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福林酚法

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Folin酚法测定蛋白酶活力

(2009-06-16 18:03:47)

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生物

蛋白酶活力测定

folin酚法

原理

杂谈

分类:专业学习

一、原理

采用福林-酚试剂法。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物),由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等),可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物,在一定pH值和温度条件下,同酶液反应,经一段时间后终止酶促反应,经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液,用Na2CO3碱化,再加入福林-酚试剂显色,蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定,从而计算出蛋白酶的活力。

二、试剂

1) 福林-酚试剂

向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na

2WO

2

?2H

2

O)、25g钼酸钠及700mL

的去离子水,再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL,充分混合后,接上回流冷凝管,以小火回流10h,结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴液溴,再继续沸腾15min,以驱除过量的溴,冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色,需再重复滴加溴水的步骤),加去离子水定容至1000mL,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中,贮于冰箱中可长期保存备用。此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。

2) 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液

精确称取TCA65.4g,加去离子水定容至1000mL。

3) 0.4mo1/L碳酸钠溶液

精确称取无水碳酸钠42.4g,加去离于水溶解后,定容至1000mL。

4) pH值3~6醋酸缓冲液

精确取NaAc?3H

O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合,用去离子水稀释定

2

容至1000mL。

5) 2%酪蛋白底物缓冲液

a) 测试酸性蛋白酶缓冲液

精确称取酪蛋白20g,加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制),在水浴中加热溶解,然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。当日配用或置于冰箱中保存。

b) 测试中性蛋白酶缓冲液

精确称取酪蛋白20g,置于1000mL三角瓶中,加入0.2mol/L Na2HPO4溶液(去离子水配制)610mL,在沸水浴中搅拌使其溶解,冷却后过滤,加入0.2mol/L Na2HPO4溶液(去离子水配制)390mL,用去离子水定容至1000mL,即成pH7.0、2%酪蛋白溶液。当天配用或置于冰箱中保存。

6) 100μg/mL酪氨酸溶液

精确称取100mg酪氨酸,逐步加入0.lmol/L盐酸溶解后,用去离于水定容至100mL放入冰箱中保存,临用时用去离子水稀释10倍。

三、操作步骤

1. 酪氨酸标准曲线的绘制

取18支试管分成6组(每组3支,平行样),编号,按表1分别加入标准酪氨酸、去离子水、0.4mol/L的碳酸钠和福林-酚试剂,混匀后,放入40℃水浴保温20min,然后在721型分光光度计上进行比色测定(波长660nm),以浓度为0μg/mL酪氨酸溶液做空白对照。

2. 样品酶活的测定

酶液适当稀释。取4支试管编号(1号为空白对照),分别加入酶液1mL,1号管立即加入0.4mol/L TCA溶液2mL,使酶失活,另3支样品加入lmL pH 7.0、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液(如测酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物缓冲液),迅速混匀,并立即放入40℃恒温水浴准确计时,保温10min后,立即加入

0.4mol/LTCA溶液2mL,终止反应,同时向1号空白管中加入1mL2%酪蛋白底物缓冲液,摇匀,继续置于水浴中保温20min,取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物,然后取各试管滤液1mL,分别移入另4支试管中,再加入0.4mol/L 碳酸钠溶液5mL和己稀释的福林-酚试剂1mL,摇匀,保温显色20min后,进行比色测定(波长660nm)。对照标准曲线,计算酪氨酸含量。

四、蛋白酶活力计算

蛋白酶活性定义:在一定pH值(pH3.6或7.0)和40℃温度条件下,每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。

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几种测蛋白含量方法的比较

蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 (一)蛋白质测定方法的比较(原理、优缺点)蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry法)和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:(1)实验测定要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定花费时间。蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry法)和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:(1)实验测定要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定花费时间。 1微量凯氏定氮法(GB 5009.5-2010) 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高,适用于0.2~ 1.0mg氮,误差为±2%;操作复杂费时,整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。,测得结果为总氮含量,包括蛋白氮和非蛋白氮含量;适用范围广,几乎所有样品均可用此方法。 2 双缩脲比色法 2.1原理双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法。因蛋白质含有两个以上的肽键,所以有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物,在一定的实验条件下,未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应,并于540~560nm测定,即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。

