二甲双胍联合5-FU抑制结肠癌细胞生长的实验研究

二甲双胍联合5-FU抑制人结肠癌细胞SW620生长的实验研究

张艳飞薛耀明江颖娟张倩高方

【摘要】目的研究联合应用二甲双胍能否增强化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）对人结肠癌细胞株SW620的抑制作用。方法体外培养人结肠癌细胞株SW620，以5-FU联合或不联合二甲双胍干预细胞，MTT法检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞周期及凋亡以及CD133+细胞比例。结果二甲双胍能够增强5-FU对细胞增殖的抑制作用，5-FU联合二甲双胍干预的细胞与单独应用5-FU干预的细胞相比，细胞周期S期比例降低，早期及晚期凋亡率增加，CD133+细胞比例降低。结论二甲双胍与5-FU联合应用对人结肠癌细胞具有协同抑制作用。

【关键词】二甲双胍；结肠癌；5-氟尿嘧啶

Experimental study of metformin combined with 5-FU inhibits the growth of colon cancer cell SW620

ZHANG Yan-fei, XUE Yao-ming, JIANG Ying-juan, et al. Department of Endocrinology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

Corresponding author: XUE Yao-ming, E-mail: xueyaoming999@https://www.sodocs.net/doc/aa4861391.html,

【Abstract】Objective To investigate whether the combination of metformin can enhance the inhibitory effect on human colon cancer cell line SW620 of the chemotherapy drug 5-fluorouracil (5-FU). Methods SW620 cells were treated with 5-FU alone or in combination with metformin. The proliferation of the cells was assessed by MTT assay, and the cell cycle, apoptosis rate and the sensitivity of CD133+cells changes were analyzed by flow cytometry. Results Metformin can enhance the inhibitory effect of 5-FU on cell proliferation. Compared with the cells treated with 5-FU alone , the proportion of cells in S phase and CD133+ cells was reduced and apoptosis induction was increased. Conclusions Metformin and 5-FU have a synergistic anti-proliferation effect in human colon cells.

【Key words】Metformin; colon cancer; 5-Fluorouracil

结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，以5-FU为基础的化疗已经有效的降低了结直肠癌患者的死亡率，但是由结直肠癌耐药引起的复发和转移仍然是进一步提高疗效的主要障碍。研究显示降糖药物二甲双胍可以显著降低合并2

基金项目：糖尿病防治中心国际合作研究项目（编号：206403）；广东省药学会科学研究基金（编号：2010C07）作者单位：510515 广州南方医科大学南方医院内分泌代谢科

通讯作者：薛耀明，E-mail：xueyaoming999@https://www.sodocs.net/doc/aa4861391.html,

作者简介：张艳飞（1981-），女，在读博士研究生，医师，主要研究领域为2型糖尿病的防治

型糖尿病的结直肠癌患者的发病率及死亡率[1-6]，但是其具体机制尚未明确。本实验通过检测人结肠癌细胞株SW620经5-FU联合或不联合二甲双胍处理48h 后，细胞增殖、周期、凋亡以及CD133+细胞比例的改变，初步探讨二甲双胍与5-FU联合应用是否具有协同作用，能否提高5-FU的抗瘤效应。

1.材料与方法

1.1实验材料

（1）主要试剂：二甲双胍（sigma公司），二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司），细胞周期检测试剂盒（碧云天公司），Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天公司），CD133抗体（德国美天旎公司）。

（2）主要仪器ECO2150型二氧化碳细胞培养箱（new Brunswick scientific），FACSCalibur 型流式细胞仪（美国BD公司），全自动酶标仪ELX800NB （美国BIOTEK公司）。

1.2试验方法

1.2.1.细胞培养SW620细胞培养于37℃、5% CO2、10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI1640完全培养基中。

1.2.2.MTT法测细胞生存能力将处于对数生长期的SW620细胞胰酶消后，按照2×105接种于96孔板，细胞贴壁后以无血清培养24h，将细胞分为三组：（1）阴性对照组：用不含药物的培养基培养；（2）5-FU组：用含有25mg/L 5-FU的培养基培养细胞；（3）联合用药组：用含有10 mmol/L二甲双胍+25mg/L 5-FU的培养基培养细胞，每组设5个复孔。每隔24h换一次液，培养48h后，用快速翻转法倒掉原培养基，每孔加入无血清的RPMI1640培养液200 μl，及5 mg/ml的MTT 20 μl，继续培养4 h，吸出液体，每孔加入DMSO 150 μl,室温孵育10 min，微振荡器振荡15 min，用BiolRad酶联免疫检测仪在570 nm波长测吸光度（A）值，以仅含有150μl DMSO 的空白孔调零。

