取8ml）。 （2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s 内完成。 （3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来）。 （4）低速离心(1000r／min) 5min，去上清后再用8ml培养液再清洗离心一次。 （5）离心后倒掉上清液，在离心管中滴加3ml培养液（RPMI-1640），混匀（可用滴管轻柔吹打）。 （6）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶中滴加15滴10%小牛血清，盖上瓶盖，标好细胞种类和日期、培养人姓名等，将培养瓶平放，置于37°C培养箱中培养。2-3天换一次培养基。 四、细胞传代： 当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。 （1）试验台的消毒工作准备好，弃去旧培养液，用PBS液（不含钙，镁离子）洗1-2次，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。（细胞贴壁生长）。 （2）向瓶内加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化（将培养瓶翻转过来，以保证细胞没有脱壁）。 备注：若细胞没有脱壁，生长良好，则直接倒掉消化液，加培养液8ml，离心收集细胞；若发现很多细胞已解离已脱壁（即解离过度），则直接加培养液进行离心收集细胞。 （4）倒出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量（约2ml），轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋白液消化液冲掉，然后再加3ml培养液+15滴小牛血清。 （5）使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。 （6）将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1000r／min) 5min。 （7）将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打细胞，制成细胞悬液。
常用的组织固定液及配制
常用固定液及其配制 固定液分单纯固定液和混合固定液。 1甲醛（formaldehyde） 是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37％～40％得甲醛溶液，商品名为福尔马林（formalin）。用作固定的浓度习惯为10％福尔马林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），实际含甲醛4％。 10％福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。 经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。 2 乙醇 无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。 3 中性甲醛液（混合固定液） 甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4?H2O）4g，磷酸氢二纳（Na2HPO4）13g。此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。 4 AF液（混合固定液） 95％乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5ml。 此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脱水。 以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10％福尔马林，乙醇应尽量不用。 yzbai wrote: （1）10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收缩。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。 （2）4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。
液体配制及实验方法
（一）液体配制 1.完全培养基 DMEM+10%FBS+1%双抗+（1%HAPS液） 若放置时间长于2周加1%谷氨酰胺 2.PBS 1000ml去离子水中溶解8.0gNaCl、0.2gKCl、2.89gNa2HPO4、0.26gNaH2PO4 3.胰酶 用之前调节PH值至7.6 4.CaCl2 将0.165gCaCl2粉末溶于10ml去离子水中配制成50X的溶液 每5ml胶原酶中加入100μl CaCl2溶液（终浓度3μmol/L）用于激活胶原酶的活性 5.双抗 终浓度：青霉素100万U/100ml 链霉素100万U/100ml 青霉素0.6μg为1个单位链霉素 1.2195μg为一个单位 称取青、链霉素粉末各0.6、1.2195g溶于10mlPBS中再定容至100ml 6.两性霉素B 100mg两性霉素B粉末溶于40mlPBS中，制成浓度为2.5mg/ml(1000X)的浓缩液 每100ml完全培养基中加入100μl 浓缩液，稀释为终浓度2.5μg/ml 7.细胞冻存液 20%DMSO+80%FBS(1mlDMSO+4mlFBS) 8STZ溶液 STZ溶于柠檬酸和柠檬酸三钠的盐溶液中 称取柠檬酸0.105g溶于5mlPBS 称取柠檬酸三钠0.145g溶于5mlPBS中混合两者制成10毫升的溶解液. 再将100mgSTZ粉末溶于该溶解液中制成浓度1%的STZ溶液，调节PH值至4.5，4°避光保存，由于STZ水溶性不稳定，溶液最好在半小时内使用完毕. 9油红O 原液：油红O 0.6g溶于异丙醇（99% ）100ml 。 稀释液：油红O 原液20ml ，蒸馏水20ml ，过滤后使用。 10茜素红 称取0.1g茜素红粉溶于100mlPBS，调节PH值到7.2，过滤后使用.
