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DGGE技术及其在微生物研究中的应用

变性梯度凝胶电泳

--DGGE

摘要：变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术具有精确、快速、易操作等特点, 能克服传统微生物研究方法的不足，作为一种分析微生物群落的有效工具被广泛的应用于现代微生物研究。本文介绍了DGGE技术的原理、操作步骤及应用情况，并讨论了其缺点及应用前景。

关键词：DGGE 分子生物学微生物群落菌群分析

1 引言

变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术是由Fischer 和Lerman[1]于1979 年首先提出了, 并将其用于医学上基因点突变的检测。与传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相比, 这项技术可以分辨只有一个碱基差异的基因序列。1985年, Myers RM[2]等人首次在DGGE中使用“GC 夹板”和异源双链技术, 使该技术日臻完善。1993年，Muyzers[3]等人首先将PCR 技术与DGGE结合，在微生物生态学领域首次采用PCR-DGGE方法分析检验rRNA的基因,证实了该技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和菌群差异

方面具有独特的优越性。此后的十几年内DGGE技术在研究微生物多样性和种群差异上已成为一种重要工具, 并被广泛用于活性污泥、池塘底泥、污染土壤、海洋、冰川等环境样品以及食品、动物肠道中的微生物多样性检测和种群演替的研究。

2 基本原理

PCR-DGGE技术主要是先利用特定的引物合成一定长度的rRNA的基因序列，然后利用梯度变性胶来分离DNA片段。梯度变性胶是在一定的浓度聚丙烯酰胺凝胶中添加不同浓度的变性剂，使变性剂形成由低到高的线性梯度。电泳时，DNA在胶中的迁移速率仅与其分子大小有关，当DNA到达具有一定浓度变性剂时，DNA双链开始解链，迁移速率开始降低。当DNA双链完全分开时，其电泳速率急速下降。由于不同的DNA片段碱基组成存在差异，其变性条件也有所不同，在凝胶上会停留在不同的位置，经染色后形成不同条带。理论认为, 只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、温度等足够精细, 有一个碱基差异的

DNA片段都可被分开，在不同泳道中停留在相同位置的条带, 一般可视为具有相同的DNA序列。

为了使仅有一个碱基之差的不同分子取得最好的分离效果, 须先选择所研

究的DNA范围及电泳过程中所需的变性剂浓度梯度。由于DNA解链温度的升高时迁移速率的变化不明显，难以将野生型和突变型DNA分开，所以高温解链区的突变往往难以检测[11]。而且，高温解链区的解链时间较长，也限制了DGGE的使用。解决的办法是在DNA片段上连接一段长度为30~ 50bp富含GC的核苷酸序列, 该序列被称为GC 夹板(GC- clamp)。在DGGE分析过程中形成一个人工高温解链区，使DNA片段的其他部分处于相对的低温解链区，从而易于分析。

3 技术步骤：

(1) 样品总DNA 提取

(2)样品16SrDNA片段的PCR扩增

(3)DGGE 条件优化与分析

(4)割胶测序等后续分析。

3.1 样品总DNA提取

群落总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础，样品中细菌种类复杂且混杂有大量有毒物质, 如何使所有细胞裂解、充分释放DNA、有效去除杂质, 建立高效、可靠的DNA提取方法成为研究者关注的热点。当前主要使用超声波法、基于SDS的裂解法、改进的化学裂解法、微波法、冻融+ 玻璃珠+ 溶菌酶+ SDS 和DNA试剂盒法等6种DNA提取方法。

3.2 样品16SrDNA片段的PCR扩增

PCR扩增是PCR- DGGE技术中至关重要的步骤。PCR全过程包括三个基本步骤: 变性、退火、延伸。反复进行变性、复性和延伸的循环,从而使扩增DNA 产量呈指数上升, 经25 ~ 30个循环后, 扩增倍数可达106倍。

在多重PCR中很容易产生PCR偏差和PCR假阳性,这样就不能真实客观地反映微生物群落的多样性, 甚至显示实际上并不存在的微生物信息。下面就简要介绍一下常见的PCR偏差和PCR假阳性及其排除方法。

由引物与模板的退火温度引起的PCR偏差。在多重横板PCR中, 引物不可能与所有的模板序列都完全互补, 两者之间会有一个或几个碱基的错配, 大大降低了这类模板的扩增效率, 这样就会产生严重的PCR 偏差。排除这种PCR偏差的方法是适当降低退火温度或使用简并引物。在PCR最终产物中, 不同序列浓度趋于

1B1, 掩盖了模板起始浓度的差异。这是由于起始浓度低的模板经扩增后其PCR 产物又作为模板继续扩增, 且在PCR的最后几个循环其扩增效率高于PCR产物更为丰富的其他序列, 使最终产物浓度趋于1B1。排除这种PCR偏差的方法是减少PCR循环数, 提高从变性温度到退火温度的降温速率。异源DNA序列的产生。这是由于随着PCR 扩增循环数的增加, 产物浓度逐渐增高, 引物逐渐减少, 异源

