DNA标记

教你辨析标记基因和报告基因

教你辨析标记基因和报告基因 一、标记基因和报告基因的概念 标记基因(marker gene)，是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用。标记基因是选择标记基因的简称，是指其编码产物能够使转化的细胞、组织具有对抗生素等的抗性，或者使转化细胞、组织具有代谢的优越性。在培养基中加入抗生素等选择试剂的条件下，非转化的细胞死亡或生长受到抑制，而转化的细胞能够继续存活，从而将转化的细胞、组织从大量的细胞或组织中筛选出来的一类基因。在基因工程意义上来说，它是重组DNA载体的重要标记，通常用来检验转化成功与否；在基因定位意义上来说，它是对目的基因进行标志的工具，通常用来检测目的基因在细胞中的定位。 报告基因(reporter gene)，是指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入受体细胞、组织或器官，并检测其表达活性的一类特殊用途的基因，主要用于判断目的基因是否成功导入到受体细胞，并在其中表达。故当报告基因被用来区分转化和非转化细胞、组织、器官时，也可将其称为标记基因。报告基因不仅能作为标记基因，此外，报告基因还能用于研究基因的表达调控，检测启动子的活性，发现新的启动子，观察报告基因和目的基因的融合蛋白在细胞内的位置等。 二、标记基因和报告基因的区别与联系 二者的联系在于：报告基因都可以看做是标记基因。报告基因也有标记的作用，标记目的基因是否成功 转化的作用，但是它们又有着各自的特点。 标记基因通常用来检验重组DNA载体转化成功与否，或者检测目的基因在植物细胞或组织中的定位。常用的标记基因是一些抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性基因、潮霉素标记基因等。 而作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：1）已被克隆和全序列已测定；2）表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；3）表达产物唯一，对受体细胞无毒，并且能进行定量测定。目前常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、荧光素酶基因(luc)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、分泌型碱性磷酸酶基因(seap)、绿色荧光蛋白基因(gfp)等。

基因选择性表达的原因

基因选择性表达的原因 基因选择性表达的原因 截至2014年底，科学界认为这是一种rna抑制机制。 从大量的研究结果中我们可以推测，生物体内有一套rna监视系统，可以通过多种异常rna来激发。如果外来核酸是dna(包括转基因、重组基因、dna病毒、扩增子等)，靶标rna需要在细胞核中完全成转录后运转到细胞质中，而侵入细胞质的病毒rna 可以直接提供靶标rna。各种不同的靶标rna(包括与外源基因同源的内源基因和外来的dna产生的rna以及病毒的rna)由寄主的rdrp或病毒自身的rdrp通过多种不同的途径反靶标rna转变成为双链rna,从而通过rnai引发的ptgs。ptgs被引发后就不再需要rdrp。关于双链rna介导的rnai特异性靶标rna的降解，bass 提出了这样一个假说：认为生物体内存在着一种复合酶：rnai核酸酶，该酶具有双链rna结合、rnase和 rna解旋酶三个活性区。首先双链rna结合到该酶的双链rna结合区并引导该酶识别靶标rna，接着该酶的解旋酶完成atp依赖性的靶标rna与该酶结合的双链rna的正义链的换位，rnase在靶标rna结合位点附近完成切割，从而使靶标rna能被进一步降解，产生大量的小片段rna，包括序列特异性的-25nt rna。载有序列特异性的双链rna的游离复合酶再去识别并降解其它的靶标rna，产生更多-25nt rna，从而使ptgs具有持久性系统性。

基因沉寂需要经历不同的反应过程才能实现，包括组蛋白n 端结构域的赖氨酸残基的去乙酰基化加工、甲基化修饰(由甲基转移酶催化，修饰可以是一价、二价和三价甲基化修饰，后者又被称为'过度’甲基化修饰(hypermethylation) ) 、以及和甲基化修饰的组蛋白结合的蛋白质(mbp)形成“异染色质”，在上述过程中，除了部分组蛋白的n端尾部结构域需要去乙酰化、甲基化修饰之外，有时也许要在其他的组蛋白n端尾部结构域的赖氨酸或精氨酸残基上相应地进行乙酰化修饰，尽管各种修饰的最终结果会导致相应区段的基因“沉寂”失去转录活性。

DNA分子标记技术及其应用

DNA分子标记技术及其应用 摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。 关键词：分子标记；应用 分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念 遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生 插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。 与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；

