实验六马铃薯多酚氧化酶制备和化学性质

实验六马铃薯多酚氧化酶制备和化学性质

一、实验目的

1、学习从组织细胞中制备酶的方法。

2、掌握多酚氧化酶的作用和化学性质。

二、实验原理

多酚氧化酶是一种含铜的酶，其最适pH值为6-7。由多酚氧化酶催化的反应，如以邻苯二酚为底物，可以被氧化形成邻苯二醌。由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液的颜色的变化鉴定，这个反应在自然界中是常见的，如去皮的马铃薯和水果变成褐色就是由于该酶作用的结果。

多酚氧化酶的最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）。间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，它们也可以被氧化为各种有色物质。

三、实验器材

1、实验仪器

匀浆机，离心机，冰箱，恒温水浴，烧杯，三角瓶，漏斗，小刀，纱布，

2、材料与试剂

1）马铃薯

2）0.1mol/L的NaF溶液：将4.2g氟化钠溶于1000mL水中。

3）0.01mol/L的邻苯二酚溶液：将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中，用稀NaOH调节溶液的pH值为6.0，防止其自身的氧化作用。当溶液变成褐色时，应重新配制。新配制的溶液应贮存于棕色瓶中。

4）pH6.8的磷酸盐缓冲液

5）5%三氯乙酸溶液

6）0.01mol/L的间苯二酚溶液：将0.11g间苯二酚溶解于100 mL水中。

7）0.01mol/L的对苯二酚溶液：将0.11g对苯二酚溶解于100 mL水中。

8）硫酸铵晶体

四、实验步骤

1、多酚氧化酶的制备

每三个小组一起，称取150 g马铃薯（新马铃薯可以不去皮），切块后放入匀浆机，加入150mLNaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。

各组分别量取50mL滤液置离心管中，于4000r/min离心10min，取上清夜，加入硫酸铵晶体16g，溶解，于4℃放置30min，于4000转/min离心15min，弃上清液，沉淀用15ml pH4.8的柠檬酸缓冲液溶解，即为粗酶液。

2、多酚氧化酶的催化作用

按表1加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。

表1多酚氧化酶的催化作用

混匀后37℃保温5、10、15、20min，观察并试管号酶液邻苯二酚水

记录颜色变化（用+表示）

1 15滴15滴－

2 15滴－15滴

3 －15滴15滴

3、多酚氧化酶的化学性质

按表2加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。

表2多酚氧化酶的化学性质

试管号酶液5％三氯乙酸邻苯二酚37℃保温10min，观察颜色变化

1 15滴－15滴

2 10滴10滴10滴

4、底物专一性

按表3加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。

表3多酚氧化酶的底物专一性

试管号酶液邻苯二酚间苯二酚对苯二酚37℃保温10min，观察颜色变化

1 15滴15滴－－

2 15滴－15滴－

3 15滴－－15滴

五、实验结果

1、按实验步骤中各表格要切记录实验现象。

2、分析每组实验现象产生的原因。

六、思考题

1．在酶制备过程中加入硫酸铵的目的是什么？2．在多酚氧化酶性质实验中三氯乙酸有什么作用？