单链DNA分子退火的可能性大大增加, 从而产生异源DNA分子。在DGGE 电泳中, 就会产生多余的条带, 得出错误的关于微生物群落多样性的结论。排除这种PCR偏差的方法是减少PCR 循环数, 或是将PCR 产物稀释后, 再作为模板进行PCR扩增。

由于16S rDNA 具有以下几个特点:

(1)序列长短适中, 适合用作分类学上的研究。

(2)16S rDNA在任何一种原核生物体的普遍存在性;。

(3)极端保守性。

(4)16S rDNA无法在不同的个体间进行基因交换, 各物种具自己的独特序列。

(5) 目前已有相当完备的16S rDNA基因资料库, 经过GenBank 和Ribosomal Database Project( RDP)基因资料库作对比分析，并可进行亲源关系分析、鉴定等。

通常采用16S rDNA中的保守区作为引物进行PCR反应。16S rDNA不同可变区V1、V3、V5、V6、V8 及V1 ~V3、V3 ~ V5、V6 ~ V8 区的PCR 扩增产物及其DGGE 结果。结果表明扩增V3区及V3 ~ V5 区的引物为最佳引物选择。V3 区的PCR - DGGE条带数最多、分离效果最好。如果需要较长的扩增产物,则选择V3~ V5区。

3.3 DGGE条件的优化

电泳条件的选择在整个分析过程中具有至关重要的作用，直接关系到条带分离的效果，影响后续分析。如果条件不当，会发生单一的DGGE条带可能含有不止一种序列的条带共迁移现象[13]。

DGGE电泳条件选择包括凝胶浓度、变性剂梯度、温度和电泳时间的确定。通常根据基因片段的大小来确定聚丙烯酰胺凝胶浓度, 当片段大小在200 bp左右时, 一般采用8%的凝胶, 片段在500 bp时用6%的凝胶。为提高分辨效果, 也可以采用梯度凝胶进行分离, 对于200 bp的片段, 可以采用6% ~ 12% 的丙烯酰胺凝

胶[12]。变性剂的梯度范围要根据垂直DGGE实验来确定。在垂直变性梯度实验中, DNA分子的运动方向与变性剂梯度线性增加方向垂直。电泳完成后用EB染色, DNA 片段经凝胶成像系统呈现出一条清晰的/ S0型曲线[6]。垂直实验曲线斜率较大的部分代表解链区域的Tm值, 此时低温解链区的不同分子达到最佳分离状

态。通常选择水平胶的变性剂梯度范围为30% (相当于Tm范围10°C左右) , 对于不同的样品还需要进行调整。对大多数DNA片段50°C ~65°C是比较适合的, 通常电泳的温度要低于样品解链区域的Tm值。电泳时间取决于样品的片段大小、凝胶浓度、变性剂梯度、电泳时的电压等因素, 一个条件的改变都可能引起电泳时间的不同, 可以用时间进程法来优化出最佳电泳时间。

为了更好的显示DGGE 条带, 可以选择不同的染色方式( EB、SYBR Green I 和银染)。其中, SYBR GreenⅠ染色的优点是背景色低, 可以观察到尽可能多的条带; 银染的灵敏度最高, 但银染过后的条带不能用于杂交分析[12]。

3.4 后续分析

对DGGE 图谱上的优势条带进行割胶回收, 将回收条带的PCR产物进行测序分析，分析指标有：多样性参数和相似性指数。

DGGE条带通过Smart-view软件检测峰面积。微生物群落多样性指数用Shannon-Weaver指数(H) 表示。Shannon多样性指数H 通常用于评价一个微生物种群内物种的丰富性,H 值越高, 表明微生物种群越丰富。多样性指数通常由2个因素构成:

(1)样品中物种的数量或称为种的丰富度。

(2)各个物种量的分布或称为种的均匀度。因此, H 值可反映种群内及种群之间的遗传多样性分布和差异, 其表达式为:

式中, n i表示第i个条带的峰高值, N 表示密度曲线中所有峰高之和。

根据软件分析获得DGGE的条带配对图, 在条带出现的地方定义为1, 未出现的地方记为0, 这样就得到DGGE条带配对的二次矩阵, 根据二次矩阵用NTSYSPC( 2. 10, Exeter Software, U SA )进行聚类分析[4]。

Sorenson's pairwise similarity coefficient(Cs) 相似性分析指数, 可比较不同样品间及分析菌群的动态变化,计算公式如下:

其中Nx 为泳道x 条带数, Ny 为泳道y的条带数, j 为2 个泳道共有的条带数。Cs 值越大, 表示两个样品的相似程度越高[9]。

4 DGGE技术的应用

PCR- DGGE 技术由于克服了传统微生物必须先经富集才能进行微生物学分析的局限性,可以直接对样品进行处理和分析，省却了人力和时间，因此能够被用来探索海洋、冰川、土壤、污泥等生境中以及食品、动物体内的微生物资源,