福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度实验报告完整版

福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度 一、原理 蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸,在碱性条件下,可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色(生成钼蓝和钨蓝化合物)。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比,可用比色法测定。 二、实验仪器 分光光度计,试管,移液管,容量瓶,分析天平,烧杯 三、实验试剂 1.Folin-酚试剂甲:碱性铜溶液 甲液:取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中 乙液:取CuSO4.5H2O晶体0.5g,溶于1%酒石酸钾100ml。 临用时按甲:乙=50:1混合使用。 2.Folin-酚试剂乙:将10g钨酸钠、2.5g钼酸钠、70ml蒸馏水、5ml85%磷酸继10ml浓盐酸置于150ml的磨口圆底烧瓶中,充分混匀后,接上磨口冷凝管,回馏1小时,再加入硫酸锂15g,蒸馏水5ml及液溴数滴,开口煮沸15分钟,在通风橱内驱除过量的溴。冷却,稀释至100ml,过滤,滤液成微绿色,贮于棕色瓶中。临用时,用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定,用酚酞作指示剂,根据滴定结果,将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。 标准蛋白质溶液:称取1g牛(人)血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中,并稀释至1000ml

四、实验步骤 1.标准曲线的绘制 取7支干燥洁净的试管,编号,按下表加入试剂,比色后,以光密度为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标作图。 各管加入1mlFo1in 酚试剂乙后,立即摇匀,放置15分钟后比色,在500nm 处记下各管光密度,以0号管为对照,以吸光度为纵坐标,标准蛋白质溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线 2.样品测定 准确吸取样液于干燥的试管中,同样按下表加入试剂,测出光密度值后,对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。 室温放置10分钟后,再各加1毫升Fo1in 酚试剂乙,立即摇匀,放置15分钟,在500nm 处测定光密度值。 五、实验结果 管号 试剂 1 2 样液(ml ) 1.0 1.0 Folin-酚试剂甲 5.0 5.0 (ml )

福林酚法测蛋白浓度

87 ...“It is flattering to be ‘most cited author,’but I am afraid it does not signify great scientific accomplishment. The truth is that I have written a fair number of methods papers, or at least papers with new methods included. Although method development is usually a pretty pedestrian affair, others doing more creative work have to use methods and feel constrained to give credit for same 1.... Nevertheless, although I really know it is not a great paper (I am much better pleased with a lot of others from our lab), I secretly get a kick out of the response.... “Perhaps you would be interested in a little about the history of the method. Back in 1922, Wu, who worked with Folin,applied the reagent to proteins, without CU 2+, so it was based on the tyrosine and tryptophane contents of the protein. This procedure was used sporadically for some time and had a reputation for erratic results,probably because traces of contaminating CU 2+ would increase the readings. Herriot, in a 1935 footnote to another paper,mentioned that CU 2+ enhanced readings with protein, and in 1941 published a short communication describing the CU 2+ enhancing effect for 7 proteins, and giving convincing evidence that the enhancement was attributable to reaction with peptide bonds. “Before I came to St. Louis we had need of a micro method for protein, studied the reaction some more, and came up with a revised procedure which we felt was an improvement, particularly in regard to application to a variety of situations.Actually, however, we had made few fundamental changes from the method of Herriot, and had never really intended to publish it. “When I came to St. Louis in 1947 Earl Sutherland, who was here then, adopted our procedure, but for several years complained that he had to cite it as ‘personal communication,’ and, he inquired, why didn’t we write it up? So we finally went to work and did the necessary things: studied the reaction more thoroughly, tested it a lot of ways,described its virtues and disadvantages,compared the results with a Kjeldahl procedure, investigated what interfered, etc.“This was a lot of work and the three co-authors helped in various ways. The greatest help was from Miss Nira Rosebrough (now Mrs. Nira R. Roberts) who became one of the best technicians I have ever had. She left us in 1957, worked for awhile with Dr. Rosen in Buffalo, and then quit science to raise a family. Dr. A. Lewis Farr (M.D.) was a post-doctoral student who had an outstanding record in medical school but decided after a year or so to go into private practice in his hometown in Greenville, Mississippi. Mrs.Randall was a technician who stayed at most a year, then left with her husband, and I don’t believe has been in science since, but I have lost track of her. “I...am puzzled why the paper is so often cited, and cited as such. I would like to think it is partly because we studied it pretty thoroughly and it is still applicable in most cases without modification, whereas the original Kjeldahl method, for example, has had innumerable major modifications and microfications, and people cite the particular modification they use. Another reason why our method isn’t simply referred to by name is that it’s quite a mouthful to say ‘Lowry,Rosebrough, Farr, and Randall.’ The method apparently filled a need in the beginning—and a lot of people measure proteins in their work.Once it became established by people like Sutherland and Kornberg, other people may have thought it was the method to use, or at least checked the procedure they were using against it.”2 1.Lowry O H. Personal communication to D.J.D. Price, November 11, 1969. 2.Lowry O H. Personal communication to E. Garfield, August 5, 1976. ...The authors assert that the use of the Folin phenol reagent for the measurement of proteins “has not found great favor for general biochemical purposes.” This study is concerned with modifying the Folin phenol reagent procedure by treating protein solutions “with copper in alkali.” By recording the color change after the copper treatment, and measuring the quantity of protein present with a Beckman spectrophotometer, the authors determined that “measurement of protein with copper and the Folin reagent” is more sensitive and simpler than other procedures. Professor Oliver H. Lowry: Number 1 January 3, 1977 Citation Classics Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A L & Randall R J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265, 1951.