什么是基因选择性表达

什么是基因选择性表达？ 在个体发育的的不同时期，生物体不同部位的细胞表达的基因是不同的，合成的蛋白质也不一样，从而形成的不同的组织和器官。 在生物个体发育过程中，基因如何选择性表达？ 基因的选择性表达是指在细胞分化中，基因在特定的时间和空间条件下有选择表达的现象，其结果是形成了形态结构和生理功能不同的细胞。由于细胞分化发生于生物体的整个生命进程中，所以基因的选择性表达在生命过程各阶段都在体现。不仅如此，基因的选择性表达在单细胞原核、真核生物生长发育中，甚至病毒的生命活动中都明显表现，这充分体现了基因的选择性表达的普遍性。同时，在某些外界因素和生物内部因素影响下，基因的选择性表达还会出现特殊性。下面以具体事例分析说明。 1.1基因的选择性表达的普遍性 在多细胞生物的个体发育中，受精卵有丝分裂增加细胞数目，产生的细胞大多数不再分裂，细胞中特定的基因通过转录翻译合成蛋白质，表现出特定的形态、结构和生理功能，形成不同的细胞和组织。如动物和人的红细胞和心肌细胞都来自同一胚层，后来分化出的红细胞合成出血红蛋白，而心肌细胞则能够合成肌动蛋白和肌球蛋白。即使在细胞分裂过程中，基因的选择性表达同样存在。如在细胞分裂间期、分裂期，仅仅是部分基因在表达，合成了特定的蛋白质、酶用于分裂过程，绝大部分基因没有表达。 在多细胞生物的生命历程中，成熟和衰老阶段同样有基因的选择性表达。在成熟期，参与细胞分裂的基因基本不表达，用于物质转化的相关蛋白质等的基因在表达，合成相应的蛋白质、酶等。如马铃薯块茎、甜菜块根形成后，细胞中用于合成葡萄糖转化为乳酸的酶的基因进行了表达，故它们无氧呼吸时产物是乳酸，有利于减少物质能量浪费，还降低了对细胞的伤害程度。再如：人和动物的第二特征的表现，是生长发育到一定阶段基因选择性表达的结果。而在衰老过程中，用于正常代谢的酶合成受到抑制或数量减少，加速了衰老的程度，也是基因的选择性表达的结果。程序性死亡的理论假说也认为死亡的细胞是通过基因的选择性表达实现的。 作为单细胞生物，产生新个体常常通过细胞分裂的方式，细胞分裂中的仍有部分基因在表达。新细胞（或新个体）生长发育中过程中，特定的基因在不同阶段表达，细胞完成相应的生理活动适应了特定的环境。如通过实验比较双小核草履虫单独培养和与大草履虫混合培养发现其细胞内的基因表达有显著不同：混合培养时产生的蛋白质种类和数量远远超过单独培养的情况，增强了其竞争力。再如细菌在环境条件适应时，基因选择性表达保证正常的生长繁殖与生存，一旦环境恶化，细菌体内特定的基因进行表达，使其形态结构改变，出现荚膜、芽孢等特殊结构助其度过危机。而非细胞结构的病毒，寄生在宿主细胞内，基因表达也有选择性，使其衣壳有不同的形态或使其表现出不同的抗原性（或致病性）。如禽流感病毒中基因表达不同的蛋白质类物质，致病性相差较大。对人和鸟类都有致病作用的是H5N1，其他类型致病作用小得多。原因是前者基因选择性表达出了一种被称为“细胞因子”的蛋白质迅速进入被感染的肺部组织，进而免疫系统过度反应造成死亡。 1.2基因的选择性表达的特殊性 基因的选择性表达不仅具有普遍性，还具有特殊性。如：在外界环境因素（如物理、化学、生物方面）的影响下，生物体内原癌基因由抑制状态转变为激活状态，能够进行正常表达导致出现癌症，而正常生物体内的原癌基因就不能表达。再如微生物体内酶合成的调节，也是基因的选择性表达的结果。常见的大肠杆菌在用葡萄糖和乳糖作碳源的培养基进行培养，开始，大肠杆菌只能利用葡萄糖而不能利用乳糖，只有当葡萄糖消耗完毕后，大肠杆菌细胞内控制合成分解乳糖的半乳糖苷酶的基因才开始表达。有了半乳糖苷酶，才能利用乳糖作碳源。这种调节既保证了代谢的需要，又避免了细胞内物质能量的浪费，增强了微生物对