常见缓冲溶液的配制
常见缓冲溶液的配制 缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗pH改变的溶液。PH缓冲系统对维持生物的正常pH 值，正常生理环境起重要作用。多数细胞仅能在很窄的pH范围内进行活动，而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化。在生物体中有三种主要的pH缓冲体系，它们时蛋白质、重碳酸盐缓冲体系。每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。 在生化研究工作中，常常要用到缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。研究工作的溶液体系pH 值的变化往往直接影响到我们工作的成效。如果提取酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。所以我们要学会配制缓冲溶液。 由弱酸及其盐组合一起使具有缓冲作用。生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tiris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。 柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。 磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。 三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑止的作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris一缓冲液，在4℃时是8.4，在37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液拿到37℃测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。而且它在pH7.5以下，缓冲能力很差。 缓冲液的pH值由哪些因素决定？ 设缓冲系统的弱酸的电离常数为K（平衡常数），平衡时弱酸的浓度为[酸]，弱酸盐的浓度为[盐]，则由弱酸的电离平衡式可得下式： 根据此式可得出下列几点结论： （1）缓冲液的pH值与该酸的电离平衡常数K及盐和酸的浓度有关。弱酸一定，但酸和盐的比例不同时，可以得到不同的pH值。当酸和盐浓度相等时，溶液的pH值与PK值相同。 （2）酸和盐浓度等比例也增减时，溶液的pH值不便。 （3）酸和盐浓度相等时，缓冲液的缓冲效率为最高，比例相差越大，缓冲效率越低，一般地说缓冲液有效缓冲范围为PK±1pH。 从上述可知，只要知道缓冲对的PK值，和要配制的缓冲液的pH值（及要求的缓冲液总浓度）时，可按公式计算出[盐]和[酸]的量。这样算涉及到对数的换算，较麻烦，前人为减少后人的计算麻烦，经计算已为我们总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系列出了表格。讲义附录部分节录有磷酸缓冲液的配制表。只要我们知道要配制的缓冲液的pH，经查表便可计算处所用缓冲剂的比例和用量。例如配制500nmpH5.8浓度为0.1M磷酸缓冲液。 经查表知pH5.8浓度为0.2M Na2HPO48.0毫升，而0.2M Na2HPO492.0毫升。依此可推论出配制100ml0.1M的磷酸缓冲液需要0.1M Na2HPO48.0毫升，而0.1M Na2HPO4需要92.0毫升。 所以500ml 0.1M磷酸缓冲液需要Na2HPO4量为: 需Na2HPO4量为 : 计算好后，按计算结果称好药品，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入50ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，便得所需的缓冲液。 各种缓冲溶液的配制，均按下表按比例混合，某些试剂，必须标定配成准确的浓度才能进行，如醋酸、NaOH等 常用体系 1.甘氨酸-盐酸缓冲液（0.05M） X ml 0.2M甘氨酸 +Y ml 0.2M盐酸再加水稀释至200ml pH X/ml Y/ml pH X/ml Y/ml 2.2 50 44.0 3.0 50 11.4 2.4 50 32.4 3.2 50 8.2 2.6 50 24.2 3.4 50 6.4 2.8 50 16.8 3.6 50 5.0
细胞培养方法
细胞株(系)细胞复苏 (1)戴手套，从液氮罐中取出冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 细胞换液 （1）贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液） 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。
常用标准溶液配制方法
常用标准溶液配制方法
1