因此它在分析微生物多样性和群落动态性等方面得到广泛应用。

4.1 分析微生物多样性

PCR- DGGE图谱可用于确定环境微生物群落中优势类群或独特种群的遗传多样性, 在某些情况下为了得到更详细的信息, 可通过DGGE指纹与分类单元特定的寡核苷酸探针杂交或对切下的DGGE条带序列分析来进一步鉴定菌落成员。PCR- DGGE技术与其他分子生物学方法结合, 则更能实际准确地揭示微生物群落的结构和功能, 指导人们更好地认识自然规律。

4.2 监测微生物群落动态性

PCR- DGGE技术可同时分析多份样品, 监测某些生境中微生物群落结构及其在时间或空间上的动态变化, 因此, 他已成为研究微生物群落动态的一种重要手段。此外,PCR- DGGE技术还有助于发现新的微生物物种。

5 DGGE技术的局限性及解决方法

DGGE技术虽然被广泛使用，但仍存在局限性。第一, 利用DGGE分离的PCR 产物, 一般要求DNA长度在500bp以下, 否则DGGE的分辨率会下降, 而判断微生物所属的系统类群, 要求分析的16S rDNA片段长度至少达到500bp，因此给PCR引物设计和系统发育分析带来一定困难。第二,DGGE 指纹通常显示微生物群落中的优势种群,Muyzer等指出此法只能对菌体数量大于总菌量1% 的菌群进行分析。第三, 每种菌可能含有1~ 15个数目不等的rRNA基因, 这可能导致自然群落中细菌的数量被过多地估计。第四，DGGE的共迁移问题使图谱中单一的条带并不总是代表单一的菌株, 或是在不同的泳道中移动到同一位置的条带可能由不同的细菌组成。第五，DGGE技术不能提供在某一生境中微生物群落的真实图景, 也无法直接同微生物的生理相结合。第六，DGGE技术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库, 若数据库中基因序列信息不够丰富, 将会限制DGGE的使用。

对于以上存在的缺陷，除进行系统优化外,还可以从以下两点着手解决: 选择合适的目的基因片段。根据研究目的的不同, 选择合适的目的基因片段可将微生物鉴定到类、属、种、菌株等不同分类层次。与克隆、测序、核酸杂交、RFLP 等技术联用, 不仅可以克服单一技术存在的缺陷，对实验结果进行交叉验证，还可以更准确的从不同方面反映环境中微生物多样性信息。

6 应用前景

尽管DGGE技术存在一定的局限性，但其具有可靠、快速、易操作等特点, 能克服传统微生物研究方法的不足, 重现微生物多样性, 提供微生物在时间和空间上的动态变化。另外这种技术存在的缺陷,可以通过其他生物学技术来弥补, 如末端标记的荧光PCR和区内标准可以用于检测稀少菌落成员和精确比较样品之间的差异。因此, PCR- DGGE技术与其他生物技术相结合, 将能更实际地反映微生物群落的结构、功能和动态变化, 提供微生物的空间分布、群落演替、原位生理等信息, 促进人们对微生物生态的认识, 为微生物资源的开发利用提供理性导。

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微生物实验知识总结与实践应用经过这学期学习和实验操作，我对《微生物实验》有了一些初步的认识，也从中学习到了有用的知识。《微生物学实验》是要求我们掌握实验知识的基本操作和技能训练，初步了解和掌握先进的技术和方法，与迅速发展的科学前沿接轨。微生物：包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。我将我这学期学到的微生物学知识，结合生活和工业当中的一些应用，归纳如下：在吾尔恩老师的带领下，我们先从最基本的知识学起。（1）无菌操作技术：高温对微生物具有致死效应，因此微生物在转接过程中，一般再火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌的目的。在做实验时要保持严谨的态度，以后的实验中多数操作都必须再火焰旁进行。（2）培养基的制备：培养基是人工配置的生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别微生物或积累代谢产物。自然界中培养基的种类很多，但是不同的培养基中，一般含有水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子等，不同类别的微生物对PH值的要求一般不同。（3）消毒与灭菌：灭菌是用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或

环境赋予菌种的抵抗力。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。是指用物理或化学的方法杀灭全部微生物，使之达到无菌保障水平。经过灭菌处理后，未被污染的物品，称无菌物品。经过灭菌处理后，未被污染的区域，称为无菌区域。（4）平板分离与活菌计数：平板分离计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上。经培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。平板分离法主要有：1.平板划线分离法。2.稀释涂布平板法。（5）革兰氏染色法：革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性细菌（G+）和革兰氏阴性细菌（G-）两种类型。这是两种细菌细胞壁结构和组成的差异决定的。大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性细菌，经过革兰氏染色后两者呈现不同的颜色，在显微镜下便于进行观察…… 我们学习微生物实验技术，就是要把微生物的实验技能应用于实践生产，培养繁育细菌收集细菌代谢产物，应用于药业、工业，产生经济利益。制备培养基是微生物实验技术操作的重要环节，按照培养基的功能分类培养基的类型有：1.选择培养基。2.鉴别培养基。在工业生产中常常应用于培养微生物的主要是-发酵罐。我将微生物在生产生活中的应用总结如下：微生物技术的应用在当今社会中已取得了很大的作用，在工业、农业、医药业、畜牧业等各个行业中都取得了长足的进展，但相对于