BCA法测蛋白含量

THE BICINCHONINIC ACID (BCA) ASSAY FOR DETERMINATION OFTOTAL PROTEIN Principle原理 Smith et al. (1985) introduced the bicinchoninic acid (BCA) protein assay reagent. Inone sense, it is a modification of the Lowry protein assay reagent. The mechanism ofcolor formation with protein for the BCA protein assay reagent is similar to that ofthe Lowry reagent, but there are several significant differences. The BCA protein assayreagent combines the reduction of Cu2+ to Cu+ by protein in an alkaline medium (i.e., thebiuret reaction) with the highly sensitive and selective colorimetricdetection of the cuprous cation (Cu+) by bicinchoninic acid.The purple-colored reactionproduct of this method is formed by the chelation of two molecules of BCA with onecuprous ion (Fig. A.3H.3). The BCA/copper complex is water-soluble and exhibits astrong linear absorbance at 562 nm with increasing protein concentrations. The primaryadvantageoftheBCAproteinassayreagentisthatmostsurfactants,evenifpresentinthesample at concentrations up to 5% (v/v), are compatible with this method. Table A.3H.2is a brief troubleshooting guide for this technique. 二喹啉甲酸(BCA)法是在福林酚法的基础上改善而来的,即在碱性条件下蛋白质将二价铜离子还原成一价铜离子,然后与BCA试剂反应生成紫色化合物,在562 nm处检测。

实验一蛋白质含量测定

实验一蛋白质含量的测定 姓名:mangogola 一.实验原理 生物化学实验中,经常需要测定蛋白质的含量,一般常用的蛋白质含量测定方法有紫外吸收法、福林酚试剂法以及一些改进的Lowry法可以应用。 紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸中的苯环含有共轭双键,因此蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收高峰在280nm处,且蛋白质溶液的光密度值与其含量呈正比关系。该方法具有简单、灵敏、快速和不消耗样品的优点,但易受核酸分子中嘌呤、嘧啶等的干扰,准确度较差。根据蛋白质和核酸的吸收峰不同,可通过计算适当校正核酸的干扰作用。 Lowry法的原理是:在碱性条件下,蛋白质与铜离子形成铜-蛋白质复合物,该复合物可还原磷钼酸-磷钨酸(Folin试剂)产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物。该方法灵敏度较高,但较费时。 对膜蛋白或相当稀的(如<1ug/ml)蛋白溶液的含量测定,以及为减小去污剂、脂类、碳水化合物的干扰,可采用一些改进的Lowry法,如蛋白质-染料结合法。原理是:当染料考马斯亮蓝G250与蛋白质结合时,最大吸收峰从465nm移动到595nm,而且吸收值在一定蛋白浓度下线性相关,因此用标准浓度的蛋白测OD595作标准曲线,即可求得待测样品的蛋白浓度。此方法简单经济、快速、灵敏度也较高。需要注意的是,染料与蛋白质可在3min内完成结合,由于染料试剂中含有酒精成分,易挥发,所以结合生成的复合物在1h 内可比较稳定地存在于溶液中,制作的标准曲线后部会出现弯曲现象。 二.实验过程(Lowry法) 1.溶液配制 A液:2%Na2CO3,用0.1mol/LNaOH配制。(不能将NaOH和 Na2CO3干粉混合配制,这样会因释放CO2而不准确) B液:0.5%CuSO4.5H2O,用1%酒石酸钾或酒石酸钠配制。 C液:使用前将A、B液按50:1混合,当天使用。 D液:Folin试剂 标准蛋白溶液:200ug/mLBSA溶液 2.标准曲线测定 按照下表进行操作,用一系列标准浓度的BSA平行进行两组测定反应,记录A500。取两组测定的平均值,以蛋白浓度为横坐标,光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 3.将待测样品稀释至标准曲线浓度范围内,同时按上述方法测A500,根据标准曲线读出蛋