2一般规定 本标准中所用的水，在没有注明其他要求时，应符合GB6682中三级水的标准。 本标准中所用试剂的纯度应在分析纯以上。 工作中所用的分析天平的砝码、滴定管、容量瓶及移液管均需定期校正。 本标准中标定时所用的基准试剂为容量分析工作基准试剂；制备标准溶液是所用的试剂为分析纯以上试剂。 本标准中所制备的标准溶液的浓度均指20c 时的浓度。在标定和使用时，如温度有差异，应只能附录A（补充件）补正。 “标定”或“比较”标准溶液浓度时，平行试验不得少于8次，两人各作4平行，每人4平行测定结果的极差与平均值之比不得大于0.1%。两人测定结果的差值与平均值之比不得大于0.1%，最终取两人测定结果的平均值。浓度值取四位有效数字。 本标准中凡规定用“标定”和“比较”两种方法测定浓度时，不得略去其中的任何一种，且两种方法测得的浓度值之差值与平均值之比不得大于0.2%，最终以标定结果为准。
制备的标准溶液与规定浓度之差不得超出规定浓度的+—5%。。 配制浓度等于或低于0.02mol/L 标准溶液时乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液除外，应于临用前将浓度高的标准溶液用煮沸并冷却的水稀释，必要时重新标定。 碘量法反应时，溶液的温度不能过高，一般在15~20c之间进行滴定。 滴定分析（容量分析）用标准溶液在常温（15~25）下，保存时间一般不得超过两个月。 3标准溶液的制备和标定 4.1 氢氧化钠标准溶液（使用期：2个月） c(NaOH) = 1 mol/L c(NaOH) =0.5 mol/L c(NaOH) =0.1 mol/L 4.1.1 配制 称取110g氢氧化钠，溶于100ml无二氧化碳的水中，摇匀，注入聚乙烯容器中，密闭放置至溶液清亮。用塑料管吸下述规定体积的上层清夜，用无二氧化碳的水稀释至1000ml，摇匀。 c(NaOH) ，mol/L 氢氧化钠饱和溶
实验三 动物细胞培养用液的配制
实验三动物细胞培养用液配制 一、实验目的 1.了解细胞培养常用培养液和试剂配制的基本方法。 2.初步掌握高压灭菌和抽滤灭菌的方法。. 二、器材与试剂： RPMI-1640干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素.蒸馏水、电子天平、PH计、磁力搅拌器、5.6%的NaHCO 3 三、实验原理 动物细胞培养常用液有平衡盐溶液、培养基(天然和合成)及消化液等。配制这些常用液有严格的要求： (1)使用高纯化的三蒸水。 (2)按照用液的配方计算所需各成分的用量，然后准确量取，并按规定顺序溶于三蒸水中。 (3)保证各组分完全溶解。 (4)进行pH值测试和调整。 (5)消毒分装小瓶，抽样做无菌实验，保证用液无菌。 四、具体步骤： 1、酚红（0.1%） 配法：称酚红2g，先用数滴5.6%的NaHCO 3溶液溶解，再加进该5.6% NaHCO 3 溶液使最终体 积为100mL，瓶装保存，备用。 2、Hanks平衡盐溶液。 （Hanks液是常见的平衡盐溶液（BSS）之一。D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。） 1.按表称取Hanks、D-Hanks试剂。 表13-2 D-Hanks试剂的配制 成份Hanks D-Hanks CaCl20.140 － KCl 0.400 0.400 KH2PO40.060 － MgCl2·6H2O 0.100 － MgSO4·7H2O 0.100 － NaCl 8.000 8.000 NaHCO30.350 0.350 Na2HPO4·12H2O －0.132 Na2HPO4·7H2O 0.090 － D-葡萄糖 1.000 1.000 酚红（0.1%）1mL 1mL 2.依次加入上述试剂至800mL蒸馏水中，溶解后定容至1000mL。 3.高压灭菌，10磅10min。 注意事项
常用缓冲液配置
实验室常用缓冲液配置方案 1)1 M Tris-HCl , , 组份浓度：1 M Tris-HCl 配制量：1 L 配制方法： 1. 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。 2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。 4. 将溶液定容至1 L。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低个单位。 2)10×TE Buffer , , 组份浓度：100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA 配制量：1 L 配制方法： 1. 量取下列溶液，置于1 L烧杯中。
2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，均匀混合。 3. 将溶液定容至1 L后，高温高压灭菌。 4. 室温保存。 3)1.5 M Tris-HCl 组份浓度：1.5 M Tris-HCl 配制量：1 L 配制方法： 1. 称量181.7 g Tris置于1 L烧杯中。 2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 用浓盐酸调节pH值至。 4. 将溶液定容至1 L。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低个单位。 4)3 M 醋酸钠 组份浓度：3M 醋酸钠 配制量：100ml 配制方法： 1.称量40.8g NaAc·3H2O置于100-200ml烧杯中，加入月40ml的去离子水搅拌溶解