北师大版(2019)高中生物必修二基因的选择性表达及表观遗传现象-教案

基因的选择性表达及表观遗传现象 【教学目标】 1．通过受精卵和胚胎发育过程中mRNA表达量变化的科研材料分析，说明细胞分化的原因是基因选择性表达。 2．通过小鼠毛发遗传研究的材料以及问题串的设计，解释某些基因碱基序列不变但表型改变的可遗传的表观遗传现象。 3．通过概念图的构建，认同环境可以通过表观遗传改变生物性状。 【教学重难点】 通过小鼠毛发遗传研究的材料以及问题串的设计，解释某些基因碱基序列不变但表型改变的可遗传的表观遗传现象。 【教学过程】 一、导入新课 一个受精卵经过细胞分裂、生长和分化，发育成了生物体的各种组织和器官，组成生物体的每个细胞都含有一模一样的遗传信息，为什么同样的DNA经转录成mRNA．翻译成蛋白质，却能发育成不同的组织和器官呢？为什么基因会有这种差异表达呢？（创设问题情景，激发学生强烈的求知欲。） 二、讲授新课 （一）基因的选择性表达导致细胞的分化 寻找证据——阅读 阅读课本P34页资料，根据阅读获得的信息，思考下列问题： 1．随着受精卵和胚胎的发育，细胞逐步分化，基因表达数目有明显的变化，说明了什么问题？ 2．生物体在生长发育的不同时期，形态发生了明显的变化，基因表达的数目也不同，基因的表达与细胞分化有什么关系？ 每个学生先自己独立完成，然后以组为单位进行讨论，各组代表回答上述问题。教师点评。 随着受精卵和胚胎的发育，细胞逐步分化，基因表达的哪一步出现了差异？ 写出基因表达的路径图。并完善。

基因选择性表达有什么意义？ 是细胞分化的根本原因，保证机体的正常发育；各种蛋白质在需要时才合成，以适应多变的环境。 （二）表观遗传是不依赖于DNA碱基序列变化的遗传现象 阅读课本P35-36页资料，根据阅读获得的信息，思考下列问题： 1．从小鼠毛色变化来看，编码毛色相关蛋白的A基因DNA序列及调控A基因表达的a 序列都没有变化，小鼠的毛色却发生了变化，说明什么问题？ 2．DNA的甲基化对小鼠毛色的影响，在小鼠的子代中仍然出现，进而导致小鼠毛色的变化，说明了什么？ 每个学生先自己独立完成，然后以组为单位进行讨论，各组代表回答上述问题。教师点评。 得出本节课的重要概念： 表观遗传学现象：不依赖于DNA碱基序列变化并且能遗传给子代的表型改变。 完善概念图： 展示其它表观遗传调控机制，明确表观遗传是通过调节基因的转录和翻译而控制蛋白质的合成，从而控制生物的性状。但其它机制为什么可遗传，研究并不清楚。 完善概念图： 讨论：表观遗传学调控机制对我们的生活有什么启示？ 表观遗传学在癌症领域的应用。 课堂小结：综上所述，基因通过其表达产物蛋白质来控制性状，细胞内的基因表达与否以及表达水平的高低都是受到调控的。细胞分化的实质是基因选择性表达的结果，表观遗传能够使生物体在基因的碱基序列不变的情况下发生可遗传的性状改变。 当堂检测

