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几种蛋白质测定方法的比较

几种蛋白质测定方法的比较
几种蛋白质测定方法的比较

(整理)6种方法测定蛋白质含量.

6种方法测定蛋白质含量 一、微量凯氏(kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1) 2NH3+H2SO4――(NH4)2 SO4(2) (NH4)2 SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3(3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 二、双缩脲法(biuret法) (一)实验原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材 1.试剂: (1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(bsa)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05NaOH配制。 (2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4?5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6?4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。 2.器材: 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 (三)操作方法 1.标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(20~25℃)下放置30分

蛋白质的测定方法

蛋白质的测定方法 测定食物中的蛋白质含量有二种方法,一是凯氏微量法,二是自动定氮分析法。 一.凯氏微量法 有手工滴定定氮和自动定氮仪定氮,实验者可根据经济条件设备而定。 1.原理 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用过量硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。 2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4 (NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O (NH4)2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO4 2.方法 本法参照GB 5009.5 -85 适用于各类食品及饲料中蛋白质的测定 3.试剂 所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。试剂均为分析纯。 3.1硫酸铜 3.2硫酸钾 3.3浓硫酸 3.4 2%硼酸溶液(或1%的硼酸) 3.5 混合指示剂:1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 3.6饱和氢氧化钠:500g氢氧化钠加入500ml水中,搅拌溶解,冷却后放置数日,澄清后使用。 3.7 0.01mol/L或0.05mol/L盐酸标准溶液:需标定后使用(配制及标定方法见附录) 4.仪器 消化炉凯氏定氮蒸馏装置万分之一电子天平 凯氏定氮蒸馏装置:如图所示 5. 操作步骤 5.1样品处理:精密称取0.1~2.0g固体样品或2~5g半固体样品或吸取液体样品5~20ml,放入100ml或500ml凯氏烧瓶中,加入0.2g硫酸铜,0.3g硫酸钾及3~20ml浓硫酸,放置过夜后小心加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后,取下放冷后用约2~10ml蒸馏水冲洗瓶壁,混匀后继续加热至液体呈蓝绿透明,取下放冷,小心加10~20ml水混匀,放冷后,移入100ml容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白实验。 5.2按图装好定氮装置,于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处,加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入数粒玻璃珠以防暴沸,加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 5.3向接收瓶内加入10ml ,1~2%硼酸溶液及混合指示液1滴,并使冷凝管的下端插入液面下,吸取10ml样品消化稀释液由小玻璃杯流入反应室,并以10ml水洗涤小烧杯使之流入反应室内,塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将3~10ml饱和氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯中,提起玻璃塞使其缓缓流入反应室,立即将玻璃塞盖紧,并加水于小玻璃杯中以防漏气。加紧螺旋夹,开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内,蒸馏2min,移动接收瓶,使冷凝管下端离开液面,然后用少量中性水冲洗冷凝管下端外部,再蒸馏1min取下接收瓶,以0.01或0.05mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。 同时吸取10ml试剂空白消化液按5.3操作。 6. 计算

几种测蛋白含量方法的比较

蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 (一)蛋白质测定方法的比较(原理、优缺点)蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry 法)和紫 外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:(1)实验测定要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定花费时间。蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry 法)和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:(1)实验测定要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法(GB 5009.5-2010) 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高,适用于0.2~ I.Omg氮,误差为土2%;操作复杂费时,整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。,测得结果为总氮含量,包括蛋白氮和非蛋白氮含 量;适用范围广,几乎所有样品均可用此方法。 2双缩脲比色法

6种方法测定蛋白质含量

6种方法测定蛋白质含量 [ 文章来源: | 文章作者: | 发布时间:2006-12-25| 字体: [大 中 小] 一、微量凯氏(kjeldahl )定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: nh 2ch 2cooh+3h 2so 4——2co 2+3so 2+4h 2o+nh 3 (1) 2nh 3+h 2so 4——(nh 4)2so 4 (2) (nh 4)2so 4+2naoh ——2h 2o+na 2so 4+2nh 3 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入cuso4作催化剂,k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得 样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 二、双缩脲法(biuret 法) (一)实验原理 双缩脲(nh3conhconh3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与cuso4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材

