农杆菌介导转化和再生的杨树讲解

农杆菌介导法转基因杨树

摘要：

杨树品种已发展为一种植物转化和再生系统。叶植，从稳定发芽培养的一个杨树杂交NC - 5339(银白杨标本)，被共培养用于农杆菌遗传转化关于一个烟草的看护培养。致瘤的和无防备的农杆菌株隐藏包含一个双元载体，其中包含两个新霉素磷酸转移酶ll(NPT II')和细菌5莽草酸3-磷酸合酶(EPSP)(AROA )嵌合基因融合。没有开发芽，叶外植体时，双元缴械拉力的根癌农杆菌菌株共培养。然而，转化的植物，没有野生型的T-DNA获得使用农杆菌株原癌基因的二进制。NPT II '酶的活性检测，Southern印迹法分析和免疫学检测证实了遗传转化成功细菌EPSP合酶Western印迹。这是首次报道成功收回转化植株森林树，也是第一个记录的插入和重要农艺性状的外源基因的表达成木本植物物种。

关键词：白杨；转化；农杆菌

、尸■、亠

前言

基因工程树种的能力将是特别有用的遗传改良，如大型成熟的植物并长期有性世代倍(Nelson and Haissig 1984; Sederoff and Ledig 1985)。森林树种的应用重组DNA 技术的一个先决条件是发展的基因转移系统。方法，例如显微注射(Crossway et al.1986和直接DNA 摄入(Paszkowski et al. 1985; Fromm et al. 1986) 已被用于外源基因引入到草本作物物种，但是，最有效的基因转移的方法，利用自然感染冠瘿病的机制造成的有机体，农杆菌(Bevan et al. 1983 ; Fraley et al. 1983 ; Herrera-Estralla, 1983). 。根癌农杆菌的自然感染周期期间，细菌的T-DNA 整合到宿主植物的染色体，从而导致肿瘤对植物的生产(奇尔顿等人，1980)。

可以删除和替换而不影响根癌农杆菌的T-DNA转移到植物(DeGreve等，1982)

的能力，由异源基因的肿瘤诱导基因。这些修改后的根癌农杆菌菌株的原生质体，悬浮细胞，外植体组织的共培养，可导致转化植物缺乏致癌基因性状的隔离。因此,我们着手开发一个混合型杨树无性系，银白杨x gran dide ntata的(NC - 5339) 作为载体的农杆菌转化体系。

有许多特征能使杨树NC-5339 得到理想的转化研究首先，杨树是一个重要的全球森林树种。这是一个快速增长的落叶阔叶树，栽培主要用于纸浆生产。对于短期循环杨树种植园的建立和管理的一个主要限制因素是缺乏一种广谱除草

剂，从而有效地控制杂草（Akinymiju etal. 1982; Hansen and Netzer 1985; Nelson and Haissig 1986）。因此，生产的杨树品种抗此类除草剂具有经济吸引力。介绍草甘膦耐受性的嵌合基因（Comai et al. 1985）杨树杂交提供了一个独特的机会对于杂草控制。野生型菌株，如杨树虫瘿上已分离出27株（基恩等人1970年生）

和应变AT181 （西亚基等人，1978）。最近，杨树再次作为宿主的根癌农杆菌展示瘿组织中存在的T-DNA序列（Parsons等人，1986），但是，迄今为止的根癌农杆菌还没有被成功地用作载体将外到杨属植物重要农艺性状的基因。第三，杨

树是一个属森林树木的成员，其经受得起体外操纵。杨树的苗培养可以保持在体外和用于无性繁殖，从而提供了一种无菌的细菌的共培养实验中的外植体材料的来源。此外，大量的繁殖体可以迅速获得用于实验或商业目的（1978视Christie; 麦科恩1985）。在本文中，我们描述了胡杨NC-5339植物外源基因系统的转移和表达。农杆菌的遗传转化使用二元的致瘤菌株突变aroA基因，编码5 -烯醇

丙酮酰莽草酸3 -磷酸合酶（EPSP）较不敏感的除草剂草甘膦，背引入到杨树NC-5339植株。aroA基因的稳定整合和表达由Southern和Western印记分析证实。这是首次报道的同时改造再生的森林树种。

材料与方法

植物培养及再生。苗培养建立在一个杨树杂交克隆，银白杨x大齿杨

（NC-5339），麦科恩（1985）所描述的。Murashige和Skoog培养基中蔗糖（30 克/升），和植物琼脂（0.6%）（血清）中的最小的有机物，用于初始培养和随后的次生培养。培养基用氢氧化钾溶液将pH值调节至5.6,高压灭菌培养基20

