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抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体的构建及包装

鉴定挑出重组体,命名为pEGFP 2TN F .用E co R 和S al 双酶切pGE M 2sFv 质粒,回收sFv 片段,定向克隆入pEGFP 2

TN F 的TN F 2Α5’

端,酶切鉴定重组体,命名为pEGFP 2ST ,即为单链双功能抗体和GFP 融合表达的真核表达载体.

1.4　双功能抗体2GFP 融合蛋白的真核表达　以标准的磷酸钙共沉淀法将pEGFP 2ST 转染N I H 3T 3细胞,转染后20h 于倒置荧光显微镜下观察活细胞中GFP 融合蛋白的表达.

2　结果

2.1　融合蛋白表达载体的构建和鉴定结果　分别克隆sFv 及TN F 2Α到pGE M 2T 载体,经测序证实所克隆的片段分别与已知基因序列一致.定向克隆的pEGFP 2ST 经E co R ,S al 双酶切下790bp 左右的sFv 片段,S al ,S ac 双酶切下470bp 左右的TN F 2Α片段,E co R I ,Sac 双酶切下1260bp 左右的sFv 2TN

F 2Α片段(图1).

图1　pEGFP 2ST 质粒的酶切鉴定结果

1.S a l 酶切空载体pEGFP 2N 3;

2.E co R 和S ac 酶切pEGFP 2ST

质粒(1260bp );3.S a l 和S ac 酶切pEGFP 2ST 质粒(470bp );4.

E co R 和S a l 酶切pEGFP 2ST 质粒(790bp );5.PCR m arkers

.2.2　细胞内融合蛋白表达结果　转染后20h 倒置荧光显微镜下即可观察到经pEGFP 2ST 转染的部分细胞发出较强的绿色荧光,散在或成对出现,阳性细胞约为50%.连续观察发光细胞逐渐增多,约72h 达最高,有灶性发光细胞出现.3　讨论　双功能抗体是近几年发展起来的一类基因工程抗体,将抗体基因与一种或几种具有其他生物活性的效应分子(如毒素分子,细胞因子等)基因相连并融合表达,这种融合表达的蛋白不仅具有与抗原特异性结合活性,而且具有效应分子的特殊功能.1989年Chaudhary 等[1]先将抗卵巢癌的sFv 与去除受体结合区的假单孢杆菌外毒素(PE 40)基因融合表达单链免疫毒素,使荷瘤裸鼠体内的移植瘤完全消失.目前已有多种单链免疫毒素基因治疗计划进入临床试验.但由于

毒素均来源于细菌,且分子量通常较大,具有较强的免疫原性,因而在临床应用中受到一定的限制.

以细胞因子为效应分子的双功能抗体报道极少.常用的细胞因子有I L 22,TN F 2Α

,IFN 等.1991年Hoogenboom 等[2]首次构建了抗体2TN F 2Α融合蛋白,将人TN F 2Α基因融合于肿瘤特异性人2鼠嵌合抗体CH 2或CH 3下游,并在骨髓瘤细胞中表达,对肿瘤细胞具有杀伤活性,但因分子量大仍可被人体的免疫系统识别并产生人抗鼠抗体(HAM A ),限制了它的重复使用.

单链抗体是由Fv 抗体衍生而来的一类无Fc 段的小分子抗体,其最大特点是分子量小、穿透力强、容易进入实体瘤周

围的血液循环[3]

.同时由于免疫原性低,人体可以重复使用,目前尚未见人体试用产生HAM A 报道,因而具有巨大的临床应用潜力.

为构建分子量尽可能小、免疫原性尽可能弱的双功能抗体,我们在人TN F 2Α基因前融合了抗肝癌sFv 基因,并将该双功能抗体基因克隆入带有GFP 基因的真核表达载体中.GFP 来源于水母A equo rea victo ria ,由238个氨基酸组成,分子质量27ku ,紫外线激发可产生明亮、稳定的绿色荧光,其无种系依赖性,且对宿主细胞无毒性,目前已作为一种新型的报告分子广泛应用于生命科学的众多领域,尤其在基因表达和定位等方面更具优越性[4].我们构建了抗肝癌单链双功能抗体融合GFP 表达载体,并在N I H 3T 3细胞中成功地表达了融合荧光蛋白,为肝癌的免疫基因治疗提供了一种灵敏、直观、有效的研究手段.参考文献:

[1]Chaudhary V K,Q ueen C,Junghans R P,W aldm ann TA ,F itz

Gerald DJ ,Pastan I

.A recom binant i m m uno toxin consisting of two antibody variable dom ains fused to p seudomonas exo toxin

[J ].N a tu re ,1989;339(6223):394-397.

[2]Hoogenboom HR ,R aus JC ,V o lckaert G .Constructi on and ex 2

p ressi on of antibody 2tumo r necro sis facto r fusi on p ro tein [J ].M ol Imm unol ,1991;28(9):1027-1037.[3]Yoko ta T ,M ilinic D E ,W h itlow M ,Sh lom J .R ap id tumo r pen 2

etrati on of a single chain Fv and comparison w ith o ther i m 2m unoglobulin fo r m s [J ].Cancer R es ,1992;52(12):3402-3408.

[4]贺竹梅,李华平,李宝健,李志芳,黄定华.绿色荧光蛋白在生命

科学研究中的应用[J ].遗传,1998;20(5):43-46.

编辑　王　睿

?研究简报?　文章编号:100022790(2001)0320280203抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体的构建及包装

程　虹1,刘彦仿1,张惠中2,于继云1,张素珍1　(1第四

军医大学基础部病理学教研室,陕西西安710033,2

第四军

医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所)

收稿日期:1999206216;　修回日期:1999209223

作者简介:程　虹(19672),女(汉族),安徽省宣州市人.博士,讲师.

T el

.(029)3374541关键词:肝癌;单链双功能抗体;逆转录病毒表达载体;包装细

胞;基因转染

中图号:R 735.7 文献标识码:B

0　引言　人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先

天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验,同时,逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因转移方法[1].迄今所掌握的研究资料表明,接受逆转录病毒介导基因治疗的患者中尚未发现因病毒感染导致的不良反应.因此,我们选择改造的缺陷型逆转录病毒载体pL XSN ,将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因

(sFv 2TN F 2Α)克隆至该载体,进行病毒包装并筛选具有高滴

度感染性重组病毒产生细胞系的研究.