蛋白质的测定方法比较

蛋白质的测定方法比较 一、分光光度法 1、测定原理: 食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400 nm 下测定吸光度值,与标准系列比较定量,结果乘以换算系数,即为蛋白质含量。 2、测定步骤: ①试样消解:称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1g~0.5g(精确0.001g)、半固体试样0.2g~1g(精确至0.001g)或液体试样1g~5g(精确0.001g),移入干燥的100 mL 或250 mL 定氮瓶中,加入0.1 g硫酸铜、1 g 硫酸钾及5 mL 硫酸,摇匀后于瓶口放一小漏斗,将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后,再继续加热半小时。取下放冷,慢慢加入20 mL 水,放冷后移入50 mL 或100 mL容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。 ②试样溶液的制备:吸取2.00 mL~5.00 mL 试样或试剂空白消化液于50 mL 或100 mL 容量瓶内,加1 滴~2 滴对硝基苯酚指示剂溶液,摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色,再滴加乙酸溶液至溶液无色,用水稀释至刻度,混匀。 ③标准曲线的绘制:吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和1.00 mL 氨氮标准使用溶液(相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg 、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg 和100.0μg 氮),分别置于10 mL 比色管中。加4.0 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 mL 显色剂,加水稀释至刻度,混匀。置于100 ℃水浴中加热15 min。取出用水冷却至室温后,移入1 cm 比色杯内,以零管为参比,于波长400 nm 处测量吸光度值,根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。 ④试样测定:吸取0.50 mL~2.00 mL(约相当于氮<100μg)试样溶液和同量的试剂空白溶液,分别于10 mL 比色管中。以下按上述中“加4 mL 乙酸钠-乙酸

蛋白质含量测定方法及其比较资料2

蛋白质含量测定法(一) 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩脲法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较

值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 二、双缩脲法(Biuret法) (一)实验原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材

食品中蛋白质的含量测定

蛋白质的测定方法 测定食品中的蛋白质含量有二种方法,一是凯氏微量法,二是自动定氮分析法。 一.凯氏微量法 有手工滴定定氮和自动定氮仪定氮,实验者可根据经济条件设备而定。 1.原理 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用过量硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。 2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4 (NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O (NH4)2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO4 2.方法 本法参照GB 5009.5 -85 适用于各类食品及饲料中蛋白质的测定 3.试剂 所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。试剂均为分析纯。 3.1硫酸铜 3.2硫酸钾 3.3浓硫酸 3.4 2%硼酸溶液(或1%的硼酸) 3.5 混合指示剂:1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2 份0.1%甲基红乙醇溶与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 3.6饱和氢氧化钠:500g氢氧化钠加入500ml水中,搅拌溶解,冷却后放置数日,澄清后使用。 3.7 0.01mol/L或0.05mol/L盐酸标准溶液:需标定后使用(配制及标定方法见附录) 4.仪器 消化炉凯氏定氮蒸馏装置万分之一电子天平 凯氏定氮蒸馏装置:如图所示 5. 操作步骤 5.1样品处理:精密称取0.1~2.0g固体样品或2~5g半固体样品或吸取液体样品5~20ml,放入100ml 或500ml凯氏烧瓶中,加入0.2g硫酸铜,0.3g硫酸钾及3~20ml浓硫酸,放置过夜后小心加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后,取下放冷后用约2~10ml蒸馏水冲洗瓶壁,混匀后继续加热至液体呈蓝绿透明,取下放冷,小心加10~20ml水混匀,放冷后,移入100ml容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白实验。

蛋白质测定实验报告

蛋白质测定方法——化学报告

蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合,形成 蛋白质一铜复合 物,此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原,产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法,下面以实验的形式进行详细阐述:

1 材料与方法 1.1 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 1.2 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如, 生化制备中常用的(NH4)2SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。 此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。取待测样品制成蛋白浓度大约在0. 1~1. 0mgPmL的蛋白质溶液,用紫外分光光度计进行比色,对照标准曲线得出样品含氮量。每个样品做3次重复测定,取平均值。 (3)双缩脲法测定蛋白质含量

