HEK-293细胞 293A 293S 293T 和293FT cell区别比较

HEK-293细胞293A 293S 293T 和293FT cell区别比较

293细胞分为几种，文献上所提总是笼统的讲293细胞，可293有293A,还有293T，请问二者有什么区别，是否293A是用来包腺病毒的，293T是用来包慢病毒的，是否还有其他

293细胞，比如293S

课题需要做腺病毒转染，看了initrogen的说明书上说用293A细胞。在clontech的说明书

上就是293细胞。

293细胞比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。293细胞的一个衍生株：293T/17的转染效率更高，成为广大研究者研究基因功能的一个强大工具。

293细胞的缺陷是生长过程中贴壁强度比较小。所以在实验过程中容易流失，从而影响实验结果。如果一个实验室新得到的293细胞是邮寄得到的并且细胞在培养瓶中，就需要让细胞沉降几天时间，因为大量细胞会漂浮在培养液里。

来源：人体肾脏形态：上皮细胞生长特性：贴壁注释：该细胞含腺病毒5 DNA 。

培养液：MEM（含2 mM L-谷氨酰胺和Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸钠），10% 马血清（热灭活）。

传代：吸去培养液。用0.25% (w/) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。

（以1：2到1：4为宜，传代期间培养液2-3天更换1次）

冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。

293A比较有意思了，是293中后来又建的细胞亚株，这个A是adhere的意思，就是说293倾向于形成单层细胞（monolayer），它比293好的地方是在做计算病毒数量的空斑试验（plaque assay)293A是均匀的一层，没有细胞重叠和细胞空隙（hole），就这个意思，这

个A所对的是293S（suspension).