1　材料和方法

1.1　材料　分泌型抗肝癌单链双功能抗体质粒pEGFP 2sFv 2TN F 2Α由本实验室构建.逆转录病毒表达载体pL XSN ,大肠

杆菌HB 101由廖文俊博士惠赠.包装细胞PA 317和N I H

Sw iss 小鼠成纤维细胞N I H 3T 3购自中国科学院细胞库.磷

酸钙转染试剂盒和DNA 纯化试剂盒购自P rom ega 公司.限制性内切酶、T 4DNA 连接酶、DM E M 、G 418购自Gibco 公司.

PCR 引物由上海生物工程公司合成.

1.2　抗肝癌单链双功能抗体逆转录病毒表达载体的构建　

分别用X ho 及S ac 单酶切pL XSN 载体及pEGFP 2sFv 2

TN F 2Α质粒,K lenow 酶补平粘末端,分别用E co R 单酶切,

回收平、粘末端的线性化pL XSN 载体及1260bp 的sFv 2

TN F 2Α片段.将sFv 2TN F 2Α片段与线性化pL XSN 载体片段

平2粘端连接,其产物为pL XSN 2sFv 2TN F 2Α(简称PST .转化HB 101感受态宿主菌,PCR 方法分别鉴定重组质粒PST 中的neo ,sFv 及TN F 2Α基因片段.

1.3　逆转录病毒产生细胞系的建立　以标准的磷酸钙共沉

淀法将20Λg 重组质粒PST 转染PA 317包装细胞16h ,换完全DM E M 培养液继续培养36h ,换以含600m g ?L -1G 418的完全DM E M 培养液.每4d 换液1次,直至抗性细胞集落形成,挑选细胞集落,用普通完全DM E M 培养液扩大培养,以制备含病毒的包装细胞上清并测定病毒滴度.转染的包装细胞命名为PA 317 PST .以N I H 3T 3细胞为指示靶细胞测定病毒滴度,计算集落形成率(co lony fo r m ing unit ,cfu ).挑选出cfu 最高的细胞集落,扩大培养.分别提取逆转录病毒产生细胞PA 317 PST ,逆转录病毒转导细胞N I H 3T 3 PST 及对照PA 317,N I H 3T 3细胞中的基因组DNA ,PCR 扩增neo 基因,以证实外源neo 基因导入靶细胞.

2　结果

2.1　重组质粒PST 中neo ,sFv 及TN F 2Α基因PCR 鉴定结

果　PCR 产物于15g ?L -1琼脂糖凝胶电泳,在327,470及

790bp 区域见强荧光条带分别与neo ,TN F 2Α及sFv 基因大

小相符,阴性对照未见任何扩增条带(图1)

图1　重组pL XSN 2sFv 2TN F 2Α的PCR 鉴定结果

1.PCR m arkers ;

2.neo 基因片段(327bp );

3.TN F 2Α基因片段(470bp );

4.sFv 基因片段(790bp ).

2.2　逆转录病毒产生细胞系的建立及鉴定分析　20Λg PST

质粒经磷酸钙共沉淀法转染6×105PA 317包装细胞,600

m g ?L -1

G 418筛选10d 后挑选50个细胞集落,于不含G 418

的完全DM E M 培养液中扩大培养,其中29个细胞集落存活,生长至2w k 左右测cfu .用倍比稀释的PA 317 PST 细胞上清感染N I H 3T 3细胞,24h 后500m g ?L -1G 418筛选,10～

14d 后镜下可见抗性细胞集落形成,结晶紫染色,计算cfu ,筛

选出具有最高cfu (1.6×109?L -1)的细胞集落C 22.对其细胞基因组DNA 中neo 基因PCR 分析结果显示,PA 317 PST 细胞和N I H 3T 3 PST 细胞均扩增出327bp 的条带,而对照PA

317和N I H 3T 3细胞均未扩增出相应的条带(图2).

图2　PA 317 PST 及N I H 3T 3 PST 细胞基因组DNA 的neo 基因扩增结果

1.PCR m arkers ;

2.PA 317 PST 细胞;

3.PA 317细胞;

4.N I H 3T 3 PST 细胞;

5.N I H 3T 3细胞.

3　讨论　将目的基因导入靶细胞是基因治疗过程中的一个

重要环节,其效率的高低将直接影响基因治疗的效果甚至成败.而逆转录病毒介导的基因转移中高滴度感染性逆转录病毒包装细胞系的获得对目的基因转导效率至关重要.我们所采用的逆转录病毒载体[2]pL XSN 来源于M o loney 小鼠白血病病毒(M oM uLV ),转染包装细胞后能够瞬时或稳定表达包装信号?、插入的目的基因及标志基因neo ,包装的子代病毒颗粒以芽生的方式从包装细胞膜分泌至培养上清,具有感染性但无复制能力,即建立了产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系.由于逆转录病毒包膜中含有env 基因编码的一种糖蛋白,而许多哺乳动物细胞具有识别这种糖蛋白的受体,两者结合可介导逆转录病毒对靶细胞的有效感染,进而整合到宿主细胞染色体DNA 中.PA 317细胞是目前较广泛使用的第二代包装细胞[3],能产生宽宿主谱的双向性毒种,而不产生可测出的辅助病毒,用它制备的逆转录病毒可以感染人和其他哺乳动物细胞,是一种广泛使用、较安全的包装细胞.

我们的结果显示,在建立稳定并高效产生重组逆转录病

毒的包装细胞系时,挑选细胞集落的数量不应少于50个,因为是否能高效、稳定包装子代逆转录病毒颗粒并不只取决于包装细胞中是否已导入逆转录病毒载体.通过物理和化学方法介导的基因转移往往很难达到持续稳定的表达,外源基因只是随机整合到转染细胞的基因组DNA 中,常常经受正常机制的降解并从细胞中排除出去,因而外源目的基因很容易丢失.研究表明,PA 317细胞转染后筛选出的病毒滴度大于1×106的细胞株只占很小的比例,都在5%以下[4],因此,要筛选出一株较高滴度的重组逆转录病毒产生细胞,需要挑选足够

数量的细胞集落.