蛋白质含量测定方法汇总

实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多,目前常用的有染料法,双缩脲(Biuret)法,酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1.掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2.了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合,此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色,吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势,因为它操作简单,反应时间短,染料-蛋白质颜色稳定,抗干扰性强。本法的缺点是:对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质,有一定误差,因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的,故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管;试管;721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液:配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液:称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml,再加入85%的浓磷酸100ml,用水稀释至1000ml,混匀备用。

[操作步骤] 1.标准曲线的绘制: 按上表分别向各支试管内加入各种试剂,充分混匀,5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值(A)。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2.样品测定: 取1ml样品溶液(约含25~250微克蛋白质),加入染料溶液5ml混匀,5min后测定其595nm吸光度值,对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中,双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物,这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2),或与此相似的基团[如—CH2-NH2,—CS-NH2,—C(NH)NH2]的任何化合物,无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连,均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—),可发生双缩脲反应,且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量

蛋白质定量检测方法

Bradford法蛋白定量(Bradford Protein Assay ) Bradford Assay is a rapid and accurate method commonly used to determine the total protein concentration of a sample. The assay is based on the observation that the absorbance maximum for an acidic solution of Coomassie Brilliant Blue G-250 shifts from 465 nm to 595 nm when binding to protein occurs. Both hydrophobic and ionic interactions stabilize the anionic form of the dye, causing a visible color change. Within the linear range of the assay (~5-25 mcg/mL), the more protein present, the more Coomassie binds. Reference Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254. 考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定蛋白质含量 原理 1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G250与蛋白质结合的原理,迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变,从465nm变为595nm,光吸收增加。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数,因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度,最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程,大约需2min,结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子,如K+,Na+,Mg2+,(NH4)2SO4,乙醇等物质不干扰测定,而大量的去污剂如TritonX100,SDS等严重干扰测定,少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速,干扰物质少,灵敏度高,现已广泛应用于蛋白质含量的测定。 操作 一、标准方法 取含10~100μg蛋白质溶液于小试管中,用双蒸水或缓冲液调体积到0.1mL,然后加入5mL蛋白试剂,充分振荡混合,2min后于595nm测定光吸收值。以0.1mL 双蒸水或缓冲液及5mL蛋白试剂作为空白对照。 二、微量蛋白分析法 取含1~10μg蛋白质溶液,用双蒸水调体积到0.8mL,加0.2mL蛋白试剂,充分振荡混合,2min后于595nm测定光吸收值,以0.8mL双蒸水及0.2mL蛋白试剂作为空白对照。用不同浓度的蛋白质溶液作标准曲线,以蛋白质浓度为横坐

蛋白质含量测定方法比较

蛋白质含量测定主要有五种方法,分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点,优缺点明确。 凯氏定氮法 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化,使蛋白质分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后,再用盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外,还含有其它含氮物质,所以此蛋白质称为粗蛋白。 优点:重现性好,是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法, ,测试结果准确。 缺点:操作比较繁复,费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸,生物碱,含氮类脂,卟啉,含氮色素等非蛋白质含氮化合物。双缩脲定氮法 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 优点:较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋

白质测定。 缺点:不太灵敏;不同蛋白质显色相似。 紫外吸收定氮法 双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。 优点:对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。 缺点:准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。此外,进行紫外

几种蛋白质含量测定方法的比较

几种蛋白质含量测定方法的比较 【摘要】:蛋白质含量测定方法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常 用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法(Bradford),Folin —酚试剂法(Lowry)杜马斯燃烧法。其中Bradford 法灵敏度颇高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。过去Folin—酚试剂法法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以在本公司订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。测定农产品中全氮的凯氏定氮法在许多国家已被杜马斯然烧定氮法所代替,杜马斯燃烧法是基于在高温下(大约 900 ℃),通过控制进氧量、氧化消解样品的原理而进行氮测定的。这6种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,每种方法都有其优缺点,在选择方法时应考虑:⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度;⑵蛋白质的性质;⑶溶液中存在的干扰物质;⑷测定所要花费的时间 【关键词】:凯氏定氮法双缩脲法紫外吸收法考马斯亮蓝法 Folin—酚试剂法杜马斯燃烧法 一、凯氏定氮法 1.1原理 凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 1.2特点 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一,被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL;硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素;用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min;与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。 凯氏定氮法适用范围广泛,测定结果准确,重现性好,但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品,节省时间,提高了工作效率,适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。 二、双缩脲法(Biuret ) 2.1原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出1 个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以1 个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。