2.加入冰醋酸调节pH值至 3.加去离子水将溶液定容至100ml 4高温高压灭菌后，室温保存。 5)PBS Buffer 组份浓度：137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 配制量：1 L 配制方法： 1. 称量下列试剂，置于1 L烧杯中。 2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 滴加浓盐酸将pH值调节至，然后加入去离子水将溶液定容至1 L。 4. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中补充1 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。 6)10 M 醋酸铵 组份浓度：10 M 醋酸铵 配制量：100 ml 配制方法：
细胞培养操作步骤
培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMS018ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5小20 d、200 pl> 1ml）,酒精灯1盏，液器1台，斜架1台， 酒精喷壶 1 个，酒精棉球缸 1 个，污缸 1 个， 常规耗材：培养瓶（50 cm 2）,定量移液管（5ml、10ml）,枪头（1ml、200小 10 d）,培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO,胰酶，苯扎溴氨，75% 酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边，待 细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若 种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的 双手。 2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒 精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3. 取1 个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶 口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上， 再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试 剂及污缸等，关闭超净工作台。 6?将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 、培养液的更换
常用固定液的配制
常用固定液的配制 1. 福尔马林-醋酸-酒精固定液(FAA) 50%或70%酒精90ml + 冰醋酸5ml + 福尔马林(37%~40%甲醛)5ml 可用作固定植物的一般组织,但不适用于单细胞及丝状藻类,也不适宜作细胞学研究。幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，可防止材料收缩。若材料坚硬，可略减冰醋酸，略增福尔马林。若材料易收缩，可稍增加冰醋酸。久置时另加入5ml甘油以防蒸发和材料变硬。此液又可作保存液。固定时间最多10h。如果用在植物胚胎的材料上，改用下面的配方，效果较好：50%酒精89ml + 冰醋酸6ml + 福尔马林5ml 2. 福尔马林-丙酸-酒精固定液（FPA） 福尔马林5ml + 丙酸5ml + 70%酒精90ml 固定一般的植物组织，通常固定8~24h，可长久保存。 3. 酒精-醋酸-氯仿固定液（卡诺固定液，Carnoy fixative） 配方Ⅰ：纯酒精3份+ 乙酸1份 配方Ⅱ：纯酒精6份+乙酸1份+ 氯仿3份 配方Ⅲ：甲醇6份+乙酸1份+ 氯仿3份 适用于植物组织和细胞学材料，为研究细胞分裂和染色体的优良固定液。固定时间不宜过久。 4. 酒精-福尔马林固定液 福尔马林2~6（6~10）ml + 70%酒精100ml 固定植物一般组织，尤其适用于萌发的花粉管的固定。通常固定24h，亦可长久保存。 5. 酒精-福尔马林-甘油固定液 95%酒精150ml + 5%福尔马林100ml + 甘油50ml 此液也可长期储存材料。 6. 铬酸-醋酸固定液 根据固定对象的不同，可分为强、中、弱3种配方： （1）弱液配方：10%铬酸2.5ml + 10%醋酸5ml + 蒸馏水92.5ml （2）中液配方：10%铬酸7ml + 10%醋酸10ml + 蒸馏水83ml （3）强液配方：10%铬酸10ml + 10%醋酸30ml + 蒸馏水60ml 弱液配方用在固定较柔软的材料，如藻类、苔藓和蕨类的原叶体等。固定时间较短，一般为。1h，但藻类和蕨类的原叶体可缩短到几分钟至12~24h数小时，最长可固定 中液配方用于固定根尖、茎尖、未成熟子房和胚珠等。为了易于渗透，可在此液中加入2%的麦芽糖或尿素。固定时间12~24h。 强液配方用于固定木质根、茎、成熟子房等。为了易于渗透，可在此液中加入2%的麦芽糖或尿素。固定时间12~24h或更长。 7. 铬酸-醋酸-福尔马林混合液 这3种药品混合在一起所配成的各种固定液，通常称纳瓦申固定液（Nawashin fixative），简称Craf。配方见下表： 纳瓦申固定(ml) 桑弗利斯纳瓦 常备(ml)原(ml) Ⅰ40 40