在实验中,我们将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因克隆至逆转录病毒表达载体pL XSN ,包装后筛选出一株cfu >1×106的感染性重组病毒产生细胞系C 22.对C 22细胞及其上清转导的N I H 3T 3细胞基因组DNA 进行neo 基因PCR 分析,结果表明外源基因已整合到转染细胞DNA 中,证实了重组病毒的活性及其转导靶细胞的可行性,为我们进一步应用抗肝癌单链双功能抗体基因进行肝癌基因治疗研究奠定了理论基础.在以后的实验中,我们将用C 22细胞产生的重组病毒上清感染人T 淋巴细胞,观察转导T 细胞对肝癌细胞的体外杀伤作用.参考文献:

[1]D uan L ,Bagasra O ,L augh lin M A ,D akes JW ,Pom erantz RJ .

Po tent inh ibiti on of hum an i m m unodeficiency virus type 1rep li 2cati on by an intracellular anti 2R ev single 2chain antibody [J ].

P roc N a tl A cad S ci U SA ,1994;91:5075-5079.

[2]Hoeben RC,V aleri o D ,V an der Eb A J ,V an O r mondt H.Gene

therapy fo r hum an inherited diso rders :T echniques and status [J ].C rit R ev O ncol H e m a to ,1992;13(1):33-54.

[3]M iller AD and Butti m o re C .R edesign of retrovirus packaging

cell lines to avo id recom binati on leading to helper virus p roduc 2ti on [J ].M ol Cell B iol ,1986;6:2895.

[4]胡　亮,钱关祥,沈文红,许伟榕,张腾飞,陈诗书.PA 317产生

高滴度带有人TN F 2Α基因逆转录病毒的研究[J ].中国肿瘤生物治疗杂志,1995;2(3):235-238.

编辑　王　睿

?研究简报?　文章编号:100022790(2001)0320282202

细胞周期相关蛋白在肝癌细胞系HCC -9204表达的免疫细胞化学定位

杨连君1,王文亮1,司晓辉2　(1第四军医大学基础部病理

学教研室,陕西西安710033,2

上海第二医科大学第九人民

医院口腔医学研究所)

关键词:细胞周期相关蛋白;肝细胞癌;免疫细胞化学中图号:R 735.7 文献标识码:A

0　引言　肿瘤细胞的发生和增殖与细胞周期蛋白(Cyclin )及

其相关分子Cyclin 依赖性蛋白激酶(CD K )和CD K 抑制蛋白

(CK I )的调控密切相关[1].关于Cyclin 及其调控分子在培养

的原发性肝细胞癌(以下简称肝癌)细胞中表达的定位情况尚未见报道.我们采用免疫细胞化学技术检测Cyclin D 1及其相关分子CD K 4和CK I 家族中的p 27K i p 1在培养的肝癌细胞系HCC 29204中的表达情况.

1　材料和方法

1.1　细胞来源　人肝癌细胞系HCC 29204和对照用的正常

人肝细胞系Q ZG 为本室保存.于含盖玻片的6孔板内用含

100mL ?L -1新生牛血清的R P M I 1640培养液培养.待细胞

生长至单层时,取出玻片,PBS 缓冲液洗,950mL ?L -1乙醇固定15m in ,再用PBS 洗后4℃备用.

1.2　主要试剂　鼠抗人Cyclin D 1,CD K 4和p 27K i p 1mA b

均为美国Santa C ruz 公司产品.DAB 为美国Sigm a 公司产品.免疫组化ABC 试剂盒为美国V ecto r 公司产品.

1.3　染色方法　①细胞片入7.5mL ?L -1H 2O 2内,37℃,10收稿日期:1999211228;　修回日期:2000203201

作者简介:杨连君(19682),男(汉族),黑龙江省哈尔滨市人.博士生

(导师王文亮).T el .(029)3374541Ext .117

m in ;②加正常羊血清,37℃,30m in ;③分别加鼠抗人Cyclin D 1,CD K 4或p 27K i p 1mA b ,以PBS 作为阴性对照,4℃过夜;

④加生物素化羊抗鼠IgG ,37℃,30m in ;⑤加ABC 复合物,

37℃,30m in .上述各步间均用PBS 洗;⑥DAB 显色后脱水,

透明,封片.

1.4　结果判断　阳性信号为棕黄色.每个细胞片随机选取

不相重叠的视野,计数300个细胞,观察其是否为阳性及其染色部位.

2　结果　Cyclin D 1,CD K 4和p 27K i p 1在HCC 29204细胞表

达的阳性率及其定位情况见表1、图1和图2.与在HCC 2

9204细胞中的表达情况相比,Q ZG 细胞中的Cyclin D 1和CD K 4相对较弱,而p 27K i p 1相对较强.所有阴性对照中均为

阴性.

表1　Cyclin D 1,CD K 4和p 27K i p 1在HCC 29204细胞表达的阳性率和定位情况

分组

细胞核

%细胞质

%阳性率 %

Cyclin D 15117.023879.396.3CD K 428896.062.098.0p 27K i p 1

16.3

198

66.0

82.3

图1　Cyclin D 1,CD K 4和p 27K i p 1在HCC 29204细胞表达的阳性细胞数

□:细胞核;■:细胞质.

