用PCR技术检测直接从粪便中提取真菌DNA的实验研究_吴浩

实验一-DNA提取

实验一-DNA提取

实验一DNA的小量制备 小量法提取植物基因组DNA（CTAB法） 1 实验目的： 随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。 2 实验原理 细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。 关于植物总DNA 的提取主要有两种方法： 1．CTAB 法： CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2．SDS 法： 利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。 几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在

dna粗提取的实验步骤

实验步骤——以洋葱为实验材料： 1、称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L 的氯化钠溶液，充分研磨。 洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰；或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器（榨汁机）。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。 2、研磨后，用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液。 3、向滤液中加入95%的酒精溶液20mL，沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌。 此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。 实例: 用鸡血细胞液粗提取DNA 并鉴定步骤 1、提取鸡血细将制备好的鸡血细胞液(已在课前配好) 5~10mL，注入到50ml 烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min，然后，用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至1000mL 的烧杯中，取其滤液。图示胞的细胞核物质 2、溶解细胞核内的DNA 将物质的量浓度为2mol/ L 的NaCl 溶液40 mL 加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA 在溶液中呈溶解状态。 3、析出含DNA的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。 4、滤取含DNA的粘稠物用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至1000 mL 的烧杯中。取纱布上的黏稠物。 5、将DNA 的粘稠物再溶解取一个50 mL 烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为2mol/ L 的NaCl 溶液20 mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至NaCl 溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。 6、过滤含DNA的氯化钠溶液取一个100 mL 烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。取其滤液(DNA 溶于滤液中)。 7、提取含杂质较少的DNA 在上述滤过的溶液中，加入冷却的、体积分数为95% 的酒精溶液50 mL(加入时动作要慢)，并用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20 mL 的试管，各加入物质的量浓度为0.015mol/ L 的NaCl 溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。

荧光PCR检测原理

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。 其特点有： (1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。 (2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。 实时荧光定量PCR技术的基本原理 在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR 循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR 循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。 荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。 方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R2＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。 实时荧光定量PCR技术的应用 1. 基因工程研究领域 ①基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。 ②转基因研究：利用两种发光探针及适当的循环阈值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因老鼠接合性。该方法为45个转基因动物的同型结合及异质结合提供了明确的鉴定结果。通过实时定量PCR检测，同型结合的异质接合动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律。这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大的用途。

实验 __DNA的粗提取与鉴定

实验 DNA 的粗提取与鉴定 教学目的 1． 初步掌握DNA 粗提取和鉴定的方法。 2． 观察提取出来的DNA 物质。 实验原理 1． DNA 在NaCl 溶液中的溶解度是随NaCl 的浓度变化而改变的。DNA 在0．14mol/L 的NaCl 溶液中的溶解度最低，据此可使DNA 充分溶解而使杂质沉淀或DNA 沉淀而杂质溶解。 2． DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中某些物质可以溶于酒精溶液，据此可提取杂质较少的DNA 。 3． DNA 对蛋白酶、高温和洗涤剂（可以溶解细胞的细胞膜，除去脂质和蛋白质，而对DNA 没 有影响）都具有较好的耐性。 4． DNA ＋二苯胺?? →?沸水浴 蓝色（用于DNA 的鉴定） 实验材料： 鸡血细胞液（5-10ml ），体积分数为95%的酒精溶液（冷却），蒸馏水，质量浓度为0.1g/ml 的柠檬酸钠溶液(抗凝剂)，物质的量浓度分别为2mol/l 和0.015mol/l 的氯化钠溶液，二苯胺试剂 实验步骤 1．材料制备 0.1g/ml 柠檬酸钠100ml 置于500ml 烧杯内→玻璃棒搅拌→1000r/min 离心2min →吸去上清 液→即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯置于冰箱中，静置一天使鸡 血细胞自行沉淀） 活鸡血180ml