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第十一章微生物学的应用习题参考答案一、选择题 1-5. CDAAAAC；6. B 二、是非题 1-5. FFTFF；6-7. FT 三、填空题 1. 糖类化合物 2. 同型；异型 3. 自然；纯种 4. 深层培养；固体基质 5. 促进植物生长发育；增强抗寒抗旱；抗倒伏的能力；提高农作物的品质和产量 6. 高等植物叶绿素；蛋白质的合成；光合作用；养分的吸收和利用 7. 对病原菌的抑制作用；影响宿主或其他菌株的代谢活性；刺激机体的免疫系统；减缓乳糖不适症 8. 瘤胃内氨；蛋白质；蛋白质；非氨态氮；植物酶活性，提高单胃动物对；磷 9. 谷氨酸；赖氨酸；苏氨酸；异亮氨酸；缬氨酸；精氨酸 10. 谷氨酸钠为鲜味剂；色氨酸和甘氨酸为甜味剂；赖氨酸为营养增强剂 11. 保护细胞；影响细胞移动；增殖和分化；影响细胞的吞噬功能；屏蔽细胞膜上的机械感受器；调节合成细胞的能力；肿瘤 12. 深层通气发酵；固体通风发酵 13. 纯菌种的分离（用选择性培养法和平板分离法纯化得到）；纯培养操作及其保障措施（高温灭菌、空气除菌、无菌操作、认真贯彻执行生产操作规程等）；纯培养空间（经过无菌处理并在无菌条件保障下的玻璃培养器皿及其培养箱、摇瓶及摇瓶培养室、各种类型的大小发酵罐及其补料等设备） 14. 寄生；拮抗；竞争四、解释题

1. 菌根是土壤中某些真菌侵染植物根部，与其形成的菌-根共生体。与农业关系密切的是VA 菌根真菌，它是土壤共生真菌中宿主和分布范围最广的一类真菌。研究表明，V A菌根不但侵染的植物种类多，范围广，而且V A菌根的菌丝具有协助植物吸收磷类营养的功能。 2. 有机肥是利用历史最悠久、用量最大、综合效益俱佳的“多功能”微生物肥料，它实际上是动物排泄物、动植物残体被微生物部分或全部降解的混合物。它不但给作物提供养料，还能改善土壤的耕作性能。 3. 原位发酵又称分批发酵或分批培养，即在一个发酵罐或生物反应器中，投入一定量的发酵培养基，灭菌消毒后接入一定量的种子液，控制合适的发酵条件，让微生物在发酵罐中生长繁殖，当菌丝体增长到一定量后发酵过程自动转入次级代谢阶段，产生大量的目标产物（即药物)最后当产物的量不再明显增加时所有的发酵液一次性放出，进入分离纯化车间。 4. 以一定速度向发酵罐内连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和产场的培养液以相同速度从发酵罐内放出，发酵罐内液量维持恒定。经过一定时问培养后，培养物就近似于恒定状态的生长和代谢，这时所有物质（营养物、产物、微生物细胞等）的浓度、环境的物理状态（如pH、DO）以及比生长速率等始终维持不变，即稳定状态。 5. 定向进化技术指人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。 6. 易错PCR（error prone PCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。五、简答题 1. 单细胞生产常用原料有：糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液、谷氨酸发酵废液、稻草、稻壳、玉米芯、木榍等的水解液；天然气、乙醇、乙烷等；乳制品和啤酒生产的废弃物；发酵方法：深层通气发酵和固体通风发酵；主要用途：作为单细胞食品；提取核苷酸、辅酶A、乳糖酶等医药及生物试剂；主要菌种：产元假丝酵母、解脂假丝酵母、嗜石油假丝酵母等。 2. 原料；豆饼、麸皮、大麦、小麦和大豆等；菌种：黄曲霉、米曲霉；工艺流程：大豆等→熏蒸→接种→制曲→加盐和水→发酵→压滤→酱油。

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( 安全论文 ) 单位：_________________________ 姓名：_________________________ 日期：_________________________ 精品文档 / Word文档 / 文字可改微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用(新编版) Safety is inseparable from production and efficiency. Only when safety is good can we ensure better production. Pay attention to safety at all times.