食品中蛋白质的测定方法

实验二食品中蛋白质的测定方法 Method for determination of protein in foods (一)目的 掌握凯氏定氮法测定食品中蛋白质的原理、步骤,了解蛋白质系数在蛋白质含量计算中的应用。 (二)原理 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。其反应式如下: 2NH2((CH2)2COOH+13H2SO4→(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O (NH4)2SO4+2NaOH→2NH3+Na2SO4+2H2O 2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3 (三)仪器与试剂 所用试剂均用不含氨的蒸馏水配制。 1.硫酸铜。 2.硫酸钾。 3.硫酸。 4.2%硼酸溶液。 5.混合指示液:1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 6.40%氢氧化钠溶液。 7.硫酸标准滴定溶液[c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L]或盐酸标准滴定溶液[c(HCl)=0.0500mol/L]。 8. 仪器 定氮蒸馏装置(如图1-2),微量滴定管。 铰肉机:篦孔径不超过4nm。 组织捣碎机。

粉碎机。 图1常量蒸馏装置 1—电炉;2—蒸汽发生瓶;3—大气夹;4—螺旋夹;5—加碱漏斗;6—凯氏 烧瓶; 7—氮素球;8—冷凝管;9—接收瓶;10—塑料管 图2微量蒸馏装置 1—电炉;2—蒸汽发生器;3—大气夹;4—螺旋夹;5—小玻璃杯;

食品中蛋白质的测定方法

食品中蛋白质的测定方法 蛋白质的测定方法分为两大类:一类是利用蛋白质的共性,即含氮量,肽链和折射率测定蛋白质含量,另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。但是食品种类很多,食品中蛋白质含量又不同,特别是其他成分,如碳水化合物,脂肪和维生素的干扰成分很多,因此蛋白质的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏,用标准酸液吸收,用标准酸或碱液滴定,由样品中含氮量计算出蛋白质的含量。由于食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法,但它们的基本原理都是一样的。 一凯氏定氮法 我们在检验食品中蛋白质时,往往只限于测定总氮量,然后乘以蛋白质核算系数,得到蛋白质含量,实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物,故称为粗蛋白质。 (一)、常量凯氏定氮法 衡量食品的营养成分时,要测定蛋白质含量,但由于蛋白质组成及其性质的复杂性,在食品分析中,通常用食品的总氮量表示,蛋白质是食品含氮物质的主要形式,每一蛋白质都有其恒定的含氮量,用实验方法求得某样品中的含氮量后,通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。 一般食品蛋白质含氮量为l6%,即1份氮素相当于6.25分蛋白质,以此为换算系数6.25,不同类的食物其蛋白质的换算系数不同.如玉米、高梁、荞麦,肉与肉制品取6.25,大米取5.95、小麦粉取5.7,乳制品取6.38、大豆及其制品取5.17,动物胶5.55。 测定原理: 食品经加硫酸消化使蛋白质分解,其中氮素以氨的形式与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸液吸收形成硼酸铵,再用盐酸标准溶液或硫酸标准溶液滴定,根据盐酸消耗量计算出总氮量,再乘以一定的数值即为蛋白质含量,其化学反应式如下。 (1) 消化反应:有机物(含C、N、H、O、P、S等元素)+H2S04 -→(NH4)2S04+C02↑+S02↑+S03+H3PO4+CO2↑ (2) 蒸馏反应:(NH4)2SO4+2NAOH-→2NH3↑+2H2O+NA2SO4 2NH3+4H3BO3-→(NH4)2B4O7+5H2O (3) 滴定反应:(NH4)2B4O7+2HCH+5H2O-→2NH4CH+4H3BO3 或 (NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2 试剂与仪器: 1、硫酸钾;

