蛋白质浓度的测定(精华)
蛋白质浓度的测定
一．紫外吸收法
1. 近紫外吸收光谱法（280 nm）
原理：蛋白质中含有色氨酸与酪氨酸残基，这两种氨基酸残基具有吸收紫外光的性质，它们的紫外光吸收谱峰值在280 nm附近。某些蛋白质含有二硫键，也会在280 nm附近吸收紫外光。近紫外吸收法就是根据这个性质，对蛋白质进行定量。因为不同的蛋白质中所含有的色氨酸与酪氨酸的数量存在很大的差异，所以蛋白质在280 nm处的吸光度A280也存在非常大的差异。比如，当蛋白质浓度为1 mg/ml时，吸光度A280可为0-4之间的任何值。但是，大部分的蛋白质的吸光度A280时0.5-1.5之间的某个值。
该方法测定蛋白质的浓度具有明显的优缺点。这种方法操作简单，测定完成后，样品可以被回收，对buffer没有特殊要求，这是该方法的优点。该方法的缺点是：其他的生色基团会影响蛋白质吸收光谱的测定，比如核酸在该波长的紫外吸收能力非常强，少量的核酸就会对蛋白质吸光值的测定造成很大的干扰。同时，不同的蛋白质的消光系数需要在实验前确定。
蛋白质浓度的计算：
朗伯比尔定律：A (absorbance) = ε c l，因此：c（mg/ml）= A/ε l (cm)。
消光系数：当蛋白质浓度为1 mg/ml，光径为1 cm时，所测得的吸收值为该蛋白质的消光系数。
蛋白质的消光系数计算公式：A280 (1 mg/mL) = (5690n w + 1280n y + 120n c)/M。其
中M为蛋白质分子质量，5690、1280与120分别是色氨酸、酪氨酸与半胱氨酸的消光系数，n是该氨基酸残基的数目。
2. 远紫外吸收光谱法
在190-210 nm围，蛋白质中的肽键具有非常强的吸收紫外光的能力。此波长围，肽键在190 nm处的吸收值是其在205 nm的2倍，而且在190 nm，氧气对紫外光的吸收非常强，因此，通常取205 nm处的吸收值对蛋白质进行定量。对于1 mg/ml的蛋白质溶液，它们的消光系数通常在30-35之间。对于不同的蛋白质，其消光系数差别很小。
该方法的优点是操作简单，灵敏度高，样品可以回收。缺点：在使用前，必须对分光光度计进行准确校正，多种buffer，heme or pyridoxal groups在该波长具有很强的吸收紫外光的能力。
测定：
1.用生理盐水溶解蛋白质样品，确保其在215 nm处的吸收值小于1.5。
2.磷酸钾buffer不影响吸收值的测定。
3.计算公式：A2051 mg/mL = 27 + 120 (A280/A205) 或Protein concentration (μg/mL) =
144 (A215 – A225)。
Notes:
1.使用这两个方法进行蛋白质定量时，最佳的吸收值围为0.05-1，当吸收值为
0.3时，测定的结果最精确。
2.如果样品浑浊，可以扣除310 nm处的吸收值。
3.当蛋白质浓度很低时，蛋白质可能会吸附在石英杯壁，从而影响蛋白质浓度
的测定，在溶液中提高离子强度或者添加非离子型去垢剂可以防止这种现象的发生。
4. 1 mg/ml的BSA的吸收值为0.06，通常作为蛋白标准品。
5.当溶液中存在核酸时，可以用下列公式计算蛋白质浓度：
Protein (mg/mL) = (A235 – A280)/2.51
Protein (mg/mL) = (A235 – A280)/2.51
Protein (mg/mL) = 0.183 A230 – 0.0758 A260
6.当吸收值小于2时，在215 nm处测定的吸收值符合朗伯比尔定律。
7.在215 nm处进行测定时，sodium chloride, ammonium sulfate, borate, phosphate,
and Tris 不会影响吸收值的测定，但是0.1 M acetate, succinate, citrate, phthalate, and barbiturate 具有很强的吸收值。
8.在pH 4-8的围，215–225 nm的吸收值没有变化。
9.当蛋白质中存在核酸时，也可以这样计算：protein concentration (in mg/ml) =F
× A280 (assuming the cuvette is 1 cm wide).
二．Lowry法与BCA法
Lowry法与BCA法测定蛋白的浓度的原理包括两个步骤。
第一步，基于双缩脲反应。在碱性溶液中，肽键中的N原子结合二价铜离子，将Cu2+还原成Cu+，并形成一种铜离子络合物，反应后的溶液呈紫色，溶液在540 nm处有明显的吸收峰，根据朗伯比尔定律，可以测定蛋白质的浓度。
双缩脲反应
但是，直接测定肽键与铜离子络合物的吸收值灵敏度低，所以通常继续进行第二步反应增加灵敏度。在Lowry法中，Cu+在第二步反应中会与Folin–酚试剂反应。该试剂是一种钼磷酸盐与磷钨酸盐的混合物。反应的本质是Mo6+还原成钼蓝（Mo4+），此反应依赖于Cu+催化的芳香族氨基酸（酪氨酸与色氨酸）的氧化。因此，与近紫外吸收光谱法一样，Lowry法测定的蛋白质浓度也只是一个近似值，不同的蛋白质所含有的色氨酸与酪氨酸数目的差异会导致所测浓度值存在误差。
实验材料：
1.络合物生成试剂：在实验开始前，以100:1:1的体积比混合下列溶液。