293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad 5) DNA的永生化细胞，表达转染的腺病

毒5的基因。

293T细胞表达E1A蛋白，S40大T抗原，含有S40复制起始点与启动子区的质粒可以复

制。

293FT细胞能制造高滴度的慢病毒。293A细胞来源于人肾纤维母细胞，组成性表达E1A 和

E1B 蛋白。

髓系_淋巴系细胞

1、造血细胞:造血细胞(hematopoietic cells)广义地分为髓系与淋系两大类。由造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)分化与发育为系定向髓系祖细胞(如CFU-GM,CFU-E,CFU-MK),髓系祖细胞再进一步分化发育为形态上可识别的髓系细胞(myeloid cells)。髓系在广义上包括粒系细胞、红系细胞、巨核系细胞与单核系细胞,就是狭义的造血细胞,而把淋巴系细胞视为非造血细胞(见后)。应该指出,“myeloid cells”这个名词有两个不同含义:一个就是指由髓系前阶段幼稚细胞分化的所有髓细胞;另一个含义就是指粒系细胞,但常用的粒:红比例(myeloid:erythroid ratio)只表示粒、红系细胞增减情况,正常骨髓粒:红比例为1、5-3:1。 ⑴粒系细胞:在关键性调节因子GM-CSF,G-CSF与IL-3与骨髓微环境作用下在骨小梁旁分化,增殖,发育成熟。成熟的粒细胞逐渐向小梁之间移动,所以,随着粒细胞发育分化成熟,组织学上可见越靠近骨小梁的粒细胞越幼稚,形成较窄的2～3层幼稚细胞带,越远离骨小梁越成熟。骨髓标本超微结构也显示未分化幼稚细胞靠近骨小梁(正常早期粒系生成的部位),支持这些的前体细胞来自骨内膜细胞。如出现原始粒细胞丛(3个)或簇(5个)远离骨小梁时,则称之为“幼稚前体细胞异常定位”(abnormal localization of immature precursor,ALIP )(图3)。(1) 粒系细胞有6个发育阶段,3个系列,即中性粒细胞,嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞:图3 骨髓活检组织小梁之间幼稚前体细胞异常定位(ALIP)。视野中央可见 4个原始粒细胞。塑料切片 H-Giemsa-E 400×①原始粒细胞( myeloblast):在组织切片中原始粒细胞胞体中等大小,胞浆较少,嗜碱性,无颗粒。胞核呈圆形或卵圆形,有1～多个核仁,核膜厚,染色质淡染。表达CD34+,CD33+,CD13+,HLA-DR+。这类细胞数目较少。②早幼粒细胞( promyelocyte ): 形态学上基本上与前者相似,主要区别在于胞浆中出现粉红色细颗粒,胞核呈圆形或椭圆形,居中或偏位。有核旁空晕及高尔基氏器区,染色质开始聚集,表达CD33+,CD13+,CD15+,CD34-,HLA-DR-。因嗜碱性颗粒溶于水,在切片上不能分辨出嗜碱性粒细胞(basophil)。嗜酸性粒细胞(eosinophil)从早幼阶段到成熟阶段,胞核形态变化与嗜中性粒细胞一致,胞浆充满粗大橘黄色的颗粒就是其特点。过敏性疾病嗜酸细胞可明显增多,急性与慢性嗜酸细胞白血病可见较多早幼嗜酸细胞。③中幼粒细胞(myelocyte)及晚幼粒细胞(metamyelocyte):随着细胞发育成熟,胞浆嗜中性颗粒明显增多,核仁消失,核分裂停止,染色质逐渐增多,胞核形状由半圆形(中幼粒细胞)发育成肾形。 ④晚幼粒细胞,胞核比中幼粒小,最后形成杆状(bandform)及分叶核粒细胞(segmented form)释放入外周血或进入组织。 (2)红系细胞:红系细胞造血虽然没有粒系细胞造血那样复杂,但调节过程也就是很复杂的,除生长因子(GM-CSF 、IL-3与IL-11)外,主要就是红细胞生成素(EPO),它就是一种诱导定向的红系祖细胞增殖发育成熟的蛋白质,就是由肾细胞对缺氧反应而产生的糖蛋白,对红系祖细胞起着促分裂及生存的作用。EPO受体在原始红细胞上很多,但在成熟红细胞上缺乏。血红蛋白与肿瘤坏死因子起负反馈调节,使骨髓微环境减少红系细胞生成,红系中最不易识别的幼稚红细胞就是原始红细胞,这些幼稚红细胞表达转铁蛋白受体与血型糖蛋白A。LCA与转铁蛋白受体抗原表达随着红细胞成熟而下降,血型蛋白表达仍很高。只有中幼以上阶段红系细胞有核分裂能力,网织红细胞通过骨髓窦壁内皮细胞进入血液循环,成为

FuGENE 转染流程

FuGENE HD真核细胞转染流程 FuGENE HD Transfection Reagent Quick Protocol.pdf FuGENE HD Transfection Reagent.pdf 1.细胞和质粒的准备 ①将约5-10×105A549细胞接种于6孔细胞板中，用含10%小牛血清的F-12k 培养过夜，约60%~80%铺满时用于转染。 注：一般荧光试验细胞稀一点为宜；WB试验细胞密一点为宜 ②转染时所用质粒均用转染专用质粒抽提试剂盒无菌提取，抽提后测定其浓度 和纯度，浓度在0.1μg/μL以上且纯度在1.8±0.5 (OD260/OD280)的质粒用于转染，质粒提取的具体步骤按说明书提供的方法进行。（注：质粒浓度测定未必可行，需同时进行酶切和PCR鉴定方可。） ③按照转染剂量，计算质粒使用浓度 2.转染流程 注：由于不同转染试剂对质粒大小、性质、转染量、细胞的种类有很强的特异性，必须谨慎选择转染试剂。以多次转染成功使用的转染试剂为佳。 ①将培养板中的上清弃去，用细胞用无抗无血清F12K洗涤三次后，每孔加入 800ul 无抗无血清F12K。 ②取出FuGENE HD转染试剂，使其温度上升到室温。 ③计算好质粒、转染试剂、以及无抗无血清F12K的量，最终液体总量为100 ul。 准备好无菌指形管，按计算结果加入90-98ul的无抗无血清F12K，加入2ug 质粒，振荡器混匀；随后加入6ul FuGENE HD转染试剂，立即震荡混匀（转染试剂加入时不能沾到管壁上！） ④室温静置7-12分钟后，将质粒：转染试剂混合液均匀滴加在细胞平板孔中， 吹打混匀或者震荡混匀。放入37℃培养箱孵育。