[思考]为什么要除去血液中的上清液？ 2．方法步骤 取血细胞液5-10ml＋20ml蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速 搅拌，使血细胞加速破裂，纱布过滤，滤液中含DNA和 其他核物质，如蛋白质 （1）提取鸡血细胞的细胞核物质 原理：血细胞吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞 破裂 （2）溶解核内DNA：滤液＋2mol/LNaCl溶液40ml，玻璃棒沿一个方向搅拌 （3）析出含DNA的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，出现 丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl溶液 相当于稀释到0．14mol/L） （4）滤取含DNA的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上 （5）DNA粘稠物再溶解：在50ml的烧杯中注入20ml 2mol/L的NaCl溶液，缓慢搅拌3 min 使上述粘稠物尽量多的溶解在溶液中。 （6）过滤含DNA的2mol/LNaCl溶液：用2层纱布过滤，滤液中含DNA （7）提取含杂质较少的DNA：上述溶液＋冷却的95%的酒精50ml，缓慢搅拌，出现乳白色丝状 物，用玻璃棒将丝装物卷起。 （8）DNA鉴定：

实验6 动物肝脏中DNA的提取

实验六：动物肝脏中DNA的提取及定量测定 一、实验目的 1、学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术。 2、了解常见生化组分提取技术。 3、学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。 二、实验原理 核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形成存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA 主要存在于核仁及胞质中，在制备核酸时应防止过酸、过碱及其他能引起核酸降解的因素的作用。全部操作过程应在低温下(4℃)进行，必要时还要加入酶抑制剂。如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)等可以抑制DNA酶活性，皂土可抑制RNA酶活性，同时SDS 或苯酚等蛋白变性剂也可使核酸降解酶破坏。 动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液(如1mol/L NaCl)，但在0.14mol/L的盐溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。 将抽提得到的脱氧核糖核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成w-羟基-r-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物(λmax=595nm)。 DNA(脱氧戊糖基) [H+]HO-CH2-C(=O)-CH2-CH2-CHO 二苯胺蓝色化合物 在DNA浓度为20~200μg/ml范围内，吸光度与DNA浓度成正比，可用比色法测定。 三、实验器材 猪肝，分光光度计（595nm），比色杯，匀浆器，量筒（50ml、10ml），离心机(5000r/min)，离心管，试管及试管架，移液管（1.0ml、2.0ml、5.0ml），恒温水浴锅 四、实验试剂 氯化钠，柠檬酸钠，95%乙醇，SDS，氯仿，异戊醇，二苯胺试剂，DNA标准溶液（200μg/m1），二苯胺试剂等。 五、实验操作 1、配制溶液： 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液（2.925g氯化钠，20.85g柠檬酸钠，溶解于500mL 蒸馏水）。 氯仿-异戊醇混合液：按照体积比20:1配制500mL。 5％SDS溶液：10g SDS溶于200ml水中。 二苯胺试剂：称取纯二苯胺（如不纯，需在70％乙醇中重结晶2次）5克溶于500ml 分析纯的冰醋酸中，再加入50ml过氯酸(A.R，60％以上)，混匀待用。当所用药品纯净时，配得试剂应为无色。临用前加入5ml 1.6％乙醛溶液(乙醛溶液应保存于冰箱中，一周内可使用)，贮于棕色瓶。 2、称取猪肝2g，用匀浆器磨碎(冰浴)，加入4ml的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min下离心10min，弃上清；沉淀中再加入6ml缓冲液，于4000r/min离心10min；取沉淀。

dna提取实验步棸

（1）取新鲜或冰冻动物组织块0.5 g，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入5ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块。 （2）转入2ml 离心管中（转2管或4管），每管转入1ml，用台式离心机以12000 rpm 离心5min,弃上清收集沉淀。 （3）加入300ul 10×TE缓冲液悬浮沉淀 （4）加入100μl 200mg/ml的溶菌酶，37℃水浴1h； （4）加入50ul 10%SDS ,20μl 20mg/ml蛋白酶K在50℃恒温水浴锅中水浴3h ,间歇振荡数次。 （4）加入100μl 5mol/L NaCl，65℃水浴10min （5）加等量（570ul）的氯仿：异戊醇(24:1)振荡混匀，离心12000 rpm，10min。 （6）.取上层溶液至另一管，加入等体积的酚：氯仿:异戊醇(25：24:1)，振荡混匀，离心12000 rpm，10min，取上层溶液至另一管，重复一次。 （7）加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀20min ，12000 rpm离心,10min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 （8）用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，5min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁残余液滴除掉，室温干燥。 （11）加200ul 灭菌水重新溶解沉淀物。 （12）Nanophotometer仪测定DNA浓度及OD值。 （13）-20℃保存备用。 1.3.2菌群16S rRNA基因V3高变区PCR扩增 （1）16S rRNA基因V3高变区通用引物： V3F：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’ V3R：5’- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’ 其中，CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G为GC 夹。