去除选择标记基因的Cre_lox重组系统在植物中的应用

生物工程学报 C hin J Biotech 2009, October 25; 25(10): 1459-1463 https://www.sodocs.net/doc/ae10816268.html, Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@https://www.sodocs.net/doc/ae10816268.html, ? 2009 Institute of Microbiology, CAS & CSM , All rights reserved Received : July 18, 2009; Accepted: August 26, 2009 Supported by : National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA100503), the Special Program for Research of Transgenic Plants (No. 2008ZX08010-002) Corresponding author : Xiaokun Li. Tel: +86-431-84533348; E-mail: xiaokunli@https://www.sodocs.net/doc/ae10816268.html, 国家高技术研究发展计划(863计划) (No. 2007AA100503), 国家转基因生物新品种培育重大专项(No. 2008ZX08010-002)资助。 去除选择标记基因的Cre/lox 重组系统在植物中的应用 刘秀明1, 孟欣欣1, 李海燕1,2, 杨晶1, 付宏歧1, 李校堃1,3 1 吉林农业大学 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心, 长春 130118 2 吉林农业大学生命科学学院, 长春 130118 3 温州医学院, 温州 325035 摘 要: 获得无选择标记基因的转基因植物越来越受到研究者的重视。目前, 应用得较广泛的去除选择标记基因的方法有共转化法和位点特异性重组法, 其中位点特异性重组系统中Cre/lox 重组系统研究最多。以下介绍了Cre/lox 位点特异性重组系统的原理、特点及其近几年在植物中的应用, 针对本实验室在这一领域的研究情况, 重点阐述了Cre/lox 系统的应用前景。随着植物反应器研究领域的不断壮大, 去除筛选标记基因是植物反应器研究的必然趋势。 关键词: 无选择标记基因, Cre/lox 重组系统, 转基因植物 Application of the self excision Cre/lox system in plants Xiuming Liu 1, Xinxin Meng 1, Haiyan Li 1,2, Jing Yang 1, Hongqi Fu 1, and Xiaokun Li 1,3 1 Ministry of Education Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development , Jilin Agricultural University , Changchun 130118, China 2 College of Life Sciences , Jilin Agricultural University , Changchun 130118, China 3 School of Pharmaceutical Sciences , Wenzhou Medical College , Wenzhou 325035, China Abstract: Marker-free plants have been public concern. Co-transformation and site-specific recombination system are more important methods in self-gene excision. We reviewed the Cre/lox site-specific system and its applications in plants, also, we discussed perspectives of the system in according with our experience. Keywords : marker-free gene, Cre/lox site-specific recombination system, transgenic plant 近年来, 随着植物反应器的研究领域的壮大, 利用基因工程手段在植物中导入目的基因加工和生产蛋白的研究越来越多, 这就引起了转基因植物的安全生产问题。在利用植物反应器生产药用蛋白及疫苗的研究中, 常用的植物表达载体均含有选择标记基因和目的基因, 借助选择标记基因来筛选和检 测转化后的植株。而当目的基因被转入植株中后, 选择标记基因的存在对蛋白的提取、纯化及生产却带来了隐患, 人们担心利用植物作为生物反应器生产蛋白会带来非目的产品的基因工程产物, 同时它也引起了消费者和环境学家对生态环境和食品安全性问题的关注和担忧[1]。因此, 构建无选择标记基因