活性氧简介及其产生

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是一类化学性质活泼，具有较高氧化活性的分子或离子的总称。主要包括超氧阴离子、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(HO.)、一氧化氮(NO.)等。线粒体是ROS的主要产生部位，在线粒体呼吸过程中会有少量的电子从线粒体电子传递链复合体Ⅰ和Ⅲ中漏出，与O2结合生成ROS。此外NADPH氧化酶和过氧化物酶等也能产生ROS。过量的ROS会对蛋白质、核酸和脂质等生物大分子造成损伤，从而影响其正常生理生化功能。生物体本身存在清除ROS的体系，包括SOD酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、抗坏血酸等，这一体系使生物体内ROS保持在对机体无害的水平。 活性氧(ROS)的产生 由镉和硒等离子的释放所引发的毒性，在某种程度上可以通过壳对核的保护来得以控制，但是活性氧产生的毒性却难以控制。当细胞暴露于病原体或者热等不良环境压力时，会产生具有化学活性的含氧分子。这些活性氧物质(ROS)可被分为两种类型：自由基ROS（一氧化氮或者羟基自由基）和非自由基ROS（过氧化氢）。大多数细胞都可以通过谷胱甘肽氧化还原系统的防御机制来缓冲一定量的ROS，但是高水平长时间的ROS会导致细胞的损伤。当把培养细胞暴露于纳米粒子时，活性氧的产生是一个普遍现象，ROS的产生主要源于纳米粒子的反应能力[123, 124]。纳米粒子巨大的比表面积和表面分子较高的反应活性使得其具有较高的氧化能力。一般说来，纳米粒子可以通

过以下几种不同的机制产生ROS[125]： (1)当被暴露于酸性环境（例如溶酶体）中，纳米材料表面修饰物的 反应活性、表面修饰物的降解、量子点降解而导致的离子释放，均会引起ROS水平的升高(图[126-128]。 (2)纳米粒子与线粒体等具有氧化能力的细胞器发生相互作用，破坏线粒体外膜，导致线粒体膜电势的坍塌，因此干扰氧化磷酸化的电子传递链 (3)纳米粒子和NADPH氧化酶等氧化还原性蛋白的相互作用，引起细胞免疫系统中活性氧水平的增加(图。 (4)纳米粒子与细胞表面受体发生相互作用，激活细胞内的信号通道，最终导致能够上调ROS水平的应激反应基因的大量表达(图。 此外，量子点在光照下也会产生ROS。Ipe等人通过EPR实验研究了几种不同的量子点在光照下能否产生ROS[132]。结果表明CdS粒子产生了超氧化物的信号和一个较小的羟基自由基的信号，CdSe只产生了 羟基自由基，CdSe/ZnS未产生任何自由基的信号，以上结果说明带隙能垒会阻止载流子到达粒子表面，从而抑制自由基的形成。没有光照射时，以上材料均无法产生ROS。 虽然镉离子的释放被认为是量子点细胞毒性的主要因素，表面修饰物、保护性壳层和无镉量子点的制备，都是为了减少镉离子的释放和促进量子点在生物医药领域的应用。但是，量子点的毒性不能单一的归因于镉离子的毒性，ROS等其它因素不能被忽略，在无镉量子点中，这些因素可能会起主要作用。例如, Tang等[133]发现未修饰的CdSe量子