食物中蛋白质含量的测定

一、实验摘要: 蛋白质是含一定量氮的有机化合物。其测定方法也有很多种。不同的方法都有其优点和缺点,以及它们的适用范围不同。 紫外吸收法(方便快捷,0.2-2mg/ml) 凯氏定氮法(粗蛋白测定,0.2 – 2.0mg /ml) 双缩脲法(1-10mg /ml) 福林酚法(0.005-0.10mg /ml) G250 (0.025-0.20mg /ml) (考马氏亮蓝法) BCA法(0.010-1.2mg/ml;0.0005-0.001mg/ml) 此次实验采用牛奶样品在凯氏烧瓶中经浓硫酸和催化剂消化后,使蛋白质分解,产成的氨与硫酸结合生成硫酸铵,再在强碱条件下蒸馏出氨,并用硼酸吸收,以标准盐酸滴定,根据标准酸消耗的量,乘以一定系数,即可计算样品中蛋白质的含量。此次实验中使用的是乳制品,系数F=6.38.这种测定方法即为凯氏定氮法。因为食品中除蛋白质外,还含有其他含氮物质,所以此蛋白质称为粗蛋白质。此次实验后,我们组的最终得率为2.77%。 二、实验目的: 1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理 2、掌握凯氏定氮法的操作技术,包括样品的消化处理,蒸馏、滴定及蛋白 质含量计算等 3、侧面了解测定食品中蛋白质含量的多种方法和优劣 三、基本原理: 利用浓硫酸及催化剂与食品试样一同加热消化,使蛋白质分解,其中C、H 形成CO 2、H 2 O逸出,而氮以氨的形式与硫酸作用,形成硫酸铵留在酸液中。然后 将消化液用NaOH碱化,蒸馏,使氨游离,用水蒸气蒸出,被硼酸吸收。用标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵,从消耗的盐酸标准液计算出总氮量,再折算为粗蛋白含量。 1.有机物中的氮在强热和CuSO4,浓H2SO4作用下,消化生成(NH4)2SO4 反应式为:H2SO4==SO2↑+ H2O +[O] R-CH2-COOH+[O]==R-CO-COOH+ NH3↑

福林酚测定法

福林酚测定法 试剂碱性铜试液取氢氧化钠10g,碳酸钠50g,加水400ml使溶解,作为甲液;取酒石酸钾0.5g加水50ml使溶解,另取硫酸铜0.25g,加水30ml使溶解,将两液混合,作为乙液。 临用前,合并两液,并加水至500ml。 操作法⑴对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品,加水制成每1ml中含0.3ml的溶液。 ⑵供试品溶液的制备照各药品项下的方法制备。 ⑶标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml,分别置具试管中,各加水至1.0ml,再分别加入碱性铜试液1.0ml,摇匀,各加入福林酚试液(取福林试液中的贮备液1→16)4.0ml,立即混匀,置55℃水浴中准确反应5分钟,置冷水浴中10分钟,在650nm的波长处测定吸收度;同时以0号管作为空白。以吸收度作为纵坐标,对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。 ⑷测定法精密量取供试品溶液1.0ml,照标准曲线的制备项下的方法,自“加入碱性铜试液起,依法测定,自标准曲线上查得供试品溶液的浓度,并乘以稀释倍数。 二)试剂与器材 1.试剂 (1)试剂甲: (A)10克 Na2CO3,2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)。溶解于500毫升蒸馏水中。 (B)0.5克硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸馏水中,每次使用前,将50份(A)与1份(B)混合,即为试剂甲。 (2)试剂乙:在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠(Na2WO4·2H2O),25克钼酸钠(Na2 MoO4·2H2O)及700毫升蒸馏水,再加50毫升85%磷酸,100毫升浓盐酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小时,回流结束时,加入150克硫酸锂(Li2SO4),50毫升蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至1升,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH 滴定,酚酞作指示剂,然后适当稀释,约加水1倍,使最终的酸浓度为1N左右。 (3)标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或γ—球蛋白,溶于蒸馏水,浓度为250μg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊,可改用0.9%NaCl溶液。 2. 器材 (1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)秒表 (4)试管16支