单链抗体的构建及其在医学上的应用

#综述#单链抗体的构建及其在医学上的应用* 汪希雅综述,余平**审校 (中南大学湘雅医学院免疫学系,湖南长沙410078) =摘要>基因工程抗体在疾病诊断、治疗及医学研究等方面都有着广泛的应用。近几年来,国内外学者对抗体的研究已迈入基因工程抗体阶段,其中单链抗体(single chain F v,scFv)因其具有分子质量小、穿透力强、体内循环半衰期短及排除了Fc段所致的免疫复合物反应等优点,成为基因工程抗体探索领域中的研究热点。尤其是将scF v应用于医学的研究已取得突破性进展,现就scF v的构建及其在医学上的应用综述如下。 =关键词>单链抗体;构建;应用;综述 =中图分类号>R392.11=文献标识码>A=文章编号>167325234(2009)1020790203 [J our nal of P a thogen B iology.2009Oct;4(10):790-792.] Construction of single2chain Fv antibody and its application in the medicine WANG Xi2ya,YU Ping(Dep ar tment of I mmunology,Xiangya Med ica l College,Centra l Souther n University, Cha ngsha410078,China) =Abstract>T he genetic engineer ing antibody is widely used in disease diagnosis,tr eat ment and medical resea rch.In re2 cent years,many scholars have taken in the genetic engineering antibody research.And because the single2cha in F v fr ag2 ment(ScFv)has small molecular weight,str ong penetr ating,short half2life in vivo circulation and avoided t he immunity compound response by F c section,it become to a research focus in the genetic engineering antibody.Especially,the medi2 cine applies research of ScF v have obtained br eakthr ough pr ogress.The r eview is given of ScF v constr uction and it s appli2 cation in t he medicine. =Key wor ds>Single2chain F v antibody(scF v);construction;applicat ion;r eview 在现代免疫学技术迅速发展的今天,抗体尤其是单链抗体技术所具有的优点,使其被广泛应用于医疗和生物技术领域[1,2]。抗体的发展大致可分为3个阶段。第一阶段:以1890年Behr ing和Kit asato发现白喉抗毒素为代表,其特点是利用抗原免疫动物来获取多克隆抗体;第二阶段:以1975年Kohler 和Milstein创建杂交瘤技术制备单克隆抗体(McAb)为代表, McAb具有性质纯、效价高、特异性强、少或无血清交叉反应等特点,已被广泛应用于医学各个领域。由于人2人杂交瘤技术尚无重大突破,目前用于临床的多均为鼠源性的McAb,后者对人是异物抗原,可能引起人抗鼠抗体反应(H AM A)[3]。McAb是特异性很强的药物,严重局限了其在人体内的应用[4];第三阶段:以1994年Winter以基因工程方法制备抗体为代表。这是抗体研究领域出现的又一次技术革命,在此基础上研制出的基因工程抗体保留了天然抗体的特异性和主要生物学活性,去除或减少了无关结构,并赋予抗体分子以新的生物学活性,因而较天然抗体具有更广泛的应用前景。目前,单链抗体是基因工程抗体研究热点。 1单链抗体的结构与特点 1.1单链抗体的结构单链抗体(scF v)是一种新型重组蛋白,它属于基因工程抗体中的一种小分子抗体,仅为完整抗体的六分之一[5],相对分子质量约为27ku[6]。由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)经14~15个氨基酸的弹性短肽(Linker)首尾连接而成。由于传统的单克隆抗体存在某些缺陷,如鼠源性单克隆抗体与NK等免疫细胞表面Fc段受体亲和力弱,产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)较弱,且与人补体成分结合能力低,对靶细胞的杀伤能力较弱;鼠源性单克隆抗体在人血循环中的半衰期短,发挥的作用时间亦较短;单克隆抗体还难透过致密组织屏障,使其在靶组织的药物浓度常常低于有效浓度而难发挥作用等。相反,scFv具有分子质量小、穿透力强的特点,在疾病的临床诊断和治疗方面有着广泛的应用前景。 1.2scFv的特点scFv作为基因工程中抗体中的小分子抗体,有着如下的优点:1)scFv只含有抗体的V区且保持较完整的抗原结合位点;2)scF v缺乏F c段的特性,使之不与非靶细胞结合,且具低免疫原性,有利于作为药物的导向载体而应用于临床靶向治疗;3)scF v分子质量较小,容易穿透致密组织屏障而到达靶组织;4)scF v体内血循环半衰期短,易从血循环中排除[5];5)相对分子质量较小,scFv无需糖基化修饰即可形成有功能的抗体分子,因而可在原核表达系统中广泛表达且易获得[7]。但scFv也存在缺点:1)因其只能与抗原结合,故不能激活补体而介导相关的细胞免疫;2)scFv仅有一个抗原结合位点,其亲和力、稳定性较单克隆抗体要低,且筛选受到局限,高亲和力、高特异性scFv的筛选较困难;3)scF v结构中所使用的弹性 # 790 #中国病原生物学杂志 J our nal of P a thogen Biology 2009年10月第4卷第10期 October2009,Vol.4,N o.10 * ** =基金项目>湖南省大学生创新性实验计划资助项目(No. 081053373)。 =通讯作者>E2m ail:yu ping1953@https://www.sodocs.net/doc/ad15554589.html, =作者简介>汪希雅(1988-),女(汉族),湖南长沙人,主要从事免疫学研究。E2m ail:wangxiya@https://www.sodocs.net/doc/ad15554589.html,

人HIF1α基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定

文章编号:100025404(2004)1821639204　论著人HIF1α基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定段小军1,杨　柳1,董世武2,周　跃3,唐康来1,胡　鸢1 (第三军医大学:1西南医院骨科,2基础医学部解剖学教研室,重庆市生物力学实验室,重庆400038,3新桥医院骨科,重庆400037) 提　要:目的　构建人缺氧诱导因子21α(HIF21α)基因重组逆转录病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞感染效率。方法　采用基因工程技术,经过2次亚克隆将HIF21α基因片段克隆至含IRES2EG FP逆转录病毒载体上,鉴定后用脂质体法转染PT67细胞进行包装、扩增,最后用重组逆转录病毒感染NIH3T3细胞。其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果　酶切鉴定及PCR结果与HIF21α基因重组逆转录病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达(114×106pfu/ml),并对NIH3T3细胞有强感染能力。结论　应用基因工程技术,成功构建了含人HIF21α基因重组逆转录病毒载体,为应用于治疗性血管生成创造了条件。关键词:逆转录病毒;缺氧诱导因子21;基因克隆中图法分类号:R782;R394233;R394.3 文献标识码:A Construction and identification of human hypoxia2inducible factor21αgene recombinant retrovirus DUAN X iao2jun1,Y ANGLiu1,DONG Shi2wu2,ZH OU Y ue3,T ANG K ang2lai1,H U Y uan1(1Department of Joint Surgery,S outh2 west H ospital,2Department of Anatomy,C ollege of Medicine,3Department of Orthopedics,X inqiao H ospital,Third Military Medical University, Chongqing400038,China) Abstract:Objective　T o construct the recombinant retrovirus of human hypoxia2inducible factor21α(HIF21α) gene and to observe its ability to in fect NIH3T3fibroblasts.Methods　The full2length human HIF21αcDNA was cloned into the retroviral vector containing internal ribos omal entry site(IRES)and enhanced green fluorescent pro2 tein(EG FP)by the method of gene engineering.Then the retroviral vector with HIF21αwas trans fected into PT67 cells using the lipofectine DOT AP and NIH3T3cells was in fected by the recombinant retrovirus.The target gene was detected by polymerase chain reaction(PCR).The titer and its in fection rate were determined using the EG FP ex2 pression with a fluorescent microscope.Re sults　Restriction endonuclease and PCR analyses con firmed that the hu2 man HIF21αcDNA was success fully inserted into the retroviral vector.The titer of recombinant retrovirus with HIF21αgene was114×106pfu/ml and the retrovirus had a strong effect on NIH3T3cells.Conclusion　The recombinant retrovirus containing HIF21αgene has been success fully constructed by the method of gene engineering,which lays a foundation for the application in therapeutic angiogenesis. K ey w ords:retrovirus;hypoxia2inducible factor21;gene clone 缺氧诱导因子21(hypoxia2inducible factor21,HIF21)是近年来发现的一种核转录因子,对缺氧状态下的血管生成(Angiogenesis)起核心调控作用,同时还具有调节细胞能量代谢,增强机体氧供给等作用1。HIF21是由α亚基和β亚基组成的异二聚体,属于bH LH2PAS 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270375) Supported by the National Natural Science F oundation of China(30270375) 作者简介:段小军(1972-),男,四川省渠县人,博士研究生,主治医师,主要从事组织工程学、血管生成方面的研究,发表论文11篇。电话: (023)68754000273007,E2mail:dxj9@https://www.sodocs.net/doc/ad15554589.html, 通信作者:杨　柳,电话:(023)68765280,E2mail:jointsurgery@https://www.sodocs.net/doc/ad15554589.html, 收稿日期:2004201215;修回日期:2004206221家族成员,其中β亚基在细胞内稳定表达,α亚基在功能调控方面起主要作用2。为此,本实验采用基因工程技术,体外构建表达人HIF21α基因重组逆转录病毒载体,旨在为进一步应用HIF21促进血管生成的研究创造条件。 1　材料和方法 111　质粒和菌株含人HIF21α质粒(215kb)pBSK hHIF1αT7由瑞士苏伊士大学G assmann教授惠赠。逆转录病毒载体pLEG FP2N1、pIRES22 EG FP购自Clontech公司。大肠杆菌DH5α菌株、病毒包装细胞PT67由创伤、烧伤与复合伤全军复合伤研究所国家重点实验室 9361 第26卷第18期2004年9月第　三　军　医　大　学　学　报 ACT A　AC ADE MI AE　ME DICI NAE　MI LIT ARIS　TERTI AE V ol.26,N o.18 Sep.2004

腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册目录第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广

慢病毒载体包装构建过程

慢病毒载体包装构建过程原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。

包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含

单链抗体药物项目计划书

XXXCEA单链抗体药物项目商业计划书

目录第一章执行摘要 (4) 1.1 公司简介 (4) 1.2 项目简介 (4) 1.3 市场容量 (4) 1.4 融资方案 (4) 1.5 经济效益 (4) 第二章市场分析 (5) 2.1 生物制药行业分析 (5) 2.1.1 行业现状 (5) 2.1.2 行业发展趋势 (7) 2.1.3 行业分析结论 (9) 2.2 结直肠癌市场分析 (9) 2.2.1 目标市场定位 (9) 2.2.2 目标市场容量分析 (9) 2.2.3 市场竞争分析 (10) 2.2.4 市场分析结论 (12) 第三章产品介绍 (13) 3.1 产品名称 (13) 3.2 产品功能 (13) 3.3 原理 (14) 3.4 产品特点与优势 (14) 3.5 生产工艺 (17) 3.6生产主要设备 (17) 第四章商业模式 (18) 4.1 运营模式 (18) 4.1.1 产业链分析 (18) 4.1.2 运营模式 (18) 4.1.3 盈利模式 (18) 第五章战略规划 (19) 5.1 竞争策略 (19) 5.2 战略目标 (19) 5.3 实施计划 (19) 第六章管理团队 (20) 第七章融资方案 (21)

7.1 资金使用计划 (21) 7.2 融资计划 (21) 7.3 退出机制 (21) 第八章财务预测 (22) 8.1 财务假设.......................................................................... 错误!未定义书签。 8.2 财务预测.......................................................................... 错误!未定义书签。 8.2.1 收入预测................................................................ 错误!未定义书签。 8.2.2 成本预测................................................................ 错误!未定义书签。 8.2.3 利润预测................................................................ 错误!未定义书签。 8.2.4 现金流量预测........................................................ 错误!未定义书签。 8.3 财务分析.......................................................................... 错误!未定义书签。第九章风险分析.. (23) 9.1 药品质量风险.................................................................. 错误!未定义书签。 9.2 核心技术泄露风险.......................................................... 错误!未定义书签。 9.3 执行力风险...................................................................... 错误!未定义书签。 9.3.1 风险描述................................................................ 错误!未定义书签。 9.3.2 规避措施................................................................ 错误!未定义书签。

腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书(完整版)

合同编号：YT-FS-4484-56 腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书 (完整版) Clarify Each Clause Under The Cooperation Framework, And Formulate It According To The Agreement Reached By The Parties Through Consensus, Which Is Legally Binding On The Parties. 互惠互利共同繁荣 Mutual Benefit And Common Prosperity

腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书(完整版) 备注：该合同书文本主要阐明合作框架下每个条款，并根据当事人一致协商达成协议，同时也明确各方的权利和义务，对当事人具有法律约束力而制定。文档可根据实际情况进行修改和使用。服务方（甲方）：_____ 地址：______ 邮编：______ 电话：______ 传真：______ e-mail：_____ 开户银行：_____ 帐号：______ 委托方（乙方）：_____ 地址：______ 邮编：______ 电话：______ 传真：______

甲乙双方根据《中华人民共和国合同法》等法律法规，在平等互利的原则下，经协商一致，订立本合同，以兹双方共同遵照执行。第一条病毒名称甲方接受乙方的委托，为其载体构建、重组、扩增和纯化_____腺病毒，腺病毒滴度_____pfu/ml。第二条费用及价格（人民币） 1．病毒的载体构建、重组、扩增和纯化所需的原料由甲方自行购买； 2．合同总价_____元，（大写）_____。第三条乙方责任 1．乙方所购买的甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品将只供乙方或乙方所能控制的实验组中进行实验研究，在任何情况下决不用于人类，决不用于以谋利（直接或间接）为目的的生物制药以及临床分析等方面。 2．未征得甲方授权或同意，乙方不能以任何名义将购买的腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品转移、