蛋白质含量测定方法

蛋白质含量测定 院系名称食品与生物工程学院学生姓名孙洪磊 学号200606021064 专业班级生工06 - 2 指导教师马美范 二○○九年四月一日

蛋白质含量测定方法比较 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。 一、双缩脲法(Biuret法) (一)实验原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 (二)试剂与器材 1. 试剂:(1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05N NaOH配制。(2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4?5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6?4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。 此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需重新配制。 2. 器材:可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 (三)操作方法 1. 标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(20~25℃)下放置30分钟,于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横 座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定:取2~3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。 二、Folin—酚试剂法(Lowry法) (一)实验原理

蛋白质检测方法

蛋白质的检测(参考GB/T6432-94) 一、原理 凯氏定氮法测定试样中的含氮量,即在催化剂作用下,用浓硫酸破坏有机物,使含氮物转化为硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氮溢出,再用酸滴定,测出氮含量,将结果乘以换算系数 6.25,计算出粗蛋白含量。 二、试剂 (1)硫酸化学纯,含量为98%,无氮; (2)混合催化剂 0.4g硫酸铜,含5个结晶水,6g硫酸钾或硫酸钠,均为化学纯,磨碎混匀; (3)氢氧化钠化学纯,40%水溶液(m/V); (4)硼酸化学纯,2%水溶液(m/V); (5)混合指示剂甲基红0.1%乙醇溶液,溴甲酚绿0.5%乙醇溶液,两溶液等体积混合,在阴凉处保存期为3个月; (6)盐酸标准溶液基准无水碳酸钠法标定; a)0.1mol/l盐酸标准溶液:8.3mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。 b)0.02mol/l盐酸标准溶液:1.67mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。(7)蔗糖分析纯; (8)硫酸铵分析纯,干燥; (9)硼酸吸收液 1%硼酸水溶液1000mL,加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL,0.1%甲基红乙醇溶液7mL,4%氢氧化钠水溶液,混合,置阴凉处保存期为1个月(全自动程序用)。

三、仪器设备 (1)实验室用样品粉碎机或研钵; (2)分样筛孔径0.45mm(40目); (3)分析天平感重0.0001g; (4)消煮炉或电炉; (5)滴定管酸式,10、25mL; (6)凯氏烧瓶 250mL; (7)凯氏蒸馏装置常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式; (8)锥形瓶 150、250mL; (9)容量瓶 100mL; (10)消煮管 250mL; (11)定氮仪以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。 四、分析步骤 (一)仲裁法 1.试样的消煮称取试样0.5-1g(含氮量5-80mg)(精确至0.0002g), 放入凯式烧瓶中,加入6.4g混合催化剂,与试样混合均匀,再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠,将凯式烧瓶置于电炉上加热,开始小火,待样品焦化、泡沫消失后,再加强活力(360-410℃)直至呈透明的蓝绿色,然后再继续加热,消化全过程至少2h。 2.氨的蒸馏 (1)常量蒸馏法将试样消煮液冷却,加入60-100mL蒸馏水,摇匀,

常见蛋白质测定方法的总结与比较

分析化学 结课作业 常见蛋白质测定方法的总结与比较 材料科学与技术学院 林化13-1班 刘旺衢 130534106

常见蛋白质测定方法的总结与比较 刘旺衢 (北京林业大学材料科学与技术学院林化13-1班 130534106,10083) 蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作用。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关,是对人类最重要的物质之一。准确精密的测定蛋白质,关乎人类的生产、生活、生存。目前测定蛋白质含量的方法有多种,如凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法、酚试剂法等几种方法,下面本文将总结比较这五种蛋白质的测定方法。 一、凯氏定氮法 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下,用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐,然后在碱性条件下将铵盐转化为氨,随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收,再以标准酸滴定,就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定,可由其氮量计算蛋白质含量,故此法是经典的蛋白质定量方法。蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数计算蛋白质含量,即含氮量*6.25=蛋白含量。 凯氏定氮法具有灵敏度高, 样品用量少,最低可检出0.05mg氮;精密度、准确度高,平行误差一般小于0.5%;应用范围广,适用于一切形态的食品与生物样品;仪器装置简单,试剂廉价的优点。 但也存在操作比较繁琐费时,特别是蒸馏定氮过程的效率低,不利于大批样品的测定;定氮的结果既包括有机氮,也包括无机氮,有机氮中除蛋白氮外,还包括非蛋白氮,测定的结果只能是粗蛋白质的含量;在蛋白质氨基酸构成有差异的

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