巨核细胞系统总结

巨核细胞系统总结 1.原始巨核细胞（megakaryoblast）：15～30μm，胞体圆形或不规则形，核大，呈圆形或不规则形，核染色质较其他原始细胞粗，呈粗网状或细条索状结构，染深紫红色，核仁2～3个，淡蓝色，不清晰，不规则；胞浆量较少，不均匀，不规则，染深蓝色，无颗粒。 2.幼稚巨核细胞（promegkaryocyte）：30～50μm，外形不规则，核亦不规则，有重叠，可扭转呈肾形或分叶状，核染色质呈粗颗粒或粗网状或局部浓集呈小块状，排列紧密，核仁可有可无；胞浆量增多，医学|教育网搜集整理常有伪足状突出，染蓝色或浅蓝色，在近核处出现或多或少的很细小红色嗜天青颗粒。 3.巨核细胞（megakarycyte） ①颗粒型巨核细胞：40～70μm，可达100μm，外形不规则，核较大，形态不规则，多呈分叶状，核染色质较粗糙，排列紧密呈团块状，紫红色，无核仁；胞浆量丰富，染粉红色，夹杂有蓝色，内含大量细小红色颗粒，常聚集呈簇，但无血小板形成。 ②产板型巨核细胞：40～70μm，可达100μm，形态大致与颗粒型巨核细胞相似，唯有不同的一点是胞浆内充满细小的红色颗粒及数量不等的血小板。 ③裸核型巨核细胞：是产板型巨核细胞的胞浆解体后，释放出大量血小板，仅剩一个细胞核，称之为裸核。 4. 血小板（platelet）：胞体很小，2～4μm，呈圆形、椭圆形，逗点状，不规则形，中心部位有细小紫红色颗粒，无细胞核，涂片上血小板常三五成群堆集出现。 胆色素肝肠循环概述-临床检验技师 又称为肠肝循环（enterohepticcycle）。指经胆汁或部分经胆汁排入肠道的药物，在肠道中又重新被吸收，经门静脉又返回肝脏的现象。此现象主要发生在经胆汁排泄的药物中，有些由胆汁排入肠道的原型药物如毒毛旋花子苷G，极性高，很少能再从肠道吸收，而大部分从粪便排出。有些药物如氯霉素、酚酞等在肝内与葡萄糖醛酸结合后，水溶性增高，分泌人胆汁，排入肠道，在肠道细菌酶作用下水解释放出原型药物，又被肠道吸收进入肝脏。动物实验显示，抗菌药物抑制肠道细菌后，可降低某些药物的肝肠循环。肝肠循环可使药物在体内停留时间延长，延长多少取决于进入肝肠循环的量与给药量的比例。 肠道中约10%～20%的胆素原可被肠道粘膜细胞重吸收，经门静脉入肝。其中大部分再随胆汁排入肠道，形成胆素原的肝肠循环（bilinogenenterohepaticcirculation）。只有少量经血液循环入肾并随尿排出。正常人每日随尿排出约0.5～4.0mg 胆素原。胆素原接触空气后被氧化成尿胆素，后者是尿的主要颜色。游离胆红素经肝转化生成的葡萄醛酸胆红素随胆汁进入肠道，在回肠末端和结肠内细菌作用下，脱去葡萄醛酸，并还原生成胆素原（包括d-尿胆素原，中胆素原，粪胆素原）。在肠道下段，这些无色的的胆素原接触空气后被氧化成胆素（相应的为d-尿胆素，i-尿胆素和粪胆素）。胆素呈黄褐色，是粪便的主要颜色医学|教育网。当胆道完全梗阻时，因胆红素不能排入肠道形成胆素原和进而形成胆素，所以粪便呈现灰白色。新生儿的肠道细菌稀少，粪便中未被细菌作用的胆红素使粪便呈橘黄色。 血清胰蛋白酶检测的意义 血清胰蛋白酶虽然胰液中含有大量的胰蛋白酶，正常时却很少进入血循环，健康人血清中存在的主要为游离胰蛋白酶原～1，没有游离的胰蛋白酶。 急性胰腺炎时，血清胰蛋白酶和淀粉酶平行升高，其峰值可达参考值上限的2～400倍，两种胰蛋白酶的分布和急性胰腺炎的类型及严重程度有关。轻型者80%～99%为游离胰蛋白酶原～1及极少的结合型的胰蛋白酶～1；医学教育网|搜集整理而重型者游离胰蛋白酶原～1可低到胰蛋白酶总量的30%，大部分以结合形式存在，它可以和α1～抗胰蛋白酶或α2～巨球蛋白结合。 由于有上面所说的临床意义，许多人都想把血清胰蛋白酶测定用于胰腺疾病诊断，但因为血