微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用 (新编版) 摘要：本文结合堆肥化、卫生填埋两种现行的城市生活垃圾处理工艺，主要介绍了城市生活垃圾生物处理过程中的微生物种群，以及通过分析开发出的新的微生物技术，指出了应用于城市生活垃圾处理的高效的微生物技术的研究方向。关键词：城市生活垃圾微生物强化微生物处理技术基因工程随着城市化进程在全球范围的加速，城市化带来的环境污染和人类聚居状况恶化等问题，已成为世界各国共同关心的问题。城市生活垃圾（Municipalsolidwaste,简称MSW）是在城市日常生活及为城市生活提供服务的活动中产生的固体废弃物，是城市环境的主要污染物之一。目前，城市生活垃圾处理处置的方法主要包括卫生填埋（Sanitarylandfill）、堆肥化(Composting)、焚烧(Incineration)

三种，其中前两种处理方式均属于生物处理技术。具体来说，MSW生物处理技术就是城市生活垃圾中固有的或外添加的微生物，在一定控制条件下，进行一系列的生物化学反应，使得MSW中的不稳定的有机物代谢后释放能量或转化为新的细胞物质，从而MSW逐步达稳定化的一个生化过程。 1.城市生活垃圾生物处理中主要的微生物 MSW生物处理技术主要包括好氧和厌氧生物处理。好氧生物处理如：好氧堆肥、生物反应器填埋等，其工艺中的微生物主要有细菌、放线菌、真菌等微生物种群。厌氧生物处理，如：厌氧消化、厌氧填埋等，其工艺中的微生物又称“瘤胃微生物”，主要有水解细菌、产氢产乙酸菌群和产甲烷菌群等。 1.1城市生活垃圾好氧生物处理中的微生物 1.1.1细菌在MSW好氧生物降解过程中，细菌凭借强大的比表面积，可以快速将可溶性底物吸收到细胞中，进行胞内代谢。总的来说，其数量要比放线菌和真菌多得多。当然，在不同的环境中分离的细菌在

浅谈微生物采油技术的研究与应用

龙源期刊网 https://www.sodocs.net/doc/aa3058858.html, 浅谈微生物采油技术的研究与应用作者：范洪江郭军龙陈尚桢来源：《科技风》2017年第13期摘要：我国经济的发展使我国对石油的需求量日益增高，现阶段，各种先进的科学技术手段应用到石油工业的开采过程中，其中微生物采油技术应用最为广泛。本文将通过对微生物采油技术的特点以及优势研究，探讨微生物采油技术在我国石油开采业的应用。关键词：微生物采油技术；特点；研究；应用微生物采油技术在我国石油开采业的应用，不仅提升了石油的采油率，还在一定程度上降低了开采工作对油层的破坏，减小了环境污染，为我国的采油事业的发展做出一定的贡献。 1 微生物采油技术的概念微生物采油技术是一种利用微生物来提高石油采油率的技术，也叫做微生物强化采油，这种技术中最重要的一点就是对微生物的筛选，将油藏注入到筛选出的微生物或者微生物代谢产物中，通过微生物的某些生命活动或者代谢产物的生理特征，在开井采油时，就可以改变原油的粘性、表面的流速和石油的张力，还能大大改变石油的压力，从而提高石油的采油率。微生物采油技术是一种综合技术，不仅包括微生物学、油藏地质学还包括石油开采工艺学等学科，这种利用微生物采油的构想来源于美国人，随后，其他国家的石油专家也不断研究，使这项技术日益完善。国内的相关学者已经筛选出来的多种能够提高采油率的微生物菌种，也能够利用微生物技术构建采用微生物的菌株。中国石油多次召开微生物采用技术研讨会，不断发展和规划技术体系的建设，随着研究的不断深入，国内的很对石油开采专家积极的学习国外的微生物采油技术理念，取长补短，使我国的微生物采油技术得到了更好的发展空间。但是中国的微生物采油技术还缺乏对菌种的评价和检测体系，在微生物采油技术的可持续发展中还需不断的完善[1]。 2 微生物采油技术的特点及优势 2.1 微生物采油技术的特点 2.1.1 石油的地层条件影响微生物采油技术中的微生物微生物采油技术的应用必须要保证微生物在地层中繁衍生殖，油层内细菌的生长受各种条件的影响，只有保证油层内的氢氧离子浓度适中、营养物充足、压力和温度都适应微生物生长时，才能顺利的完成石油的开采工作。为了提高油田的采油率，就要不断的调整油层内各种地层条件，促进微生物不断的进行传播。

微生物研究技术与方法重点大全要点

第一章绪论课程主要内容： 1、微生物学研究技术发展 2、微生物材料的准备 3、微生物研究中的物理化学方法基础 4、微生物的观察与微生物分析法 5、细胞破碎方法及亚细胞物质分离 6、微生物育种技术 7、固相化技术与生物传感器 8、免疫学技术 9、微生物学研究的分子生物学技术微生物学研究技术发展：微生物学是整个生物学中第一门具有一套自己独特操作技术的学科，其技术的发展主要包括： 1、显微镜术和制片染色技术 2、消毒灭菌技术和无菌操作技术 3、纯种分离和克隆化技术 4、合成培养基技术；选择性和鉴别性培养技术 5、突变型标记和筛选技术；深层液体培养技术 6、菌种保藏技术 7、原生质体制备和融合技术 8、各种DNA重组技术等第二章微生物材料的准备第一节灭菌、消毒、除菌与无菌操作掌握知识要点：原理、方法、生物活性物质的除菌无菌操作：意识、个人卫生、环境卫生、灭菌、接种等操作、保存一、几个基本概念控制害菌的措施： 1）杀灭法： ○1灭菌：彻底杀灭（杀菌、溶菌）——一切微生物 ○2消毒：部分杀灭——仅杀灭病原菌 2）抑制法： ○1防腐：抑制霉腐微生物 ○2化疗：抑制宿主体内的病原菌 1、灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。例如：高温灭菌、辐射灭菌等。 2、消毒：消除毒害，即传染源、致病菌。一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施。例如：