无选择标记转基因植物研究进展

无选择标记转基因植物研究进展 张洁,郑文永,王冬梅3 　(河北农业大学生命科学学院,河北保定071001) 摘要　综述了近年来国内外在植物无选择标记转基因技术方面的发展和研究成果,包括共转化法、转座子法(Ac/Ds 转座子系统)、位点特异性重组系统法(F LP/FRT 、Cre/LoxP 、R/RS )等。关键词　无选择标记;转基因植物;位点特异性重组;共转化中图分类号　S188 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2009)12-05390-03P rogress in M arker 2free T ransgenic P lants ZH ANG Jie et al (T he C ollege of Life Science ,Agriculture University of H ebei ,Baoding ,H ebei 071001)Abstract S om e techn ology and research results ab out m arker 2free transgenic plant were summ arized ,including co 2trans form ation ,transpos on system (Ac/Ds ),site 2specific recombination system (F LP/FRT ,Cre/LoxP ,R/RS )et.K ey w ords M arker 2free ;T ransgenic plants ;S ite 2specific recombination ;C o 2trans form ation 基金项目　河北省科技攻关计划项目(042401116D 21);河北省教育厅 项目(2008460);河北农业大学科研发展基金资助。 作者简介　张洁(1974-),女,河北冀州人,讲师,从事植物遗传转化 方面的研究工作。3通讯作者。 收稿日期　2009201222 近年来,随着商品化转基因作物的不断出现,人们对遗传工程生物的环境安全和食品安全问题的关注越来越多。在植物基因转移过程中,一般都使用选择性标记基因来鉴定外源目的基因是否导入植物体。然而,当获得了真正的转基因植株后,选择标记基因就失去了存在的价值,其继续表达的产物也会对环境及植物体的生长发育产生不良影响,从而对人类自身及生存环境和生态平衡造成潜在的威胁。如对于抗生素类选择标记基因的应用,人们最担心的是,这类基因的使用有可能被转移到微生物中,如果增加了这些微生物在人或动物消化道内的数量,这将危及抗生素在临床及兽医上的应用。再如对除草剂抗性基因的使用,如果这类基因流动到危害粮食作物生长的杂草中就会使其获得抗除草剂性能,而成为现有除草剂无法将其杀死的“超级杂草”[1] 。目前关于选择标记基因对健康和环境的影响问题尚无定论,直接影响了转基因植物在市场中的投入 [2] 。另外,在对转基因植 物进行二次或多次转化时,每一次转基因的插入都需要进行转化筛选,但可用于植物转基因筛选的标记基因非常有限,难以满足再转化时对多个标记基因的要求[3]。所以,人们期望建立一个可操作系统去除选择标记基因,以便通过重复转化来增加转基因的数目[4]。尽管安全性评估部门已报道,使 用新霉素磷酸转移酶(NPT Ⅱ )作为选择标记基因不存在健康或安全方面的问题[5],然而要对其他每一个选择标记基因及其产物进行安全性评价,将耗费大量人力、物力、财力及时间,影响转基因植物投入市场。因此,如何去掉转基因植物体内的筛选标记,培育不带选择标记基因的转基因植物 (marker 2free transgenic plants ,MFTPs )已成为当前植物基因工 程研究的迫切需要。笔者就当前国内外在植物无选择标记转基因技术方面的研究进展作一概述。 1　获得MFTPs 的方法 构建无选择标记基因的遗传转化系统是获得生物安全的转基因植物的有效途径。目前构建无选择标记基因的转基因系统的方法主要有:共转化系统(C o 2trans formation )、转座 子系统(T ransposable element )、位点特异性重组系统(S ite 2spe 2 cific recombination system )、不可逆重组系统(irreversible recom 2bination system )等。 1.1　共转化法　共转化是将标记基因和目的基因分别构建 在不同载体或同一载体的不同区域,共同转化受体细胞,通过筛选和分子鉴定获得共整合植株,在后代分离中选择只含有目的基因而不含有标记基因的转化植株。这主要是由于两个基因不可能完全位于同一个整合位点,因此转基因植株在其后的自交过程中,目的基因和标记基因会发生分离和重组,通过有目的筛选鉴定,可获得只含目的基因而不带抗性标记基因的转化植株,从而达到去除标记基因的目的。这个系统要求共转化频率高,且共转化的DNA 在受体细胞中处于不连锁状态,才可以满足剔除标记的需要。De Block 等[6]用两个农杆菌转化油菜,共转化率达60%～80%。M cK night 等[7]在烟草的转化中用两个分别带有不同基因的农杆菌进行转化,对后代进行筛选获得了只带有一个基因的转化体。刘峰等[8]利用双农杆菌/双质粒的共转化系统获得了无选择标记转磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的水稻植株。在实际应用中,由于不同转化质粒载体中的转基因共整合频率偏低,且常整合在受体基因组的同一位点上,使共转化系统的应用受到了限制。为了提高共转化效率,不同的研究者对共转化方法进行了改进[9-13]。目前一般认为,双T 2DNA 载体方法比混和菌株方法的共转化率高得多。在双T 2DNA 的策略中,K omari 等[9]进行的T i 质粒的构建需要在农杆菌内同源重组后才能完成,且质粒非常大,不利于基因克隆;X ing 等[10]、Breitler 等[11]构建的质粒无需同源重组,质粒较小,且操作简便,便于基因克隆,是较好的方法。Lu 等[12]将标记基因与关注基因设计在带双右边界序列(d ouble right 2b order , DR B )的T 2DNA 单元中,由于少了一个左侧边界,质粒更小, 便于基因克隆,获得了带水稻齿裂矮缩病毒基因组中第5个基因片段S5的无选择标记转基因水稻,且效率很高。2006年,张秀春等[13]用双T 2DNA 法获得了9株只含有功能基因 (△62脂肪酸脱氢酶基因,D 6D )而不含有筛选标记基因 (BAR )的转基因大豆,使T 2DNA 载体方法在转化频率相对较 低的大豆转化体系中得以成功应用。 1.2　转座子法　转座子成分能够利用保守的切割粘连机 制,从植物染色体中的某个位置转移到新的遗传座位。利用 安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2009,37(12):5390-5392,5405 责任编辑　李占东　责任校对　况玲玲

DNA分子标记及其优缺点

DNA分子标记种类及相应的优缺点 摘要：　对RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR 等常用的DNA 分子标记技术以及其他几种新兴的标记技术( SNP、EST 等) 的原理、特点进行了综述,并对各自的优缺点进行了探讨。 关键词：DNA分子标记优缺点 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。 ②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 1. 1 第1 代分子标记 1.1. 1 RFLP 标记技术。1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术 。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。 优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。 缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区。 1.1. 2 RAPD 标记技术。为了克服RFLP 技术上的缺点,Williams