重组逆转录病毒载体的包装及病毒滴度影响因素

筮四至医太堂堂亟（！里！竺些丛！！塑鲤旦里ｉ！！兰塑！；堑（！兰２丛Ｐ；』４１坚里生：鱼竺旦：！塑：塑 ?研究简报?文章编号：１０００＿２７９０（２００５）１４一封２旬１重组逆转录病毒载体的包装及病毒滴度影响因素杨生玺１，蒋虹２（青海大学：１医学院生物教研室，２附属医院高压氧科，青海西宁８１０００１）【摘要】目的：探讨产生重组逆转录病毒包装及其病毒滴度（以ｃｆｕ表示）的影响因素．方法：用逆转录病毒载体ｐＭＮｓ—ＴＫ—Ｍ，以脂质体法转染包装细胞ＰＡ３１７细胞，挑选抗性集落（ＰＡ３１７／ｐＭＮＳ—ＴＫ—Ｍ）扩大培养后，进行ＰＡ３１７／ｐＭＮＳ—ＴＫ．Ｍ细胞接种密度、培养温度（３７℃，３２℃）、纯化方法等对其培养上清中重组病毒ｃｆｕ影响的比较性研究．结果：包装细胞的密度是影响ｃｆｕ的关键因素；降低培养温度需延长培养时间方可提高ｃｆｕ滴度．结论：该实验结果为应用逆转录病毒载体进行的基因治疗实验研究提供重要的参考依据．【关键词】逆转录病毒载体；包装细胞；病毒滴度【中图号】Ｒ３９４【文献标识码】ＢＧ４１８的ＤＭＥＭ培养液继续培养３ｄ，然后更换含８００ｍ∥Ｌ的Ｇ４１８的培养液，培养约１４ｄ，细胞克隆基本形成．分别以０．５，０．７，０．９，１．２及１．５×１０６不同细胞密度接种产病毒包装细胞，于相同温度及相同培养时间条件下制备含重组逆转录的包装细胞上清，并于相同的条件下测定它们的ｃｆｕ滴度．取最高ｃｆｕ的包装细胞系集落，以相同的密度接种细胞，分别在３７℃及３２℃的条件下培养细胞，并于２４ｈ及４８ｈ分别收集细胞上清测定病毒ｃｆｕ滴度．２结果采用脂质体法，将逆转录病毒载体ＧＩＮａＴＫ导入ＰＡ３１７细胞，命名为ＰＡ３１７／ＴＫ．根据ＨｓＶ．ＴＫ基因设计的引物ＰｃＲ扩增产物大小为４０４ｂｐ．经ＰｃＲ扩增，载体ＧＩＮａＴＫ和抗性细胞ＰＡ３１７／ＴＫ细胞均出现阳性条带，而ＰＡ３１７细胞未出现相应条带（图１）．分别以０．５，Ｏ．７，Ｏ．９，１．２及１．５×１０６不同细胞密度接种产病毒包装细胞，２４ｈ收集上清测定ｃｆｕ，结果随细胞密度上升而上升．在ＰＡ３１７／ＴＫ包装细胞密度相同条件下降低温度需延长培养时间，我们在３２ｃｃ条件下培养４８ｈ获得了４．０×１０７ｃｆ∥Ｌ的病毒滴度．０引言在目前众多的基因治疗临床试验方案中，逆转录病毒载体仍是被广泛应用的载体之一．作为目的基因转运过程中的逆转录病毒载体和包装细胞，其本身的分子生物学特性４０４ｂｐ已被广泛研究，但对于包装后这些含目的基因的重组逆转录病毒的生物、物理学特性的研究却较少．为此，我们对产生重组逆转录病毒的包装细胞系的建立过程及其上清中重组逆转录病毒集落形成单位（ｃｏｌｏｎｙｆｏｍｉｎｇｕｎｉｔ，ｃｆｕ）影响因素进行了比较性研究．１材料和方法１．１材料含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的小鼠白血病源性逆转录病毒表达载体ｐＭＮＳ—ＴＫ，ＰＡ３１７包装细胞及小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３ｒ１３培养于含胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液中．ＤＭＥＭ，ＲＰＭｌｌ６４０培养基等均为Ｇｉｂｃｏ公司产品，胎牛血清为四季青公司产品．逆转录病毒载体、细胞株ＰＡ３１７，ＮＩＨ３１ｒ３由东南大学医学院遗传中心惠赠．１．２方法按常规方法扩增、抽提、纯化质粒ＤＮＡ片段、回收ＨｓＶ—ＴＫ片段．在Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ的作用下，定向克隆入逆转录病毒载体ｐＭＮｓＭ中ｓｖ４０启动子下游的多克隆位点．重组质粒转化ＪＭｌ０９菌后经克隆筛选、鉴定获重组质粒ｐＭＮＳ—ＴＫ．Ｍ．以脂质体法将上述重组质粒ＤＮＡ转染至逆病毒包装细胞ＰＡ３１７．以含４００ｍ∥ＬＧ４１８的ＤＭＥＭ选择培养基选择培养１４ｄ，获Ｇ４１８抗性克隆ＰＡ３１７／ＴＫ细胞ＮＩＨ３ｒ１３细胞为靶细胞在Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ存在条件下测定、计算病毒滴度．病毒滴度（ｃｆｈ／Ｌ）＝细胞克隆平均数×病毒液稀释倍数×１０３．将收集到的病毒上清液分别作１０～，１０～，１０，１０。倍稀释．分别吸取１．５ｍＬ稀释的病毒液（８ｍｇ／Ｌ聚凝胺）加入ＮＩＨ３耶细胞培养瓶内，使病毒吸附２．５ｈ后，补加等量含３００ｍｇ／Ｌ收稿日期：２００５旬２旬７；修回日期：２００５＿０３一ｌｌ基金项目：国家自然科学基金（３００７０２２９）通讯作者：杨生玺（１９６３一），男（汉族），青海省西宁市人．学士，副教授，青海大学医学院生物教研室副主任．Ｔｅｌ．（０９７１）６１４３６３１Ｅｍａｉｌ．ｙａｎ百ｉａｎ９６３＠１２６．ｃｏｍｌ：ＧＩＮ仅ＴＫ；２：ＰＡ３１７／ＴＫ；３：Ｍａｒｋｅｒ．图１载体ＧＩＮａＴＫ和抗性细胞ＰＡ３１７／ＴＫ细胞出现的阳性条带３讨论将外源基因转入靶细胞是基因治疗的基础和关键步骤，其效率的高低将直接影响整个基因治疗的效果甚至成败，而包装后逆转录病毒滴度的高低是重要参数之一．结果提示在建立稳定产生重组腻转录病毒的包装细胞时，抗性集落数量的挑选应尽可能多一些并需传代培养观察病毒滴度的变化．制备含重组逆转录病毒的包装细胞上清时，细胞密度及培养温度是影响病毒滴度的重要因素，细胞密度与细胞生长状态有关，过低或过高的细胞密度对细胞生长均不利，均不能使病毒滴度达到最佳化．用聚凝胺处理细胞，可提高对逆转录病毒的敏感性’１Ｊ．张惠中等心。报道在细胞培养皿中接种１．２×１０６个包装细胞可获最佳的效果．采用降低培养温度的方法，在工业化培养罐中可以提高细胞病毒滴度．把病毒上清液进行超速离心，透析纯化，浓缩处理，有可能将病毒滴度提高到较高水平，从而满足今后以逆转录病毒载体进行的临床基因治疗的需要．【参考文献】［１］陈道桢，张丽珊，鲁晓萱，等．胸苷激酶基因对乳腺癌细胞的杀伤性研究［Ｊ］．实用癌症杂志，２００３；１８（２）：１２２—１２５．［２］张惠中，范清宇，杨安钢．产生重组逆转录病毒包装细胞系建立及病毒滴度影响因素［Ｊ］．第四军医大学学报，２００ｌ皿（４）：３１３—３１５．编辑潘伯荣　万方数据