各种缓冲液的配制方法-
各种缓冲液的配制方法 24 Na2HP6 2H2O,分子量=178.05 0.2mol∕L 溶液含35.61g∕L 柠檬酸.H2O,分子量=210.14 0.1mol∕L 溶液含21.01g∕L 柠檬酸.H2O,分子量=210.14 0.1mol∕L 溶液含21.01g∕L 柠檬酸钠.2HO,分子量=294.12; 0.1mol∕L溶液
(1)醋酸盐溶液的配制： 醋酸—醋酸钠缓冲液(pH3.6) 取醋酸钠5.1g,加冰醋酸20ml ,再加水稀释至250ml,即得。 醋酸—醋酸钠缓冲液(pH3.7) 取无水醋酸钠20g,加水300ml溶解后，加溴酚蓝指示液1ml及冰醋酸60?80ml ,至溶液从蓝色转变为纯绿色，再加水稀释至1000ml ,即得。 醋酸—醋酸钠缓冲液(pH3.8) 取2mol/L醋酸钠溶液13ml与2mol/L醋酸溶液87ml,加每1ml含铜1mg的硫酸铜溶液0.5ml,再加水稀释至1000ml ,即得。 醋酸—醋酸钠缓冲液(pH4.5) 取醋酸钠18g,加冰醋酸9.8ml,再加水稀释至1000ml,即得。 醋酸—醋酸钠缓冲液(pH4.6) 取醋酸钠5.4g,加水50ml使溶解，用冰醋酸调节PH值至4.6,再加水稀释至100ml, 即得。 醋酸—醋酸钠缓冲液(pH6.0) 取醋酸钠54.6g,加1mol/L醋酸溶液20ml溶解后，加水稀释至500ml ,即得。 用醋酸和醋酸钠配制的缓冲溶液的PH=PKa+lg[C(NaAc)/C(HAC)K在此，C(HAC指醋酸的 浓度，C(NaAC指醋酸钠的浓度，Ka是醋酸的解离常数=1.8*10-5 (1.8乘10的-5次方)，PKa=-IgKa=4.75,将PH=5.5代入，可得C(NaAC)/C(HAc)=5.6通常我们配制时会使C(HAC)=0.1mol∕L,或是C(HAC)=0.2mol/L 等。若是配制C(HAC)=0.1mol/L,则C(NaAC)=0.56mol/L 称量醋酸钠固体质量为82*0.56=46克量取冰醋酸体积为0.1*1000∕17.5=5.7mL。将称好的 醋酸钠和量好的冰醋酸加入1000mL水中溶解、搅拌均匀即可。当然若想配制其它的浓度， 也可照公式计算即可，通常缓冲溶液不能配的太稀，否则缓冲能力要下降，太浓的话又浪费试剂。
A549细胞培养方法
A549细胞的培养 A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以1:2~1:3传代培养都是可行的。 一、[所需溶液] 1、细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液（PBS）——无Ca2+、Mg2+ NaCl 8.00 g； KCl 0.20 g; KH2PO4 0.20 g; Na2HPO4·12H2O 1.15 g 加水至1000mL，将pH调至7.4，高压灭菌。 2、消化液 （1）胰酶-PBS 结晶胰酶 2.5 g; 高压灭菌后的PBS 1000 ml 用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置-20℃保存。 （2）胰酶—EDTA: 结晶胰酶0.5 g; EDTA盐溶液0.2 g 无Ca2+、Mg2+ PBS 1000 ml 用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置-20℃保存。 3、细胞培养液：RPMI 1640培养液
配制方法： （1）将一袋干粉型RPMI 1640培养基溶于900 ml三蒸水中，冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。 （2）加入丙酮酸钠0.1 g，NaHCO2 2 g以及双抗，加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为100 U/ml 青霉素和100 U/ml链霉素。（一般市售的青霉素为80 万U/瓶，将其溶解于4 ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5 ml；市售的链霉素为100 万U/瓶，将其溶解于5 ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5 ml）。 （3）调整培养液的pH值，用pH精密试纸观察pH 7.2~7.4即可。 （4）过滤法除菌，所使用的滤器为O2加压过滤，0.22 μm滤膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒。 （5）分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置-20℃保存。 二、［细胞的维持和培养］ 1、细胞的复苏 （1）准备一个盛有37℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有A549细胞的冻存管，放于37℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。 （2）1000~2000 r，3~5 min离心。 （3）在无菌操作台中采用75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。 （4）用1 ml枪头将上清液去除，加入1 ml预热的细胞培养液将细胞吹散开，转移至25cm2培养瓶中。 （5）补充4 ml的RPMI 1640培养基，并且添加10%的胎牛血清。 （6）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。
常见缓冲溶液配制方法
常见缓冲溶液配制方法 乙醇－醋酸铵缓冲液：取5mol/L醋酸溶液，加乙醇60ml和水20ml，用10mol/L氢氧化铵溶液调节pH值至，用水稀释至1000ml。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液：取三羟甲基氨基甲烷12.14g，加水800ml，搅拌溶解，并稀释至1000ml，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液：取氯化钙0.294g，加L三羟甲基氨基甲烷溶液40ml使溶解，用1mol/L 盐酸溶液调节pH值至，加水稀释至100ml。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，加盐酸赖氨酸3.65g，氯化钠5.8g，乙二胺四醋酸二钠0.37g，再加水溶解使成1000ml，调节pH值至。 乌洛托品缓冲液：取乌洛托品75g，加水溶解后，加浓氨溶液，再用水稀释至250ml。 巴比妥缓冲液：取巴比妥钠4.42g，加水使溶解并稀释至400ml，用2mol/L盐酸溶液调节pH值至，滤过。 巴比妥缓冲液：取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g，加水使溶解成2000ml。 巴比妥－氯化钠缓冲液：取巴比妥钠5.05g，加氯化钠3.7g及水适量使溶解，另取明胶0.5g加水适量，加热溶解后并入上述溶液中。然后用L盐酸溶液调节pH值至，再用水稀释至500ml。 甲酸钠缓冲液：取2mol/L甲酸溶液25ml，加酚酞指示液1滴，用2mol/L氢氧化钠溶液中和，再加入2mol/L甲酸溶液75ml,用水稀释至200ml,调节pH值至～。 邻苯二甲酸盐缓冲液：取邻苯二甲酸氢钾10g，加水900ml,搅拌使溶解，用氢氧化钠试液(必要时用稀盐酸)调节pH值至，加水稀释至1000ml，混匀。 枸橼酸盐缓冲液：取枸橼酸4.2g,加1mol/L的20％乙醇制氢氧化钠溶液40ml使溶解,再用20％乙醇稀释至100ml。 枸橼酸盐缓冲液：取％枸橼酸水溶液，用50％氢氧化钠溶液调节pH值至。 枸橼酸－磷酸氢二钠缓冲液：甲液：取枸橼酸21g或无水枸橼酸19.2g,加水使溶解成1000ml，置冰箱内保存。乙液：取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000ml。取上述甲液与乙液混合，摇匀。 氨－氯化铵缓冲液：取氯化铵1.07g，加水使溶解成100ml，再加稀氨溶液(1→30)调节pH值至。 氨－氯化铵缓冲液：取氯化铵5.4g，加水20ml溶解后，加浓氯溶液35ml，再加水稀释至100ml。 硼砂－氯化钙缓冲液：取硼砂0.572g与氯化钙2.94g，加水约800ml溶解后,用1mol/L盐酸溶液约调节pH值至，加水稀释至1000ml。 硼砂－碳酸钠缓冲液～：取无水碳酸钠5.30g,加水使溶解成1000ml；另取硼砂1.91g，加水使溶解成100ml。临用前取碳酸钠溶液973ml与硼砂溶液27ml，混匀。 硼酸－氯化钾缓冲液：取硼酸3.09g,加L氯化钾溶液500ml使溶解，再加L氢氧化钠溶液210ml。 醋酸盐缓冲液：取醋酸铵25g，加水25ml溶解后，加7mol/L盐酸溶液38ml，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节pH值至(电位法指示)，用水稀释至100ml，即得。 醋酸－锂盐缓冲液：取冰醋酸50ml，加水800ml混合后，用氢氧化锂调节pH值至，再加水稀释至1000ml。 醋酸－醋酸钠缓冲液：取醋酸钠5.1g，加冰醋酸20ml，再加水稀释至250ml。 醋酸－醋酸钠缓冲液：取无水醋酸钠20g，加水300ml溶解后，加溴酚蓝指示液1ml及冰醋酸60～80ml，至溶液从蓝色转变为纯绿色，再加水稀释至1000ml。 醋酸－醋酸钠缓冲液：取2mol/L醋酸钠溶液13ml与2mol/L醋酸溶液87ml，加每1ml含铜1mg的硫酸铜溶液，再加水稀释至1000ml。 醋酸－醋酸钠缓冲液：取醋酸钠18g，加冰醋酸，再加水稀释至1000ml。 醋酸－醋酸钠缓冲液：取醋酸钠5.4g，加水50ml使溶解，用冰醋酸调节pH值至，再加水稀释至100ml。 醋酸－醋酸钠缓冲液：取醋酸钠54.6g，加1mol/L醋酸溶液20ml溶解后，加水稀释至500ml。 醋酸－醋酸钾缓冲液：取醋酸钾14g，加冰醋酸，再加水稀释至1000ml。 醋酸－醋酸铵缓冲液：取醋酸铵7.7g，加水50ml溶解后，加冰醋酸6ml与适量的水使成100ml。