无选择标记转基因技术研究进展

无选择标记转基因技术研究进展 摘要随着转基因技术的诞生，转基因植物中选择标记基因的安全性已受到了广泛的关注，如何培育无选择标记基因转基因植物已成为基因工程研究的重点。在植物基因转移过程中，筛选标记基因常被用于筛选转化细胞或组织，给转基因工作带来很大方便。但在获得转基因植物之后，筛选标记基因的表达往往对环境及植物体的生长发育产生不良影响，且不利于使用相同标记基因进行多重转化。为了消除这些弊端，一种全新的发展策略即获得无选择标记转基因植物应运而生。文章主要综述获得无选择标记转基因植物的方法。 关键词无选择标记转基因植物 Abstract：with the development of transgenic crops，the security of selectable maker gene in transgenic crops has been concerned extensively, and how to culture the selectable maker-free transgenic plants has become the emphasis of transgenic engineering.Selective marker gene is usually used to select transformed cells or tissue during gene transfer. However, the use of it is harmful to environment, plant development and affects multi-transformation. A new strategy that offers a approach for the elimination of those disadvantages caused by the selectable marker gene is develop. We summarized some methods of correlative maker genes’ removal. Key word: Selectable marker-free; Transgenic; Plant 前言 转基因植物的安全性已经引起了社会的普遍关注与争论，因为在植物的遗传转化过程中需要借助选择标记基因的功能筛选转化体。而选择标记基因一般是一些抗生素抗性基因和抗除草剂基因，这些基因在转化成功后会长期存在于转基因植物中。因此，对转基因技术持反对态度的学者担心。第一，人们在食用了转基因产品后，抗性标记基因是否会水平转移到肠道微生物体内或上皮细胞中，从而降低抗生素在临床中的有效性。第二，标记基因可能会转移到杂草和其他物种上而产生所谓“超级杂草”和超级病虫害"或打破原有生态平衡，造成生态失衡。对于转基因技术本身而言，标记基因与目的基因一般由同一种启动子驱动，它的存在可能会导致目的基因的沉默或失活。而且转基因过程中所用的标记基因数量有限，由于标记基因的存在，若要对已转化的植株进行再转化，筛选也是一个困难。标记基因的存在增加了转基因植物基因组的大小，不利于转基因植物的遗传稳定性。由此可见，选择标记基因的存在严重地阻碍了转基因植物的商品化进程和转化技术本身的有效性。因此，怎样培育无选择标记转基因作物已成为近年来植物基因工程研究的重点之一。迄今已有多种方法应用于无选择标记转基因植物的培育上。 1位点特异性重组系统 位点特异性重组系统是利用重组酶催化两个短的特定NDA序列间的重组，来消除选择标记基因，以获得无选择标记的转基因植物。Cre/lox P位点特异性重组系统是从大肠杆菌噬菌体P1中获得的,它包括2个组件,重组酶(Cre)和重组位点(lox P)。Cre酶引发重组事件并引起相邻2个lox P位点之间NDA片段的切除。该方法主要包括以下3个步骤：①通过含有选择标记基因（selectable marker genes, SMG）和两侧均有lox P的目的基因(gene of interest, GOI)的双元载体(GOI/lox/SMG/lox)转化获得转基因植株。②通过再转化或杂交授粉向转基因植株导入Cre基因（与另一个标记基因相连）；③植物基因组中切除两侧均有lox P的SMG 或通过杂交将GOI与Cre基因分离[2]

“基因的本质基因的表达”易错题(徐以润)

“基因的本质、基因的表达”易错题精选（徐以润）徐以润江苏省灌南县高级中学（222500） 1.在细胞分化的过程中，基因选择性表达的直接结果是 A、合成不同的蛋白质 B、合成不同的糖类 C、细胞具有不同的功能 D、细胞具有不同的DNA 答案：A 解析：注意题干强调“基因选择性表达的直接结果”A项是基因选择性表达的直接结果，而BCD三项不是基因选择性表达的直接结果。 2.我国科学工作者近年来成功地克隆并测出了庚型肺炎病毒的全部基因序列，该病毒核酸全长9213个核苷酸，一端的168个核苷酸和另一端的423个核苷酸不能编码蛋白质，则庚型肝炎病毒的核酸可编码的蛋白质含氨基酸数最多为 A、2874 B、2873 C、1458 D、1437 答案：A 解析：庚型肝炎病毒的核酸是RNA，可以直接翻译，即（9213—168—423）/3=2874 3.人体中具有生长激素基因和血红蛋白基因，两者 A、分别存在于不同组织的细胞中 B、均在细胞分裂前期按照碱基互补配对原复制 C、均在细胞核内转录和翻译 D、转录的信使RNA上相同的密码子翻译成相同的氨基酸 答案：D 解析：信使RNA上相同的密码子翻译成的氨基酸一定相同 4.已知AUG、GUG为起始密码，UAA、UGA、UAG为终止密码。某原核生物的一个信使RNA碱基排列顺序如下：A一U一U一C一G一A一U一G一A一C……(40个碱基)……一C一U 一C一U一A一G一A一U一C一U信使RNA控制合成的蛋白质含氨基酸的个数为 A.20个 B.15个 C.16个 D.18个答案：C 解析：从起始密码AUG到终止密码UGA为止共有17个密码子，终止密码UGA没有对应的氨基酸，所以题目中的信使RNA控制合成的蛋白质含氨基酸的个数为16 5.下面是几个同学对有关蛋白质和核酸之间关系的总结，你认为其中错误的是