实验一 DNA提取

实验一DNA的小量制备 小量法提取植物基因组DNA（CTAB法） 1 实验目的： 随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。 2 实验原理 细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。 关于植物总DNA 的提取主要有两种方法： 1．CTAB 法： CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2．SDS 法： 利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。 几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在

pcr检测技术

《食品安全学》综述 PCR快速检测技术综述 1．前言 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，是肉眼能直接观察和判断；可从一根头发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几个星期才能做到的事情，用PCR几个小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 该酶促反应最基本的3个环节是：[1]模板DNA的变性，即在94℃下模板双链DNA变为单链DNA；[2]引物与模板链的特异性复性；[3]引物链的延伸。 2.研究的目的与意义 聚合酶链反应（PCR）技术建立以来，定性技术不断改进和完善，可以达到检测单个靶序列的水平、但实际工作中常需要定量检测标本中核酸，而不是某一特定序列存在与否，借助PCR对基因快速、敏感、特异而准确定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。定量PCR旨在评估样品中靶分子数，此测定可以是绝对的，如每微克样本中靶DNA的分子数；也可以是相对定

量，即与设定的内参照或外参照比较而言。鉴于PCR方法主要有5个，即对PCR产物的直接定量、极限稀释法、靶基因与参照基因的同步扩增、竞争性PCR和荧光定量PCR[1]。这几种放啊各有利弊，对其选择取决于靶基因的特性、对PCR产量的期望值、对准确度的要求、需要相对还是绝对定量。 人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki 等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR 与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 3.国内外研究现状 3.1. 基础研究方面的应用 目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的： [1] 扩增目的基因和鉴定重组子； [2]克隆基因； [3]基因功能和表达调控的研究； [4]基因组测序； [5]制备单链模板； [6]致突变； 3.2. PCR在临床上的应用[2] [1]在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。 [2]在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR 技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。

简单DNA提取实验

实验材料 透明杯子、筷子、盐、洗洁精、冰箱冷藏的白酒、冰块、隐形眼镜护理液、蒸馏水、牙签等 实验步骤 1.获取口腔上皮细胞。含一口蒸馏水，开始漱口，试着用自己的舌头舔口腔内壁，大约2分钟； 2.用透明的杯子收回口腔中的液体； 3.在杯中加入半勺盐，缓慢搅拌10圈，记住动作要慢哦； 4.在杯中加入洗洁精5~6滴，均匀慢速地搅拌3分钟，切记越慢越好； 5.加入5滴隐形眼镜清洗液，继续缓慢搅拌10圈，加入冰块静置5分钟； 6.再次搅拌10圈，从冰箱拿出冷藏的白酒，缓慢倒入杯中，于是酒精便自然分层游离在唾液上方，唾液则沉淀在杯底； 7.由于DNA不溶于酒精，此时在上清下浑的酒精和唾液分层中间，能看到固态絮状的DNA。用筷子轻轻搅拌，将DNA缠绕起来，缓缓拉出水面，就能目睹DNA的真容了。这就是你的DNA哦！ 8.将DNA放入小瓶中，也可加入一些精油或酒精。这样，一条兼具观赏价值与特殊含义的精油项链就做好了。 实验原理：