分钟在121°C.红色苯胺染料（芝加哥），GA7培养容器，含有50毫升培养基，用于维持苗的培养。这种培养基也被用于白杨生根培养。

苗的培养是除去叶片和顶芽，并把切下的茎水平铺到新的培养基上来维持嫩腋芽每四个星期出现。

所有培养物生长在受控环境室在25°C_+2°C，采用冷白荧光灯50微摩每米每2秒（50g Em 2S）在16 h光照天为一个周期。从叶片外植体芽再生培养基（如上所述）维护培养通过添加BA （1.0毫克/升）和玉米素（ZEA）（1.0毫克/升）。高压灭菌后，冷却至50C,羧苄青霉素（500毫克/升）（抑菌物质）和卡那霉素（60 毫克/升），（选择性抗生素），除菌过滤器，根据需要向培养基中加入。

然后将该培养液分配到100X15毫米的培养皿中（35-40毫升，每盘）。

菌株。根癌农杆菌菌株LBA4404 中是一种非致癌衍生物ACH5 的T-DNA 已被删除（赫克玛等人，1983 ）。该菌株携带一个完整的VIR 区域，并可以调解引入任何T - DNA 存在于植物的细菌进入。? 58 是一个致癌的，胭脂碱生产的应变农杆菌的遗传转化（汉密尔顿和1971 年秋季）。双载体引入pPMG85/587 株LBA4404 和C58 。此质粒携带的变形的T-DNA 中，有三个嵌合基因（图1）。这些基因编码新霉素磷酸转移酶（NPT n '）的抗性对抗生素卡那霉素（Bevan 等人，1983; Fraley等人，1983 ; Herrera的埃斯特雷亚等，1983）,两个并拼接到羧乙基精氨酸合成酶启动子（ocs- NPT n '）（Barker等人，1983）或甘露碱

合成酶启动子（mas-NPT n '）（Barker等人，1983）。第三个基因赋予耐受除草剂草甘膦（Comai 等，1983），并已接合的甘露碱合成酶启动子（主重组质粒中的aroA ）。农杆菌维持在AB 固体基本培养基（Watson 等，1975），补充的情况下，卡那霉素100 毫克/ 1 株含有pPMG85/587 。文化被重新划线每十五天。共培养从新鲜的划线板的单个菌落接种到5毫升MG / L 液体培养基（奇尔顿等，1974 ），在25X150mm 的培养管中，培养过夜。当时过夜培养稀释至合适的浓度（ C 58 / 85 分之587 和C58 ; 2X10 秒菌落形成单位/毫升;应变LBA4404/587/85 : 5-10 X L0小号个菌落形成单位/毫升）的培养物在

550nm处的吸光度的菌株测量细菌浓度。

转化的杨树NC-5339，通过以下方式获得在烟草悬浮培养细胞的存在下

（Horschet人，1985）的根癌农杆菌共培养的叶片段。烟草进纸器板，制备前 2 天，通过移液陪替氏培养皿（100X25毫米），含有50毫升的Murashige最小的有机物介质（KC 生物），补充了2,4-D（0.1 到0.5 毫升的烟草悬浮培养中使用毫克/升）激动素（ 1.0毫克/升）的盐酸硫胺素（0.9毫克/升），酸式磷酸钾（200 毫克/升），Difco 细菌琼脂

（0.8％）。第 2 天，无菌滤纸的培养皿（Whatman 公司 3 毫米）被放置在顶部的烟草细胞。预洗涤滤纸圆片在蒸馏水中，高压灭菌在烟草悬浮介质中（如上所述），但无琼脂的。

烟草细胞悬浮液用于馈线板块维持每周转移10 毫升的细胞——凝聚剂锡安到100毫升新鲜液体培养基。使用的介质为维护烟草细胞悬浮液（描述上图）是相同的培养基，为了在馈线板上划线防治琼脂的遗漏。

烟草器板制备后，杨树叶子获得从无菌苗培养，切成段（~2cm 2），培养基

中培养24小时，在光线不足的条件下，在25°C（10家创业板 2 SL）。叶片段，然后放置到1-5 毫升MG / L 液体培养基中培养：农杆菌菌株C58/587/85，C58 或应变

LBA4404/587/85 稀释到适当的浓度。30 分钟后，叶段涂抹删除

多余的悬浮液用到划线培养48-96小时的细菌。叶片随后被转移到再生培养基中含有羧苄青霉素（500毫克/升）和卡那霉素（60碎布/ 1或0的破布/升）中，如上所述。芽被切除时，他们约1-2 厘米长，从叶腋传播芽如上所述。

杨树nc-5339叶的外植体芽再生率被确定通过得到许多外植体再生芽和通过计算来自其中每个外植体芽发育的数量。这个收集的数据来自两个独立的实验其中每个处理至少有三个平板（每个平板就个外植体）。平均的外植体再生芽和每个外植体再生芽的平均数来计算。平均每个板的百分比值是由一个反正弦进行的。对于每个平均数，其标准偏差和标准误差都要计算（1982年Sincich）。进行一个一个尾随关于总体平均数的t 检验确定控制（不是共培养）和共同栽培的外植体的再生率是否有著差异（1982年Sincic）。