综述-分子标记

分子标记 遗传标记作为识别基因型的表现形式，在生物基因研究方面起到了重要作用，目前通过遗传标记的方法定位基因位置已成为基因定位的常用方法。遗传标记主要有形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）四种类型。形态标记、细胞标记因其自身局限性的原因，目前鲜有使用。虽然以同工酶标记为代表的生化标记得到了广泛的发展，但由于其检测的范围狭窄、统计难度大等缺陷，目前仅在少数方面有所应用。从20世纪70年代分子标记出现至今的40年，分子标记因其无比的优越性，使得其成为目前应用最广泛的遗传标记方法。 一、分子标记的概念 分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记。广义的分子标记是指可遗传并能检测的蛋白质或DNA序列。而狭义的分子标记仅仅是指基于DNA分子多态性构建的标记方法。 二、分子标记的特点 理想的分子标记一定要达到以下标准：1、具有高的多态性；2、共显性遗传即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；3、能明确辨别等位基因；4、遍布整个基因组；5、除特殊位点的标记外要求分子标记均匀分布于整个基因组；6、选择中性即无基因多效性；7、检测手段简单、快速如实验程序易自动化；8、开发成本和使用成本尽量低廉；9、在实验室内和实验空间重复性好便于数据交换。 目前，在现实条件下并没有这种绝对理想的分子标记，但相比形态标记、细胞标记、生化标记，分子标记依旧有着明显的优越性：1、直接以DNA形式表现，在生物体各组织、各时期均可检测，不受环境限制；2、数量多，遍布全基因组，有近乎无限的检测座位；3、多态性高；4、表现为中性，不影响目标性状的表达；5、许多标记为共显性，能区别纯合体与杂合体。 三、分子标记的分类 分子标记技术通常被分为基于分子杂交的分子标记技术（RFLP）（或叫做非PCR基础上的分子标记技术）、基于PCR技术的分子标记技术和同时基于分子杂交和PCR两种技术的分子标记技术三大类型。基于PCR技术的分子标记技术又可分为基于随机引物的PCR分子标记技术（或叫非特异PCR分子标记技术）和基于特异引物的PCR分子标记技术（或叫特异PCR分子标记技术）。随着分子标记技术的不断发展，许多新兴分子标记技术的出现，人们又根据分子标记的基因组来源将分子标记技术分为随机DNA分子标记（Random DNA Markers，RDM）、目的基因分子标记（Gene Targeted Markers，GTM）和功能性分子标记(Functional Markers，FM)。 1、限制性片段长度多态性标记 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）由Grodzicker等人于1974年基于DNA被限制性内切酶酶切后形成特定大小的片段。其优点在于：1、广泛存在；2、共显性，可区分纯合与杂合；3、结果稳定可靠，重复性好。正是有了这些优点，RFLP作为最早出现的分子标记方式，曾被广泛应用。但由于其在使用时需要用放射性同位素标记、酶切时对DNA质量要求高、标记的多态性变异程度偏低等原因，使得RFLP很快就被新的分子标记所替代。 2、随机扩增多态性DNA标记 随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是以基因组DNA 为模板，以人工合成的随机引物，通过PCR 扩增反映扩增片段的DNA片段导入、缺失以及引物结合位点上的碱基突变。RAPD只需合成一套引物，就可可用于不同生物基因组的分析；RAPD技术简便易行，省力省时，并且检测灵敏方便；RAPD分析所需样品DNA量极

基因工程选择题

1．因研究重组DNA技术而获得诺贝尔奖的科学家是( ) (a)A．Kornberg (b)W．Gilbert (c)P．Berg (d)B．McClintock 2．第一个作为重组DNA载体的质粒是( ) (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl8 3．关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。 (a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成 (b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶 (c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA 进行修饰 (d)不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统 4．Ⅱ型限制性内切核酸酶：( ) (a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列 (b)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 (c)限制性识别非甲基化的核苷酸序列(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性 (e)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 5．下面有关限制酶的叙述哪些是正确的?( ) (a)限制酶是外切酶而不是内切酶 (b)限制酶在特异序列(识别位点)对DNA进行切割 (c)同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同的 (d)一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA，产生黏末端 (e)一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA，产生平末端 6．第一个被分离的Ⅱ类酶是：( ) (a)EcoK (b)HindⅢ(c)HindⅡ(d)EcoB 7．在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最