常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法 1）巴氏消毒法（pasteurization） 2）煮沸消毒法采用在100℃下煮沸数分钟的方法，一般用于饮用水的消毒。 3、防腐：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过抑菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施。防腐的方法： ①低温：利用4℃以下的各种低温（0，－20，－70，－196℃）保藏食物、生化试剂、生物制品或菌种等。 ②缺氧：可采用抽真空、充氮或二氧化碳、加入除氧剂等方法来有效防止食品和粮食等的霉腐、变质而达到保鲜的目的。除氧剂的种类很多，是由主要原料铁粉再加上一定量的辅料和填充剂制成，对糕点等含水量较高的新鲜食品有良好的保鲜功能。 ③干燥：采用晒干、烘干或红外线干燥等方法对粮食、食品等进行干燥保藏，是最常见的防止霉腐的方法；在密封条件下，用生石灰、无水氯化钙、无氧化二磷、氢氧化钾（或钠）或硅胶等作为吸湿剂，也可很好的达到食品、药品和器材等长期防霉腐的目的。 ④高渗：通过盐腌和糖渍等高渗措施来保存食物，是在民间早就流传的有效防霉腐的方法。 ⑤高酸度：在我国和韩国等具有悠久历史的泡菜，就是利用乳酸菌的厌氧发酵使新鲜蔬菜产生大量乳酸，借这种高酸度而达到抑制杂菌和防霉腐的目的。 ⑥高醇度：用白酒或黄酒保存食品，在我国有悠久传统，如：醉蟹、醉麸、醉笋和黄泥螺等产品，都是特色风味食品。 ⑦加防腐剂：在有些食品、调味品、饮料、果汁或工业器材中，可加入适量的防腐剂或防霉剂来达到防霉腐的目的，如：用苯甲酸来使酱油防腐；用尼泊金作墨汁防腐剂；用山梨酸、脱氢醋酸作化妆品防腐剂；用二甲基延胡索酸（DMF）作食品、饲料的防腐剂。 4、化疗——化学治疗利用具有高度选择毒力即对病原菌具高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。用于化学治疗目的的化学物质称化学治疗剂，包括磺胺类等化学合成药物、抗生素、生物药物素和若干中草药中有效成分等。要点： 1.灭菌：利用物理、化学方法杀死物体表面、内部全部的微生物。 2.消毒：杀死物体表面或内部有害微生物或使其钝化，使致病微生物不致病。 3.除菌：利用物理方法除去物体表面的微生物。