常规细胞培养方法
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法
1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液
组织裂解液和细胞裂解液的配制
组织裂解液和细胞裂解液如何配制? 一、细胞裂解液配制 方法一 一、试剂准备 1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液: 150 mM NaCL 1% NP-40 (去垢剂) 0.1% SDS (去垢剂) 2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入) 2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入) 1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂) 1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂) 1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选) 以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。 2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF 1.5 mM EDTA 1mM NaVanadate （钒酸钠）(任选) 3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。 二、实验步骤 1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的 PBS 在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS ，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。 2、向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液 (每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 (由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。 3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中（置于冰上），然后重复步骤2
以刮取剩下的细胞。 4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声， 超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。 5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分 光光度计，在A280测定），分装保存在 -70℃。 4方法二 NP-40 or Triton-100 1% TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/L NaCl 150mmol/L PMSF（苯甲基磺酰氟）0.1mmol/L(100μg/ml) Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 μmol/L(0.7μg/ml) Leupeptin（亮抑制肽） 0.5mg/ml Aprotinin（抑蛋白酶肽）0.3μmol/L(1μg/ml) （注：PMSF 贮存液：100mmol/L即17.4mg/ml于异丙醇中； Aprotinin 贮存液：10mg/ml溶于0.01mol/LHEPES(pH8.0); Leupeptin 贮存液：10mg/ml溶于水中； Pepstatin 贮存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20℃保存） 裂解操作程序： * 离心收集1×107个细胞 * 加入4℃预冷1%NP-40裂解液100μl * 剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀（如为组织进行匀浆） * 4℃放置15~30min * 4℃离心，15 000rpm,10min，取上清备用。 方法三 ?细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活性 推荐RIPA buffer:
(最全)常见缓冲溶液配制方法
常见缓冲溶液配制方法 乙醇－醋酸铵缓冲液(pH3.7)：取5mol/L醋酸溶液15.0ml，加乙醇60ml和水20ml，用10mol/L氢氧化铵溶液调节pH值至3.7，用水稀释至1000ml。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0)：取三羟甲基氨基甲烷12.14g，加水800ml，搅拌溶解，并稀释至1000ml，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1)：取氯化钙0.294g，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液40ml 使精品文档，你值得期待 溶解，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1，加水稀释至100ml。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH9.0)：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，加盐酸赖氨酸3.65g，氯化钠5.8g，乙二胺四醋酸二钠0.37g，再加水溶解使成1000ml，调节pH值至9.0。 乌洛托品缓冲液：取乌洛托品75g，加水溶解后，加浓氨溶液4.2ml，再用水稀释至250ml。 巴比妥缓冲液(pH7.4)：取巴比妥钠4.42g，加水使溶解并稀释至400ml，用2mol/L盐酸溶液调节pH 值至7.4，滤过。 巴比妥缓冲液(pH8.6)：取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g，加水使溶解成2000ml。 巴比妥－氯化钠缓冲液(pH7.8)：取巴比妥钠5.05g，加氯化钠3.7g及水适量使溶解，另取明胶0.5g 加水适量，加热溶解后并入上述溶液中。然后用0.2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.8，再用水稀释至500ml。 甲酸钠缓冲液(pH3.3)：取2mol/L甲酸溶液25ml，加酚酞指示液1滴，用2mol/L氢氧化钠溶液中和，再加入2mol/L甲酸溶液75ml,用水稀释至200ml,调节pH值至3.25～3.30。 邻苯二甲酸盐缓冲液(pH5.6)：取邻苯二甲酸氢钾10g，加水900ml,搅拌使溶解，用氢氧化钠试液(必要时用稀盐酸)调节pH值至5.6，加水稀释至1000ml，混匀。 枸橼酸盐缓冲液：取枸橼酸4.2g,加1mol/L的20％乙醇制氢氧化钠溶液40ml使溶解,再用20％乙醇稀释至100ml。 枸橼酸盐缓冲液(pH6.2)：取2.1％枸橼酸水溶液，用50％氢氧化钠溶液调节pH值至6.2。 枸橼酸－磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)：甲液：取枸橼酸21g或无水枸橼酸19.2g,加水使溶解成1000ml，置冰箱内保存。乙液：取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000ml。取上述甲液61.45ml与乙液38.55ml 混合，摇匀。 氨－氯化铵缓冲液(pH8.0)：取氯化铵1.07g，加水使溶解成100ml，再加稀氨溶液(1→30)调节pH值至8.0。 氨－氯化铵缓冲液(pH10.0)：取氯化铵5.4g，加水20ml溶解后，加浓氯溶液35ml，再加水稀释至100ml。 硼砂－氯化钙缓冲液(pH8.0)：取硼砂0.572g与氯化钙2.94g，加水约800ml溶解后,用1mol/L盐酸溶液约2.5ml调节pH值至8.0，加水稀释至1000ml。 硼砂－碳酸钠缓冲液(pH10.8～11.2)：取无水碳酸钠5.30g,加水使溶解成1000ml；另取硼砂1.91g，加水使溶解成100ml。临用前取碳酸钠溶液973ml与硼砂溶液27ml，混匀。 硼酸－氯化钾缓冲液(pH9.0)：取硼酸3.09g,加0.1mol/L氯化钾溶液500ml使溶解，再加0.1mol/L 氢氧化钠溶液210ml。 醋酸盐缓冲液(pH3.5)：取醋酸铵25g，加水25ml溶解后，加7mol/L盐酸溶液38ml，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节pH值至3.5(电位法指示)，用水稀释至100ml，即得。 醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0)：取冰醋酸50ml，加水800ml混合后，用氢氧化锂调节pH值至3.0，再加水稀释至1000ml。 醋酸－醋酸钠缓冲液(pH3.6)：取醋酸钠5.1g，加冰醋酸20ml，再加水稀释至250ml。 醋酸－醋酸钠缓冲液(pH3.7)：取无水醋酸钠20g，加水300ml溶解后，加溴酚蓝指示液1ml及冰醋酸60～80ml，至溶液从蓝色转变为纯绿色，再加水稀释至1000ml。 醋酸－醋酸钠缓冲液(pH3.8)：取2mol/L醋酸钠溶液13ml与2mol/L醋酸溶液87ml，加每1ml含铜1mg的硫酸铜溶液0.5ml，再加水稀释至1000ml。