流式细胞仪入门

流式细胞仪入门 ----- 秦华 译

目录 前言 第1章综述 第2章液流系统 第3章散射光信号及荧光信号 3.1 散射光信号 3.2 荧光信号 第4章光电系统 4.1 光平台 4.2 光学滤片 4.3 信号探测器 4.4 阀值 第5章数据分析 5.1 数据采集及显示 5.2 设门 5.3 细胞亚群的数据分析 5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析第6章分选 6.1 分选 第7章激光器及光路校正 7.1 激光器的工作原理 7.2 光路校正 第8章习题答案

序论 学习仪器的最好方法是操作仪器，然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。 本书介绍了流式细胞仪的基本知识，并从不同角度详尽阐述了各种台式机（FACScan TM，FACSort TM，FACSCalibur TM，和BD LSR）与大型机（FACS Vantage TM，FACSVantage TM SE，和FACStar PLUSTM）之间的不同，且附习题及答案。阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。

第一章综述 流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。 流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。其作用如下： z液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。 z光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。 z电系统：把光信号转换为电信号。对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。 在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。 单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模式（List mode）完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行分析。

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

lipo2000转染操作步骤

Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考 **：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。

siRNA细胞转染实验操作指南

siRNA细胞转染实验操作指南 siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。 下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。 1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。接种时尽量 保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。 注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。 2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物: （1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。（*siRNA的用量计算参照表1） （2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。注意孵育时间不能超过25min。 （3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。 表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表 3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。 注意：转染前无需更换新鲜培养基，直接将复合物加到原细胞培养基中即可。如有需要，也可根据情况更换培养基优化该步骤。 4.如果需要进行其他特殊处理，如加药等，可在此时进行。 5.将细胞培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24-72h。具体培养时间根据细胞生长特性、实验目的进行调整。 注意：加入siRNA-Lipofectamine 2000复合物后一般无需更换培养基，但若脂质体类转染试剂对细胞毒性较大，可根据细胞的状态，在转染4-6小时后更换培养基。 6.进行后续总RNA提取、蛋白提取、细胞活性分析等实验。