1.2.3.流式细胞仪测细胞周期将处于对数生长期的SW620细胞胰酶消后，按照2×105接种于6孔板，细胞贴壁后以无血清RPMI 1640 培养基培养24h，分别以25mg/L 5-FU ，10mmol/L二甲双胍+25mg/L 5-FU干预细胞，以不加药物组作为对照组，48h后消化成单细胞，PBS 洗 2 遍后收集细胞，预冷的75% 乙醇4℃固定过夜，PBS 洗2遍，离心弃PBS，加入PI染液（碘化丙啶及RNase A 终浓度

均为50 μg/mL），避光染色30min，流式细胞仪测细胞周期。

1.2.4.Annexin Ⅴ-FITC 和PI 双染法检测细胞凋亡将处于对数生长期的SW620细胞胰酶消后，按照2×105接种于6孔板，细胞贴壁后以无血清RPMI 1640 培养基培养24h，分别以25mg/L 5-FU ，10mmol/L二甲双胍+25mg/L 5-FU干预细胞，以不加药物组作为对照组，48h后消化成单细胞，PBS 洗 2 遍后收集细胞，加入500μl 的Binding Buffer 悬浮细胞，加入5μl Annexin V-FITC 混匀后，加入5μl Propidium Iodide 混匀，室温、避光条件下反应15min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5.流式细胞仪检测SW620细胞CD133的表达将处于对数生长期的SW620细胞胰酶消后，按照2×105接种于6孔板，细胞贴壁后以无血清RPMI 1640 培养基培养24h，分别以25mg/L 5-FU ，10 mmol/L二甲双胍+25mg/L 5-FU 干预细胞，以不加药物组作为对照组，48h后消化成单细胞，收集单个细胞混悬液（约107个细胞），溶于80ulPBS缓冲液中饭，加入20ul封闭液（含1%FBS 的缓冲液），与anti-CD133 (AC133)10ul或者异构体对照(mouse IgG1 -APC)10ul，混合40C下染色30分钟，PBS洗脱后，流式细胞仪检测CD133阳性细胞的比例。

1.2.6.统计学方法采用SPSS16.0统计软件进行处理，各指标数据采用均数±标准差表示，各组均数比较采用方差分析（One-way ANOV A），多重比较采用LSD法（Least-significant difference test），P <0.05被认为差异具有统计学。

2.结果

2.1细胞增殖能力5-FU联合甲双胍较单独应用5-FU对结肠癌SW620细胞的抑制作用更强，两组之间的差异具有统计学意义（p=0.008，图1）。说明联用二甲双胍能够增化疗药物5-FU对人结肠癌细胞SW620的抑制作用。

图1. MTT法测细胞增殖能力

2.2细胞周期检测5-FU联合甲双胍干预与单独应用5-FU干预的细胞相比，S 期细胞比例显著降低（p<0.05，图2），G0/G1，G2/M期细胞比例无显著差异。

图2. 药物对细胞周期的影响

2.3细胞凋亡检测5-FU联合甲双胍干预与单独应用5-FU干预的细胞相比，细胞早期凋亡率及晚期凋亡率均显著降低，差异具有统计学意义（p<0.05，图3）

图3. 药物对细胞凋亡的影响

2.4流式细胞仪检测SW620细胞CD133的表达未加药物处理的SW620细胞CD133+细胞比例为27.633±2.577 ；单用5-FU作用48小时后CD133+细胞比例为21.300±1.400 ；5-FU联合二甲双胍处理48h后CD133+细胞比例为