微生物学发展简史

1、史前期（约8000 年前一1676 ) ,各国劳动人民,①未见细菌等微生物的个体；②凭实践经验利用微生物是有益活进行酿酒、发面、制酱、娘醋、沤肥、轮作、治病等）。在17世纪下半叶，荷兰学者吕文虎克用自制的简易显微镜亲眼观察到细菌个体之前，对于一门学科来说尚没形成。这个时期称为微生物学史前时期。在这个时期，实际上人们在生产与日常生活中积累了不少关于微生物作用的经验规律，并且应用这些规律，创造财富，减少和消灭病害。民间早已广泛应用的酿酒、制醋、发面、腌制酸菜泡菜、盐渍、蜜饯等等。古埃及人也早已掌握制作面包和配制果酒技术。这些都是人类在食品工艺中控制和应用微生物活动规律的典型例子。积肥、沤粪、翻土压青、豆类作物与其它作物的间作轮作，是人类在农业生产实践中控制和应用微生物生命活动规律的生产技术。种痘预防天花是人类控制和应用微生物生命活动规律在预防疾病保护健康方面的宝贵实践。尽管这些还没有上升为微生物学理论，但都是控制和应用微生物生命活动规律的实践活动。 2、初创期（1676 一1861 年）,列文虎克,①自制单式显微镜,观察到细菌等微生物的个体；②出于个人爱好对一些微生物进行形态描述。微生物的形态观察是从安东·列文虎克（Antony Van Leeuwenhock 1632-1732）发明的显微镜开始的，它是真正看见并描述微生物的第一人，他的显微镜在当时被认为是最精巧、最优良的单式显微镜，他利用能放大50～300倍的显微镜，清楚地看见了细菌和原生动物，而且还把观察结果报告给英国皇家学会，其中有详细的描述，并配有准确的插图。1695年，安东·列文虎克把自己积累的大量结果汇集在《安东·列文虎克所发现的自然界秘密》一书里。他的发现和描述首次揭示了一个崭新的生物世界——微生物世界。这在微生物学的发展史上具有划时代的意义。这是首次对微生物形态和个体的观察和记载。随后，其他研究者凭借显微镜对于其它微生物类群进行的观察和记载，充实和扩大了人类对微生物类群形态的视野。但是在其后相当长的时间内，对于微生物作用的规律仍一无所知。这个时期也称为微生物学的创始时期。 3、奠基期（1861 一1897 年）,巴斯德,①微生物学开始建立；②创立了一整套独特的微生物学基本研究方法；③开始运用“实践―理论―实践”的思想方法开展研究；④建立了许多应用性分支学科；⑤进入寻找人类动物病原菌的黄金时期。继列文虎克发现微生物世界以后的200年间，微生物学的研究基本上停留在形态描述和分门别类阶段。直到19世纪中期，以法国的巴斯德和德国的柯赫为代表的科学家才将微生物的研究从形态描述推进到生理学研究阶段，揭露了微生物是造成腐败发酵和人畜疾病的原因，并建立了分离、培养、接种和灭菌等一系列独特的微生物技术。从而奠定了微生物学的基础，同时开辟了医学和工业微生物等分支学科。巴斯德和柯赫是微生物学的奠基人。(1)巴斯德巴斯德原是化学家，曾在化学上做出过重要的贡献，后来转向微生物学研究领域，为微生物学的建立和发展做出了卓越的贡献。主要集中在下列三个方面：①彻底否定了“自然发生”学说。“自生说”是一个古老学说，认为一切生物是自然发生的。到了17世纪，虽然由于研究植物和动物的生长发育和生活循环，是“自生说”逐渐消弱，但是由于技术问题，如何证实微生物不是自然发生的仍是一个难题，这不仅是“自生说”

微生物采油技术

微生物采油技术二○○四年四月

前言 70年代初期世界石油危机，世界各国都加强了对微生物提高石油采收率的研究，国内微生物采油在二十世纪90年代中期引起各油田重视，并在国内各油田部署微生物采油工作，吉林油田主要进行注入营养物的微生物方法研究，辽河油田进行微生物单井吞吐矿场试验，大港油田进行微生物驱油先导试验，胜利油田进行微生物菌种筛选研究工作，大庆油田进行基础理论研究工作。上述各油田的工作均取得一定的进展。目前，大庆油田开发进入中后期，采出液含水大幅增加，而可采储量的半成以上仍被圈闭在地下，如何进一步提高采收率对大庆油田具有重要的历史意义。实践证明，微生物采油不仅可以改变油井原有的产量递减趋势，提高原油产量，延长了油井的生命期，而且对同一口井可以反复使用。与其它化学采油方法比较，微生物采油具有不污染油藏和水资源、施工简单、成本低、高回报率、生物环保、可反复应用等优点，它克服了其它化学方法无法避免的高成本、高污染等缺点，显示出强大的生命力，具有广阔的发展前景，对大庆油田的后续开发有着重要意义。一、微生物菌液性能驱油采用的微生物是一种兼性厌氧，在无氧的油层环境下能依靠原油中长链烷烃（石蜡）为食源而生存、繁殖。大约每4个小时可增加体积一倍。该微生物的体积直径一般在0.1—0.3μm。适应的油层条件为，温度120℃以下，含水率10%以上，矿化度30万ppm以下，

原油中饱和烷烃或含蜡量3%以上。二、微生物采油机理采油微生物种类较多，各种微生物特性和作用机理不尽相同，但从效果上概括起来主要是对原油起到清蜡降粘的作用，在微生物代谢的同时伴有产热、产气和产生表面活性物质等。具体如下： 1、采油微生物在生物代谢过程中以石蜡为养分，石蜡裂解后生成轻组分烃类，使石油中原有的重组分烃类向轻组分发生转移，从而降低了原油的粘度和凝固点，增强了原油的流动性。 2、微生物在地下代谢过程中产生CH4、H2、CO2、N2等气体，这些气体能够增加油层压力，部分溶于原油，改善原油流动性。 3、微生物在代谢过程中产生多种化学物质，如生物活性剂、有机酸和醇、酯等有机溶剂。其中生物活性剂能降低油田水界面张力，产生水包油的乳化作用，使油和水的相容性增强，改善水驱效果；有机酸对碳酸岩层起到酸化地层和井筒周围近井解堵的作用：醇和有机酯等有机溶剂可以改变岩石表面性质和原油物理性质，使吸附在空隙岩石表面的原油释放出来。 4、微生物在代谢过程中产生生物聚合物，能够在高渗透层控制流度比，调整注水油层的吸水剖面，增大波及体积。三、微生物采油现场技术微生物采油现场试验方式主要有：单井吞吐、微生物水驱、微生物循环驱、微生物水压裂以及微生物与共它采油措施，如聚合物驱、三元复合驱、且面活性剂等复配。 1、微生物单井吞吐：