髓系淋巴系细胞

1.造血细胞：造血细胞(hematopoietic cells)广义地分为髓系和淋系两大类。由造血干细胞(hematopoietic stem cell， HSC)分化和发育为系定向髓系祖细胞(如CFU-GM，CFU-E，CFU-MK)，髓系祖细胞再进一步分化发育为形态上可识别的髓系细胞(myeloid cells)。髓系在广义上包括粒系细胞、红系细胞、巨核系细胞和单核系细胞，是狭义的造血细胞，而把淋巴系细胞视为非造血细胞(见后)。应该指出，“myeloid cells”这个名词有两个不同含义：一个是指由髓系前阶段幼稚细胞分化的所有髓细胞；另一个含义是指粒系细胞，但常用的粒：红比例(myeloid:erythroid ratio)只表示粒、红系细胞增减情况，正常骨髓粒：红比例为1.5-3：1。 ⑴粒系细胞：在关键性调节因子GM-CSF，G-CSF和IL-3和骨髓微环境作用下在骨小梁旁分化，增殖，发育成熟。成熟的粒细胞逐渐向小梁之间移动，所以，随着粒细胞发育分化成熟，组织学上可见越靠近骨小梁的粒细胞越幼稚，形成较窄的2～3层幼稚细胞带，越远离骨小梁越成熟。骨髓标本超微结构也显示未分化幼稚细胞靠近骨小梁(正常早期粒系生成的部位)，支持这些的前体细胞来自骨内膜细胞。如出现原始粒细胞丛(3个)或簇(5个)远离骨小梁时，则称之为“幼稚前体细胞异常定位”(abnormal localization of immature precursor,ALIP )(图3)。(1) 粒系细胞有6个发育阶段，3个系列，即中性粒细胞，嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞：图3 骨髓活检组织小梁之间幼稚前体细胞异常定位(ALIP)。视野中央可见 4个原始粒细胞。塑料切片 H-Giemsa-E 400×①原始粒细胞( myeloblast)：在组织切片中原始粒细胞胞体中等大小，胞浆较少，嗜碱性，无颗粒。胞核呈圆形或卵圆形，有1～多个核仁，核膜厚，染色质淡染。表达CD34+，CD33+， CD13+，HLA-DR+。这类细胞数目较少。②早幼粒细胞( promyelocyte )：形态学上基本上与前者相似，主要区别在于胞浆中出现粉红色细颗粒，胞核呈圆形或椭圆形，居中或偏位。有核旁空晕及高尔基氏器区，染色质开始聚集，表达CD33+，CD13+，CD15+，CD34-，HLA-DR-。因嗜碱性颗粒溶于水，在切片上不能分辨出嗜碱性粒细胞(basophil)。嗜酸性粒细胞(eosinophil)从早幼阶段到成熟阶段，胞核形态变化与嗜中性粒细胞一致，胞浆充满粗大橘黄色的颗粒是其特点。过敏性疾病嗜酸细胞可明显增多，急性与慢性嗜酸细胞白血病可见较多早幼嗜酸细胞。③中幼粒细胞(myelocyte)及晚幼粒细胞(metamyelocyte)：随着细胞发育成熟，胞浆嗜中性颗粒明显增多，核仁消失，核分裂停止，染色质逐渐增多，胞核形状由半圆形(中幼粒细胞)发育成肾形。④晚幼粒细胞，胞核比中幼粒小，最后形成杆状(bandform)及分叶核粒细胞(segmented form)释放入外周血或进入组织。 (2)红系细胞：红系细胞造血虽然没有粒系细胞造血那样复杂，但调节过程也是很复杂的，除生长因子(GM-CSF 、IL-3和IL-11)外，主要是红细胞生成素(EPO)，它是一种诱导定向的红系祖细胞增殖发育成熟的蛋白质，是由肾细胞对缺氧反应而产生的糖蛋白，对红系祖细胞起着促分裂及生存的作用。EPO受体在原始红细胞上很多，但在成熟红细胞上缺乏。血红蛋白和肿瘤坏死因子起负反馈调节，使骨髓微环境减少红系细胞生成，红系中最不易识别的幼稚红细胞是原始红细胞，这些幼稚红细胞表达转铁蛋白受体和血型糖蛋白A。LCA和转铁蛋白受体抗原表达随着红细胞成熟而下降，血型蛋白表达仍很高。

细胞转染技术原理及应用

细胞转染技术原理及应用 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿 孔法，脂质体法各有利弊 近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂 的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。 线型PEI（Line PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性 低，但转染效率却较高。 GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。

活性氧检测试验方案

活性氧检测试验方案 一：实验原理 活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物(compound mixture),浓度为50mg/ml。二：实验步骤 ⑴取20 ul DCFH-DA（试剂盒有100ul)按照1:1000用无血清培养液即20ml稀释DCFH-DA，使 终浓度为10微摩尔/ 升。 ⑵吸取12ml细胞培养液（细胞浓度为一百万至二千万/毫升）加入24孔板中（设3个阳性对照， 3个浓度梯度分别做3个重复，每孔加入1ml细胞培养液），放入细胞培养箱中培养。 ⑶培养24小时后去除细胞培养液，每孔加入稀释好的DCFH-DA 1ml （加入的体积以能充分 盖住细胞为宜）。 ⑷ 37℃细胞培养箱内孵育20分钟。

⑸去除孵育后的DCFH-DA稀释液，每孔加入1ml无血清细胞培养液洗涤细胞（重复洗涤三次， 以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA）。洗涤完后每孔加入1ml细胞培养液。 ⑹在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前荧光的强 弱即OD值。 ⑺实验组中每孔加入已配制好的松茸多糖20ul(浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml), 对照组中加入阳性对照物Rosup 20ul，放入细胞培养箱内继续培养。 ⑻4小时后，在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激后 荧光的强弱即OD值。 三：数据处理 实验组：癌细胞活性氧降低率=（刺激前OD值－刺激后OD值)/刺激前OD值×100% 阳性对照组：癌细胞活性氧升高率=（刺激后OD值－刺激前OD值)/刺激前OD值×100% 四：注意事项 ⑴探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