单链抗体研究进展样本

抗体工程课程论文单链抗体研究进展姓名：学号：指引教师：时间：-上半年

单链抗体研究进展姓名摘要：单链抗体作为一种小分子基因工程抗体，在理论和应用方面研究引起了广泛关注，其在显像定位诊断、靶向治疗和参加细胞免疫等方面展示出了可观应用前景。本文对单链抗体构造及特点、制备技术及其应用研究进展等进行了综述，以期可觉得单链抗体进一步进一步研究和应用提供理论基本。核心词：单链抗体；构造；制备技术；应用 Abstract:Micro-molecule antibody prepared by genetic engineering have attracted wide attentions. And it showed considerable application prospects in imaging localization and diagnosis，targeted therapy and cellular immunity. The structure，characteristics and preparation technology of single-chain antibody as well as its applications were reviewed，so as to provide theoretical foundation for further study on single-chain antibody and its applications. Key words：single-chain antibody ； structure ； preparation technology ；application 前言：机体在受到抗原物质刺激后，B 淋巴细胞或记忆B 细胞增殖分化形成浆细胞，产生免疫球蛋白能与抗原发生特异性结合，辨认并清除外来入侵物质。防御系统中抗体不可或缺，是维护机体生理平衡和稳定重要构成某些之一［ 1 ］，因而,人们对抗体制备、纯化技术进行了长期摸索。初期使用老式办法以天然抗原免疫实验动物，产生相应多克隆抗体。该办法获得抗体重要用于治疗某些感染性疾病，但因其存在均一性差、交叉反映多、易产生副作用等缺陷而限制了其大规模生产应用。1975 年以来，使用杂交瘤技术制备单克隆抗体与多克隆抗体相比，具备性质均一、特异性强、容易生产等长处，现已在科学研究、临床诊断与治疗等方面发挥着重要作用。但由于制备周期较长，操作难度高，抗体自身稳定性差,在人

制备慢病毒载体

现今常用的制备慢病毒载体的方法为使用3或者4质粒系统转染293T细胞。此外，也有使用其它几类慢病毒包装细胞系制备慢病毒载体。瞬时转染制备慢病毒：细胞：慢病毒包装常用人胚肾细胞(HEK, human embryonic kidney)293T，其含有SV40病毒的大T抗原蛋白编码基因，转染效率极高。但其贴壁性不好，所以需要使用多聚赖氨酸包被的培养皿增加其吸附性。多聚赖氨酸培养皿可购买，也可自行制备。转染前，细胞密度控制在40-70%比较好。 DNA：每10 cm培养皿约含5x106 293T细胞，需用30-40 ug不含内毒素的质粒进行转染。质粒的纯度对慢病毒载体的包装效率非常关键。不同的包膜蛋白表达载体，其使用量也不同。转染：最经济的转染方法是磷酸钙转染法，虽然其溶液配置影响因素多，不易稳定重复得到最佳的转染结果。其它方法有脂质体法和PEI法。转染48-60后可以收集上清，通过低速离心，然后滤膜过滤可以去除上清中的细胞碎片。如果使用VSV-G包膜蛋白的话，可以通过两次超速离心进行浓缩，从而最高可以获得滴度高达1011-1012 IU/ml的慢病毒载体。之后可以将病毒载体溶解在PBS，HBSS或者DMEM中，并置于-80℃储存。储存溶液添加血清会帮助提高病毒冻融时的存活率，然而有些病毒在侵染细胞时，血清会有干扰，所以需要依据具体病毒种类考虑是否添加血清。病毒滴度：含VSV-G的慢病毒载体，其滴度在浓缩前一般为107 IU/ml，浓缩之后可以达到109 -107 IU/ml 。含有荧光标记或者其它报告基因的病毒载体，可以通过梯度稀释侵染HeLa或者293，NIH3T3细胞来确定其滴度;不含报告基因的可通过测定病毒颗粒中相关病毒蛋白的活性或者含量来确定其滴度，比如使用p24gag的elisa试剂盒。一般来说，每4-60 x 103个病毒载体含1ng p24 gag。然而这种方法测出来的滴度并不准确，不同的病毒载体类型，不同的储存方式，都会导致p24 gag和病毒载体颗粒的比值变化较大。甚至是不同的实验室测出来的都会有差异。亦可使用PCR 法测定滴度，其引物设计针对病毒颗粒的通用cDNA区域，因此不受外源插入片段的影响，也不需要反转录步骤，而且可以用于所有慢病毒载体。注意事项 1.避免使用小量抽提质粒，其纯度相比中抽和大抽而来的质粒纯度较低，可能会降低包装效率。 2.对于基于HIV-1的慢病毒载体而言，依实验目的，可能需要Vpr或者Rev辅助蛋白因子。有些细胞类型需要这些辅助蛋白的参与才能达到高侵染效率。 3.包装细胞系的质量对高效包装病毒非常关键。转染时，细胞密度在70-90%之间比较合适，过低或者过高密度都可能会降低病毒包装效率。细胞开始出现汇合时，需要及时更换或者添加新鲜培养基以保持细胞健康状态。 4.氯喹对细胞有毒性，一般将标准使用浓度之下的氯喹与细胞共孵育的时间控制在8小时之内。或者降低氯喹的使用浓度，延长孵育时间。 5.病毒包装时的细胞培养温度需要综合两方面因素考虑：a)，370C最有利于保持细胞健康状态;b)，320C最有利于维持重组病毒的稳定性。 6，收集病毒上清时的离心步骤可以去除细胞碎片以及少数悬浮的293T细胞。必要时，需要过滤以彻底去除一些细胞成分的污染。 7.冻融会降低病毒侵染效率50%，因此需要避免多次反复冻融。病毒放置于4℃时每36-48小时侵染效率下降50%。 8.视实验目的而定，为降低血清成分污染，建议使用低浓度血清培养基。 9.通过使用0.45mm的滤膜不仅可以去除细胞碎片残留，还可以去除VSV-G残留片段对细胞的毒性影响，但同时也会部分影响病毒滴度，所以过滤步骤需要依据具体实验目的而定。 10.使用TNE重悬病毒沉淀时，虽然低体积会增加病毒浓度，然而由于VSV-G介导病毒与细胞的融合，所以高浓度VSV-G对细胞会造成一定毒性，而有些细胞对VSV-G引起的毒性比较敏感，因此最终体积需要依据具体实验而定。