分子量分析。新霉素磷酸转移酶II （NPT H '）赋予抗卡纳霉素可以直接选择转基因植物组织。活性酶II'叶片和嫩枝转化和对照植物的测定采用的Reiss等人的方法。1981 年，通过加入最后清洗。蛋白酶K ，p - 81 离子交换纸冲洗三次解决（1.0 Ixg /毫升）在90°C减少非特异性结合的32 po4磷酸化蛋白。要确定是否野生型的T-DNA在拉力C58表示，胭脂碱进行检测叶片样本和B型芽。胭脂氨酸测定进行了描述和Schilperoort （1978）。

Western印迹分析。Western印迹分析细菌的EPSP合酶的由aroA基因所编码Comai 等描述的。（1985）,除了最初的准备组织提取物。叶组织（0.5 克），用0.2克在液氮中研磨聚乙烯吡咯烷酮polyclar的AT和悬浮在2.0毫升的0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH5.6,含有10mM150毫米氯化钠，EDTA ,0.05% NONIDET P-40 , 25毫克/毫升血清白蛋白，10mM 的二硫苏糖醇，10mM的硫脲，10?的tM亮抑酶肽。

DNA分离和southern的分析。从1g叶片或芽组织通过以下方式DNA提取。组织在液氮中冷冻，用研钵粉碎杵和一个Brinkmann Polytron 匀浆具有7 个10

秒的脉冲在10毫升的核隔离缓冲液（的10mM三异丙基乙磺酰，pH值9.5 , 4 mM的亚精胺，1 mM的精胺，10mM的EDTA，80mM的KCI，0.5 M蔗

糖，10mM的3■巯基乙醇，0.5%的Triton X - 100 ）在0°C过滤。这个混合物被过滤（Calbiochem，Behring）细胞核通过离心（5分钟，3000勺），细胞核分离缓冲液重新悬浮于5ml （5分钟，在300旳）离心并重新悬浮在1.5ml相同的缓冲液中。 1.5 毫升的裂解

缓冲液（0.1 M 的三异丙基乙磺酰，加入pH 值为9.5，40mM 的EDTA ， 2 %肌氨酰，

蛋白酶K 的12 个单位），慢慢混合，

使得细胞核在65C下在此溶液中温育三十分钟一小时。当时此消化染色制备（的10mM Tris，1mM EDTA）中，用TE -饱和轻轻萃取评价苯酚（pH 7.5）中，然后用TE饱和的酚

氯仿（1:1，pH 7.5）中。将水相的调整0.3 M与NH4 醋酸和沉淀两次两倍体积的乙醇。该

DNA，然后再悬浮在10mM的Tris液

（pH8.0）, 10mM的NaCl溶液，并保存在4 C。随后，国家环保总局用EcoRI 消化分离的DNA 评价通过凝胶电泳，印迹到硝酸纤维素杂交单独一个AROA 探头，NPT II '探针和

胭脂碱探头。程序限制二拥塞，凝胶电泳，南航中转和混合动力化，如Maniatis等人所述。

1982）。该探头NPTII和aroA基因合成通过在体外转录质粒pCGN464pCGN1008。这些质

粒包括NPT II基因aroA基因分别克隆PSP 64 SP-6-转录载体（麦尔登等，1984）。建议

由生产商推荐的合成和混合化之后（Promega公司的生物技术公司，麦迪逊，威斯康星

州）。该的T-DNA 的pTiC58 一个的32P标记探针片段的Hind川-23，（Depicker等，

1980）进行

胭脂碱合成酶基因。

结果

再生植株

再生杨树NC - 5339叶外植体获得MS培养基补充1.0mg/lBA和1mg/l玉米素。芽发育

在切断边缘叶外植体后20 - 30天。平均 1 - 3芽发育，由35%的叶外植体而来（表

1）。芽的数量增加与外植体的大小和切割面的数量有关。基于显微观测在发育期间,芽似乎

源自偶然的分生组织而不是体细胞胚胎。花青素生产现场观察发育培养,仅在芽萌发之前。

植物转化

超过30%的外植体农杆菌转化C58/587/85芽的育发在分化培养基上34周内含有卡那霉素60mg/1（表1）。平均四卡那霉素抗性发育每个芽的外植体。对照组织的增长卡那霉素是完全抑制的，在60mg/l （图2）。

明显差异数量的外植体再生芽在非选择性的培养基观察在农杆菌遗传转化共培养（菌株

C58和C58/587/85）和对照（不是共培养）外植体在5%和2.5%水平之间。不仅更多外植

体再生芽种植在共培养后（表1）,但对于C58/587/85芽再生共培养外植体（表1,图。2）是对照外植体的四倍。一致的平均数的差异从观察外植体共培养的再生芽外植体C58与对照外植体；然而，这些差异只是意义上10%