DNA主要存在于真核生物的细胞核中，动物、植物都属于真核生物。在高温的条件下，DNA会变性(被破坏)，而在常温和低温条件下，则可以保存。由于哺乳动物成熟的红细胞不含有细胞核，因此人类的血液当中含有的DNA是比较少的，如果想要在非实验室环境下提取自己的DNA，建议选择其他容易获得的细胞，比如口腔的上皮细胞等。 下面我们就对具体操作步骤中涉及的原理进行解释 1.获取细胞：用漱口的方式，获取的是口腔的上皮细胞。 2.盐的作用：在漱口时细胞已经破碎，加盐可吸附DNA。带正电的钠离子会和DNA分子中带负电的区域发生反应，可使DNA分子聚到一起。 3.洗洁精的作用：洗洁精中含有十二烷基硫酸钠，它可以破坏细胞膜，这样就可以将细胞内的物质溶解于溶液当中，从而释放DNA，也可用牙膏、洗发香波等来代替。 4.缓慢搅拌：防止用力太大，速度太快会使DNA断裂。 5.隐形眼镜清洗液的作用：去除镜片上的蛋白质，主要是依靠清洗液中含有的蛋白酶，蛋白酶可以分解溶液中的蛋白质。加入隐形眼镜清洗液，其中蛋白酶的成分就可去除溶液中蛋白质的干扰，使DNA 更容易被提取出来，也可用菠萝或嫩肉粉来代替。 6.冰块和冷藏酒：在低温环境下，由于DNA不溶于酒精，因此可以析出DNA。 如果是植物细胞，就先要加洗洁精，然后再加盐。因为植物细胞有细胞壁，清水中不能吸水胀破。所以要先去除细胞壁。另外，在实验室提取DNA的过程中，会进行多次的氯化钠(NaCl)浓度调节，并且

PCR技术在食品检测中的应用汇编

许昌学院食品与生物工程学院2015-2016学年第一学期《现代食品检测技术》课程论文 PCR技术在食品检测中的应用

PCR技术在食品检测中的应用 许昌学院食品与生物工程学院，河南许昌461000 传统检测食品中微生物的方法主要是分离和培养鉴别，该方法操作繁琐，有些微生物很难培养。尤其是针对检测食品中的弱势菌，使用传统的方法基本无法检测出来。聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，由于它可以将微量的DNA大幅增加的特点，所以能够比较准确地检测食品中微生物。本文主要介绍PCF技术的操作原理和目前运用到食品检测中的几种具体的PCR技术特点，包括：多重PCR技术、实时荧光定量PCF检测技术、免疫PCR检测技术。并且对PCR技术在食品检测方面予以展望，为解决食品安全问题和相关食品检测做出导向作用。 关键词：食品检测；微生物培养；聚合酶链式反应；食品安全问题

、、■ 刖言 食品⑴是指原料不经加工或经过加工或改变性状、具有一定营养价值、对人体无害、可供人类食用的物质。它不仅富含营养成分和水等物质更容易滋生微生物，而且它能最直接的与人体接触，进入人体的消化系统，所以食品安全问题[2-4] 不容轻视。现代食品行业，在生产、运输、销售过程中有很多有害的微生物，这将严重危害食品的品质和人们的健康，甚至会引起一些严重的疾病。现代食品检测技术⑸是对食品按其原定用途进行制作和食用时不会使消费者受到伤害的一种担保。为保证食品安全急需一些快速、敏感、特异的检测方法，以及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。PCR检测技术具有敏感性、 特异性、简便、快速的优点，现已广泛应用于微生物检测，尤其对培养困难的细菌检测和抗原结构复杂的细菌鉴定方面，具有常规方法无法比拟的优越性。 随着分子微生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，尤其是聚合酶链反应（PCR）成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于食品的检测，具有广阔的发展前景。 1 PCR技术的原理 PCR是在体外人为控制的合适条件下，以单链DNA或RNA为模板，以1 对人工合成的寡核苷酸序列为引物，在耐热Tap DNA聚合酶作用下特异性扩增基因片段的技术。整个反应过程除了需要加入待扩增的DNA片段和两个决定特 异性的引物外，还需加入适量的缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸溶液（dNTP）、Tap DNA聚合酶、Mg2+等。每个PCR循环包括模板DNA变性、模板DNA与引物的退火（复性）、引物的延伸3个基础步骤。反应时，首先将靶DNA双链加热变性为单链状态，然后降低溶液温度，加入2段人工合成的与靶DNA端邻序列互补的寡核苷酸片段作为引物，即左端引物和右端引物，使合成引物在低温下与其靶序列特异配对，形成部分双链。然后，在Tap DNA聚合酶和4种dNTP 底物存在的情况下，引物沿模板DNA链（靶DNA单链）按5 '末端向3 '末端方向延伸，自动合成新的DNA双链，新合成的DNA片段又可作为扩增的模板。如此重复改变温度，由高温变性、低温复性、和适温延伸组成一个周期，每个周