17.161±2.311。5-FU联合甲双胍干预与单独应用5-FU干预的细胞相比，CD133+细胞比例显著下降，差异具有统计学意义（p<0.05，图4）。

图4. 药物对CD133+细胞比例的影响

3.讨论

二甲双胍作为一种有效的降糖药物,已经广泛应用于2型糖尿病患者的治疗。队列研究发现2型糖尿病患者结肠癌的发病率是非糖尿病患者的2倍，而口服二甲双胍的糖尿病患者结肠癌的发病率与非糖尿病患者一致[5]。患有结直肠癌的糖尿病患者，在结肠癌术后口服二甲双胍与其它降糖方案相比，总的死亡率及结肠癌相关的死亡率均显著降低[6]。Hosono K等[7]通过临床研究发现，结肠镜检有结肠变性隐窝病灶（癌前病变）的患者口服二甲双胍（250mg/d）1个月后，病灶数目显著减少，且肠上皮细胞增殖能力下降。

二甲双胍抗癌作用的机制尚不完全清楚，目前的研究多认为与其发挥降血糖作用的机制相关。二甲双胍作为一种胰岛素增敏剂，可以降低机体的胰岛素抵抗、改善高胰岛素血症，有助于抑制肿瘤的发生、发展。然而，二甲双胍对体外培养的肿瘤细胞生长的抑制作用，提示该药物本身存在着直接的抗肿瘤活性。研究显示，二甲双胍可以有效激活AMPK及其下游通路，使肝脏糖异生减少，同时增加外周组织对糖的摄取和利用，从而降低血糖[8-9]。AMPK与体内多种信号传导通路相关，包括mTOR通路、p53/p21途径、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路及脂肪酸和蛋白质代谢相关通路的调控，阻断细胞内蛋白质的合成，引起细胞生长停滞，促进细胞凋亡[10-14]。近年来，在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌等的研究显示，二甲双胍可以特异性杀伤对常规化疗药物耐药的肿瘤干细胞，抑

制肿瘤干细胞的产生，可以作为一种非毒性的抗肿瘤药物，与常规化疗药物发挥协同作用[15-21]。然而，其具体机制尚不明确，且在结肠癌中尚未见相关报道。

5-FU广泛应用于消化道恶性肿瘤的化学治疗，由于它疗效确切，一直处于其他化疗药无法替代的地位，但一些结肠癌病例对5-FU为主的化疗并不敏感，其对5-FU单药治疗的有效率仅20％[22]。研究发现，对5-FU耐药的细胞多属于肿瘤干细胞群[23-26]。2007年，O’Brien CA 等[27]在裸鼠体内运用肾被膜移植实验鉴定了人类直肠癌的起始细胞(CC-IC)，纯化实验证实所有的CC-ICs是CD133+。Todaro等[28]报道在21例结肠癌组织中CD133表达为0.3%-3%, CD133+细胞能通过自分泌IL-4保护这些细胞免于凋亡以及抵抗常规治疗。SW620细胞取自结肠癌患者一年后的淋巴结转移瘤，其对化疗药物氟尿嘧啶、奥沙利铂、替尼泊苷具有很强的耐药性[29]。SW620细胞中既存在CD133+细胞又存在CD133-细胞，两种细胞相比，CD133+细胞的体内、体外增殖能力，裸鼠皮下成瘤率、以及β-catenin蛋白的表达均强于CD133-细胞[30]。CD133的定量分析显示：SW620细胞中CD133阳性表达细胞群的生物学特性类似于肿瘤干细胞[31]。

本研究发现联合应用二甲双胍后，5-FU抑制人结肠癌细胞SW620增殖的作用明显增强，且细胞周期检测发现进入S期的细胞比例较单独使用5-FU显著减少，细胞早期及晚期凋亡率也显著增加，说明联用二甲双胍，可以增强5-FU对结肠癌细胞的杀伤作用。文献报道5-FU不能杀伤结肠癌干细胞，5-FU增加细胞内CD133阳性细胞比例[32]，本实验发现5-FU作用后细胞内CD133+细胞比例是下降的，考虑是由于5-FU作用时间较短有关。本研究还发现二甲双胍与5-FU 联用后，细胞内CD133+ 细胞比例较单独使用5-FU显著降低，说明二甲双胍与5-FU在杀伤CD133+ 细胞方面具有协同作用。

综上所述，联合应用二甲双胍能够增强常规化疗药物5-FU对人结肠癌细胞的杀伤作用，为二甲双胍是否能够作为新的辅助治疗方法，改善5-FU耐药引起的结肠癌复发和转移，提高结肠癌患者的生存率提供一定的理论依据。

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