6学技术及其在环境微生物研究中的应用

分子生态学技术及其在环境微生物研究中的应用张于光!，李迪强!!，肖启明" （!#中国林业科学院森林生态环境与保护研究所，北京!$$$%!；"#湖南农业大学生物安全科技学院，湖南长沙&!$!"’）摘要分子生态学作为一门新兴的学科已经成为国内外科学家关注和研究的热点。目前的分子生态学技术主要有核酸杂交分析技术、特异性()*扩增技术、+,-序列分析、基因芯片技术等。这些技术在环境微生物研究中的应用主要包括对微生物多样性的研究、种群结构和动力学的研究、代谢活性的研究以及在全球气候变化中对微生物影响的研究。最后，对环境微生物的分子生态学研究进行了展望。关键词分子生态学；环境微生物；基因芯片；全球气候变化中图分类号.%/%#%文献标识码-文章编号!$$012$"!（"$$0）$01$$’21$& !"#$%&#’()%"#"*+,$%-."#"*+’./012344#5%’15".5. ).65(".7$.1’#!5%("85"#"*+91&/+ 34-,567897:;9!，<=+>8?>:;9!，@=-A.>8B>;9" （!!"#$%&’(&)*$%+,&-!+#./)&#!0)&%*,%!12/#*$*3,45!&’(&)*$%)6，7*/8/#9!$$$%!； "!1&--!&’0-4#%0)&%*,%!:;#4#39)/,!<#/.!124#9$24&!$!"’） 3821(’%1-C:D7E9F G;>;9C7D H F I J，B G K F I7K:E F I G K G9L M:C D F I G B F:M G J E F C F:E I M C N G J J M:J O E F P P G E K O P>O F C I>F;8 J>C J C’:J J F;J>G;#-J N E F C F;J，B G K F I7K:E F I G K G9L J F I M;G K G9L B:>;K L>C;7I K F>I:I>O M L D E>O>Q>;9O F J F I J>G;，()*:B N K>R>8 I:J>G;，+,-C F?7F;I F:;:K L C>C，9F;F I M>N，:;O G J M F E J F I M;G K G9L#S M F L:E F7C F O>;B>I E G D>G K G9L C J7O L B:>;K L>;B>8 I E G D>:K O>T F E C>J L，I G B B7;>J L C J E7I J7E F:;O O L;:B>I C，B F J:D G K>I:I J>T>J L，:;O J M F>B N:I J G R9K G D:K I K>B:J F I M:;9F C J G B>I E G G E9:;>C B C#S M F N E G C N F I J G RB G K F I7K:E F I G K G9L J F I M;G K G9L C J7O L P:C:K C G O>C I7C C F O# :$+;"(/2B G K F I7K:E F I G K G9L；F;T>E G;B F;J:K B>I E G D F；9F;F I M>N；9K G D:K I K>B:J F I M:;9F 分子生物学及其技术的发展和变革为生态学的研究开辟了新途径，分子生物学与生态学的交叉领域，越来越引起人们的重视，分子生态学便应运而生，微生物分子生态学是其中的重要分支。应用分子生态学技术，研究者不必培养微生物，而可以直接对环境微生物进行分析来达到目的。分子生态学技术在环境微生物研究中的应用始于"$世纪’$年代中期，近年来在土壤、环境、海底沉积物、动物肠道等微生物生态系统的研究中得到了快速的发展，已经成为最富有活力的生态学科前沿领域之一。 <环境微生物+,-的获得从自然环境中直接分离微生物核酸，对不能培养的微生物的检测、对决定选择微生物或自然条件下重组基因的命运、对揭示基因型的多态性和在微生态中的变化都是很重要的［!］。目前从环境样品中提取+,-的方法主要有"种。首先是细胞提取法。最初的报道是从土壤中提取细菌+,-，这种方法包括用不同的离心速度从土壤颗粒中分离细菌，然后溶解提取的细胞提取+,-，最后纯化+,-。4G K D F;等以该方法为基础提取的+,-纯度足够可以对土壤细菌群落特定基因型进行探针检测，以及对提取+,-进行U G7J M F E;分析和限制性酶分析［"］。第"种方法是直接溶解法。该方法是由提取沉积物+,-发展而来［/］。直接溶解后在缓冲液中用碱提取+,-，用乙醇沉淀、)C)K浓度梯度离心等纯化提取的+,-。环境样品中提取+,-总是同时提取了腐殖物质的+,-，因而干扰了+,-的检测和收稿日期："$$&1$/1"$ 作者简介：张于光男，博士。现主要从事环境微生物分子生态学研究。项目来源：国家“十五”科技攻关项目（"$$!V-0!$V!$）；林业局重点项目“自然保护区社会经济生态价值研究” !通讯作者 2’ 微生物学杂志"$$0年%月第"0卷第0期W A X*,-