流式细胞仪的基本结构

流式细胞仪主要由以下五部分构成：流动室及液流驱动系统；激光光源及光束形成系统：光学系统；信号检测与存储、显示、分析系统；细胞分选系统(图4-3)。 1．流动室和液流系统是流式细胞仪的核心部件。流动室由样品管、鞘液管和喷孔等组成。常用石英等透明、稳定的材料制作。样品管储放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘液包绕通过流动室内的一定孔径的孔。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞啦单行排列依次通过激光检测区。为了保证液流速度稳定。一般限制液流速度小于10 m／s。流动室孔径有60 μm、100μm、150μm、250 μm等多种。 2．激光源和光学系统经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488nm，此外可配备氦氖离子气体激光管(波长633nm)和(或)紫外激光管。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。氩离子激光器的发射光谱中，绿光 514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80％；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料作为激光器泵浦的一种成分，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodanline 6G水溶液的染料激光器，则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。 为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔的将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚

细胞转染的操作步骤

细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

活性氧检测试剂盒 Reactive oxygen species assay kit使用说明

活性氧检测试剂盒Reactive oxygen species assay kit使用说明 货号：CA1410 规格：100-500T 产品内容： 10mM DCFH-DA in DMSO0.1ml?20oC保存 活性氧供体1ml?20oC保存 说明书1份 产品简介： 活性氧(Reactive oxygen species,ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物(O2??,H2O2,?OH,ONOO?,?NO)等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。采用2,7-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)是迄今最常用、最灵敏的细胞内活性氧检探针。DCFH-DA没有荧光，进入细胞后被酯酶水解为dichlorofluorescin(DCFH)。在活性氧存在时DCFH被氧化为不能透过细胞膜的强绿色荧光物质dichlorofluorescein(DCF)，其荧光在激发波长502 nm，发射波长530nm附近有最大波峰，强度与细胞内活性氧水平成正比。此活性氧检测系统本底低，灵敏度高，重复性好，操作简便。 本试剂盒适于荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等图像检测，荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪定量ROS检测。 工作波长： 最佳激发波长500、485(500±15nm)，最佳发射波长525(530±

20nm)。也可按照FITC荧光检测条件检测。 操作步骤： 一、试剂准备： 1.DCFH-DA可稀释于培养基或缓冲液中。血清或培养基颜色并不影响DCFH-DA及细胞内荧光产生，但可能会影响荧光显微镜观察，干扰荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪荧光测定。可将DCFH-DA稀释于无酚红培养基或适宜的缓冲液如PBS中。这依赖于使用何种荧光设备进行测定。 2.加入DCFH-DA的时机或孵育时间，以最终能顺利检测细胞内活性氧为目的。药物处理时间较短(<2小时)或预计ROS效应较弱，可先加或同时加入DCFH-DA。反之，treat刺激时间较长(>6小时)或预计产生ROS效应较强，可后加DCFH-DA。 3.活性氧供体含高纯度12mM H2O2。加入细胞后其本身即是一种活性氧，而且在代谢过程中可产生其它类型的活性氧，均可使DCFH-DA氧化为DCF呈现强绿色荧光。因而，用户可使用该试剂作为测试实验系统或仪器的阳性试剂，以初步观察细胞活性氧所产生的荧光的一般特征，并且也可以将该实际作为实验的一个阳性对照。推荐该试剂的细胞工作浓度为20~100μM 或更低浓度，但超过200μM将产生细胞毒。如果用户熟悉ROS荧光或实验没有必要采用阳性对照，可以不加该试剂。 二、加入荧光探针： 1.加入DCFH-DA于培养基，推荐初始工作浓度为10μM。对不同的细胞和处理，DCFH-DA工作浓度可为100nM~20μM，需进行预实验确定合适的浓度。总体稀释倍数应在1:500~1000以上以避免DMSO对细胞的影响。以DMSO作为溶剂对照。

最详细的流式细胞仪实验方法

流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病

第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix

加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参