DNA提取实验报告

生物学大实验（二） 实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验 实验目的通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作，加深对分子生 物学基本技术的理解和掌握。 实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、 磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。 实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的 培养来实现对质粒的扩增。经过处理的线状dna在外界环境恢复正常的时候不能够复性而质 粒dna可以复性，从而可以实现质粒dna和染色体dna的分离。限制性内切酶能特意地结合 于一端被称为限制性酶识别系列的dna系列之内或其附近的特异位点上，并切割dna。当对 提取的质粒dna进行电泳时，同一质粒dna其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的 泳动速度快。 实验步骤： 一质粒扩增 （1）普通lb固体培养基制备： 制备lb培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。 （2）将大肠杆菌接种于lb培养基中，37℃振荡培养过夜(200转/分) 二质粒dna的提取(碱法) 1将菌液倒入1.5ml的微量离心管中， 12000rpm离心一分30秒，弃去上清液，以得到 较多的细菌沉淀； 2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。 3、加入100μl用冰预冷的溶液i，剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。 4、加入200μl现配的溶液ii，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免 dna断裂），使混合物混匀，冰浴5～10分钟。 5、加入150μl预冷的溶液iii，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀 地分布于溶液iii中，冰浴5分钟。 6、取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10 倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链dna，然后4℃，12000rpm离心10min。 7、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后，加入预冷的 1ml 70％乙醇。 8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置dna干燥5～10分钟。 9、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。 10 、将沉淀溶于34υlte缓冲液或灭菌水（ph8.0）中，储于-20℃冰箱中 三dna酶切反应 1、将洁净干燥并经灭菌的eppendorf 管（最好0.5ml）编号，用微量移液枪分别加入 dna（υl）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2υl，将管内溶液混匀后加入0.5υl酶 液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操 作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱 的时间，以免活性降低。 2、混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）， 37℃水浴锅保温2-3小时，使酶切反应完全。 3、每管加入2υl0.1mol/l edta（ph8.0），混匀，以停止反应，置于冰箱之保存备用。 四 dna的琼脂糖凝胶电泳 1、取5×tbe缓冲液100ml加蒸馏水至1000ml，配成0.5×tbe稀释缓冲液，待用。

DNA 提取过程及原理

DNA 提取过程及原理 一、实验原理 从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。 盐溶法是提取DNA的常规技术之一。在制备核酸时，通常是用研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。利用DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液而RNA能溶于 0.14mol/L 的NaCl溶液这一性质可以将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品破碎细胞液中分开。 分离得到核蛋白后，还需进一步将蛋白等杂质除去。去除蛋白的方法有3种：①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质。用这种方法处理时，蛋白质停留在水相和氯仿相中间，而DNA则溶于上层水相，用两倍体积95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，从而使其与核酸分离，也可从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，一样可以将DNA 与蛋白质分离开来。这时DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内，吸出上层水相，加入两倍体积的95%乙醇即可得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。本实验采用CTAB法从植物幼苗中提取基因组DNA。 为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA杂质，可用RNA酶进行处理。另外，生物材料中还含有大量的脂肪物质和多糖，这些物质在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可被除去。 核酸纯化目标：纯化后的核酸样品中不应该存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的重金属离子；其它生物大分子物质如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；排除RNA分子污染。 操作注意事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程减少各种有害因素对核酸的破坏；减少化学因素对核酸的降解，一般pH4-10；减少物理因素如机械切力、高温对核酸的降解。 提取步骤：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质、多糖和脂类分子，去除RNA，去除盐类、有机溶剂等杂质。方案：视具体的生物材料和待提取的核酸分子特点而定。 二、仪器设备 高速离心机、水浴锅、电子天平、冰箱 三、试剂 EDTA-Na2.2H2O，加入10ml 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)和0.2mlβEDTA、0.2% -巯基乙醇，加双蒸水(ddH2O)定容到100ml；β①2×CTAB提取液(内含2%CTAB、1.4mol/L NaCl、25mmol/L -巯基乙醇和0.1mol/LTris-HCl，pH8.0)：取2g CTAB、8.18g NaCl、0.74g ②氯仿:异戊醇(24:1) ③洗涤缓冲液(70%乙醇，内含10mmol/L乙酸铵)：取70mL无水乙醇和0.077g乙酸铵，加双蒸水定容到100ml； ④无水乙醇、70%乙醇； ⑤TE缓冲液：内含10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH8.0 四、操作步骤 ①将材料在液氮中研磨成粉，迅速分装于Eppendorf 管中，加入0.7ml 60℃水浴中预热的2×CTAB提取液和20ul b-巯基乙醇，轻轻转动使之混匀； ②样品于60℃温浴45min，每5min将Eppendorf管上下颠倒混匀；