腺病毒载体疫苗

什么是腺病毒载体疫苗腺病毒载体疫苗是指以腺病毒作为载体，将保护性抗原基因重组到腺病毒基因组中，使用能表达保护性抗原基因的重组腺病毒制成的疫苗。腺病毒载体疫苗特点研究发现，携带各种抗原的腺病毒载体能刺激机体产生很强的体液免疫或细胞免疫。此外，由于腺病毒载体能感染呼吸道和肠道细胞，可以方便地通过黏膜进行免疫，并能诱导机体产生黏膜和系统免疫应答。腺病毒载体疫苗的临床研究 1、腺病毒载体诱导的天然免疫反应腺病毒载体本身的病原相关分子模式与细胞表面模式识别受体结合，促进炎性细胞因子的分泌和未成熟树突状细胞分化为专职抗原呈递细胞，激活宿主的天然免疫系统。研究表明，通过静脉给小鼠注射大剂量的表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒，6h即可检测到IL-6、IL-1和TNF-α的分泌，脾脏边缘也有树突状细胞和巨噬细胞聚集，在恒河猴中也观察到类似现象。 2、腺病毒载体疫苗能迅速刺激机体产生高水平的体液免疫很多疫苗是通过刺激机体产生中和抗体来发挥保护机体预防疾病作用的。腺病毒载体疫苗能有效产生针对相应靶抗原的高水平抗体。如携带狂犬病毒糖蛋白的复制缺陷型或复制型的5 型重组腺病毒载体疫苗，都能诱导高水平中和抗体，保护动物抵抗致死剂量狂犬病毒的攻击。 3、腺病毒载体疫苗能刺激机体产生很强的细胞免疫特异性T细胞免疫在对抗寄生虫病、病毒性疾病及肿瘤治疗中都具有重要作用。大量的临床前和临床研究发现，腺病毒载体疫苗能刺激机体产生很强的针对外源基因的特异性T 细胞反应。有研究报道，携带恶性疟原虫抗原的腺病毒载体疫苗能刺激小鼠产生很强的CD8+T 细胞免疫反应，最高能达到92％的保护率。 4、腺病毒载体疫苗可方便地通过黏膜进行免疫能通过黏膜免疫诱导局部或全身体液免疫反应是腺病毒载体疫苗的一个重要特点。黏膜免疫与全身免疫相比有许多不同，注射免疫诱导的全身免疫虽然可以清除其感染，但通常不能保护黏膜表面；而经黏膜接种疫苗可以非侵入性地诱导机体产生黏膜和系统免疫应答，从而可以保护机体免受通过黏膜表面和其他途径的感染。研究发现，在多种动物模型中，口服或滴鼻接种肺炎球菌、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、乙肝病毒的重组腺病毒载体疫苗，都能刺激机体产生很强的体液免疫和局部的黏膜反应，并保护机体免受相应病原的侵害。

单链抗体的研究进展及在肿瘤诊断

单链抗体的研究进展及在肿瘤诊断、治疗中的应用文章来源：国外医学临床生物化学与检验学分册1999年第20卷第1期发表时间：2004-08-10 13:25:00 关键字：单链抗体；表达；肿瘤诊断；肿瘤治疗自从1975年K?hler和Milstein创立淋巴细胞杂交瘤技术以来，单克隆抗体技术在临床诊断和基础研究中的应用越来越广泛，但在疾病治疗方面，还没有达到令人满意的效果，原因主要是应用的单克隆抗体绝大多数来自鼠类，而鼠抗体在人体内应用时容易产生人抗小鼠Ig抗体而降低疗效，而人源性抗体制备尚存在许多困难。 1988年以来，抗体基因工程的研究取得了一些技术上的进展。Huston等[1]和Bird 等利用基因工程技术成功制备了单链抗体（Single chain Fv, scFv或single chain antigen binding protein, SCA）,scFv是由免疫球蛋白的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段连接肽连接而成的重组蛋白，它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片断，大小为完整抗体的六分之一，分子量约为27KD。它具有许多优点：①分子小，免疫原性低，用于人体不易产生抗异种蛋白反应；②容易进入实体瘤周围的微循环；③血循环和全身廓清快，半衰期短，肾脏蓄积很少；④无Fc段，不易与具有Fc受体的非靶细胞结合，成像清晰；⑤易于基因操作和基因工程大量生产。此外单链抗体还可以与毒素、前体药物转化酶、放射性同位素、细胞因子等效应分子构建成多种双功能抗体分子，单链抗体也是构建双特异性抗体的理想元件，用于肿瘤的临床诊断和治疗显示出了巨大的潜力，目前国外的一些抗肿瘤单链抗体已进入体内试验阶段。 1 单链抗体的构建基因工程单链抗体技术的基本原理是：首先从杂交瘤细胞、外周血淋巴细胞中提纯mRNA，再经RT-PCR分别扩增抗体的重链可变区和轻链可变区编码基因，人工合成一条