好?( ) (a)反应时间(b)酶量(c)反应体积(d)酶反应的温度 8．在下列试剂中，那一种可以螯合Ca2+离子?( ) (a)EDTA (b)柠檬酸钠(c)SDS (d)EGTA 9．在下列工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性?( ) (a)S1单链核酸酶(b)末端转移酶(c)碱性磷酸酶(d)Bal 31核酸酶 10．限制性内切核酸酶可以特异性地识别：( ) (a)双链DNA的特定碱基对(b)双链DNA的特定碱基序列 (c)特定的三联密码(d)以上都正确 11．下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是( )。 (a)Sau3A I (b)E．coRI (c)hind III (d)Sau 3A1 12．限制性内切核酸酶的星号活性是指：( ) (a)在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性。 (b)活性大大提高 (c)切割速度大大加快(d)识别序列与原来的完全不同 13．下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?( ) (a)甘油含量过高(b)反应体系中含有有机溶剂 (c)含有非Mg2+的二价阳离子(d)酶切反应时酶浓度过低 14．关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当 (a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成 (b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶 (c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA 进行修饰 (d)不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统 15．在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用( )

什么是基因选择性表达

什么是基因选择性表达？ 基因选择性表达是普遍的 基因选择性表达是普遍的 由于细胞分化发生于生物体的整个生命进程中，所以基因的选择性表达在生命过程各阶段都在体现。不仅如此，基因的选择性表达在单细胞原核、真核生物生长发育中，甚至病毒的生命活动中都明显表现，这充分体现了基因的选择性表达的普遍性。 细胞分裂与基因选择性表达 在多细胞生物的个体发育中，受精卵有丝分裂增加细胞数目，产生的细胞大多数不再分裂，细胞中特定的基因通过转录翻译合成蛋白质，表现出特定的形态、结构和生理功能，形成不同的细胞和组织。 如：动物和人的红细胞和心肌细胞都来自同一胚层，后来分化出的红细胞合成出血红蛋白，而心肌细胞则能够合成肌动蛋白和肌球蛋白。 即使在细胞分裂过程中，基因的选择性表达同样存在。如在细胞分裂间期、分裂期，仅仅是部分基因在表达，合成了特定的蛋白质、酶用于分裂过程，绝大部分基因没有表达。 成熟、衰老与基因选择性表达 植物 在成熟期，参与细胞分裂的基因基本不表达，用于物质转化的相关蛋白质等的基因在表达，合成相应的蛋白质、酶等。如马铃薯块茎、甜菜块根形成后，细胞中用于合成葡萄糖转化为乳酸的酶的基因进行了表达，故它们无氧呼吸时产物是乳酸，有利于减少物质能量浪费，还降低了对细胞的伤害程度。 人和动物 人和动物的第二特征的表现，是生长发育到一定阶段基因选择性表达的结果。而在衰老过程中，用于正常代谢的酶合成受到抑制或数量减少，加速了衰老的程度，也是基因的选择性表达的结果。 程序性死亡（apoptosis）的理论假说也认为死亡的细胞是通过基因的选择性表达实现的。 单细胞生物 作为单细胞生物，产生新个体常常通过细胞分裂的方式，细胞分裂中的仍有部分基因在表达。新细胞（或新个体）生长发育中过程中，特定的基因在不同阶段表达，细胞完成相应的生理活动适应了特定的环境。 例1：草履虫 通过实验比较双小核草履虫单独培养和与大草履虫混合培养发现其细胞内的基因表达有显著不同：混合培养时产生的蛋白质种类和数量远远超过单独培养的情况，增强了其竞争力。 例2：细菌 细菌在环境条件适应时，基因选择性表达保证正常的生长繁殖与生存，一旦环境恶化，细菌体内特定的基因进行表达，使其形态结构改变，出现荚膜、芽孢等特殊结构助其度过危机。 非细胞结构：病毒 病毒寄生在宿主细胞内，基因表达也有选择性，使其衣壳有不同的形态或使其表现出不同的抗原性（或致病性）。如禽流感病毒中基因表达不同的蛋白质类物质，致病性相差较大。对人和鸟类都有致病作用的是H5N1，