实验四植物DNA的提取

实验四植物DNA的提取 一、实验目的 掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。 二、实验原理 1、核酸提取的基本原理 核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。 在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。 吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。 为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。 在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性，又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。 SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。

最全DNA提取步骤

DNA提取中实验试剂作用原理 1. 溶液I—溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1，4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）；（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 2. 溶液II-NaOH-SDS液： NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。 SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。 3. 溶液III--3mol/L NaAc（pH 4.8）溶液： NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是 NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。 4. 为什么用无水乙醇沉淀DNA？ 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA 失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵）。但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。

PCR及其改进技术在食品检测中的应用

PCR及其改进技术在食品检测中的应用Application of PCR and PCR improved technology for detection in foods 刘辉1，杨利平1，2，张滨1* Liu Hui1,Yang Liping1,2,Zhang Bin1* （1．长沙环境保护职业技术学院，长沙410004；2．湖南师范大学生命科学学院，长沙410081） (1.Changsha Environmental Protection and Professional technique College,Changsha410004,China; 2.Department of life science,Hunan normal university.Changsha410081,China) 摘要：在介绍传统PCR的基础上，简介实时定量PCR、多重PCR、PCR-DGGE等几种常用的PCR改进技术在食品检测方面的应用。 关键词：PCR改进技术；传统PCR；食品检测 Abstract:The methods were rapidly upgraded for detection in foods when the factors of food-pollution became more and more complicated.PCR improved technology gradually replace the role of traditional PCR for detection in foods.In this paper,we introduced the application of three PCR improved technologies for detection in foods on the base of introducing traditional PCR. The three PCR improved technologies include real-time PCR,MULTIPLEX-PCR and PCR-DGGE. Key words:Traditional PCR;PCR improved technology;Detection in 近年来,随着我国社会经济的快速发展，人们的生活得到很大改善，对食品质量的要求也越来越高。加入WTO以后，国外对我国出口食品的质量要求也越来越严格。食品安全是一个重大的世界性公共卫生问题，随着食品生产的工业化和新技术、原材料、新产品的采用，食品污染的因素日趋复杂，因此食品安全检测的方法也需日新月异。自从1985年问世以来，PCR（Polymerase Chain Reaction）技术因其灵敏、快速、操作简便的优点，在食品检测领域具有广泛的应用。但是传统PCR检测技术一直面临着假阳性污染和定量准确度两大难题，用传统的PCR检测技术都依赖于各种不同类型的PCR后处理过程，而这些处理过程很容易使数量巨大的PCR产物飞散到空气中形成气溶胶，使PCR假阳性污染成为可能，而且电泳所用染色剂EB（溴化乙锭）为强烈致癌物质，容易危害操作者的健康。近年来，PCR改进技术在食品检测中的应用研究得越来越多，本文将简介几种PCR改进技术在食品检测中得应用研究进展。 1传统PCR技术在食品检测中的应用及其缺点 PCR（Polymerase Chain Reaction）技术即聚合酶链式反应技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。该技术自从1985年问世以来，最早应用于基因克隆和转基因检测，但由于其精确、微量的特点，已经广泛应用到其他领域。随着对一些主要食品微生物遗传性质了解的逐渐深入，许多致病菌的遗传背景进一步明了，PCR技术在食品检测中也逐渐显示出其应用前景[1]。近年来，PCR技术在食品检测中的应用主要体现在如下几个方面： 基金项目：长沙环境保护职业技术学院生物化学精品课程建设项目资助（项目编号：？） 作者简介：刘辉(1976-),女,长沙环境保护职业技术学院讲师。Email:? *通讯作者，张滨