S0P·ZL·09·QC·005·02 福林酚测定标准操作规程

1 目的 建立福林酚测定法,保证蛋白质含量检查有章可循。 2 范围 适用于福林酚测定法的标准操作。 3 内容 3.1制定依据 《中华人民共和国药典》2015年版四部附录第96页 3.2 简述 3.2.1本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白质-铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原,产生蓝色化合物,同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。 。本法干扰物质较多,对双3.2.2 本法灵敏度高,测定范围通常可达20~250g 缩脲反应产生干扰的离子,同样容易干扰福林酚反应,且影响还要大。还原物质、酚类、枸橼酸、硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。 3.3 试药 氢氧化钠、碳酸钠、酒石酸钾、硫酸铜、钨酸钠、钼酸钠、磷酸、硫酸锂、盐酸、溴 3.4 仪器 恒温水浴箱 3.5用具 具塞试管 3.6试液 详见《试液与试纸配制标准操作规程》 3.7 操作法 3.7.1 对照品溶液的制备 取牛血清白蛋白对照品,加水溶解并制成每1ml中含0.2mg的溶液。 3.7.2 供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。 3.7.3 测定法 精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml(对照品溶液取

用量可在本法测定范围内进行适当调整),分别置具塞试管中,各加水至1.0ml,再分别加入碱性铜试液1.0ml,摇匀,室温放置10分钟,各加入福林酚试液[取福林试液中的贮备液(2mol/L酸浓度)1→16]4.0ml,立即混匀,室温放置30分钟,照《紫外-分光光度法标准操作规程》在650nm的波长处测定吸收度;同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量,同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度,并乘以稀释倍数,即得。 4 附件 无 5 培训 培训部门:质量部 培训对象:QC成员 6 变更历史

福林酚法测蛋白

福林-酚法的原理该方法是双缩脲法的发展,包括两步反应: (1)在碱性条件下,蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。 (2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(FolIn试剂)还原,混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物),颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便,灵敏度比双缩脲法高100倍,定量范围为5~100μg蛋白质。FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起,因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物,均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响,即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同,标准曲线也不是严格的直线形式。 【仪器与用具】 试管若干;刻度移液管0 5Ml 1支,1Ml 1支,10Ml 1支;定量加样器;圆底烧瓶;冷凝管1套(带橡胶管);微量滴定管;小烧杯;微量进样器50μl 1支;721分光光度计;恒温水浴器;研钵;玻棒;离心机;离心管。 【试剂】 NA2WO4·2H2O;NA2MoO4·2H2O;85%H3PO4;浓HCl;LI2SO4·H2O;溴水;酚酞指示剂;NA2CO3;NAOH;CuSO4·5H2O;酒石酸钾钠;牛血清白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。 【方法】 1 试剂的配制 (1)碱性铜试剂(相当于双缩脲试剂)的制备首先配制A液:4%碳酸钠(NA2CO3)溶液与0.2Mol/L氢氧化钠(NAOH)溶液等比例混合(2%NA2CO3,0 1Mol NAOH);B液:1%硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合(0.5%CuSO4·5H2O,0.1%酒

石酸钾钠)。在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。此为FolIn—酚试剂甲液,此试剂只能使用1天。 酚试剂(相当于FolIn试剂)的配备:称取钨酸钠(NA2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(NA2MoO4·2H2O)25g,加蒸馏水700Ml溶解于1500Ml 的圆底烧瓶中。之后加入85%的H3PO450Ml,浓HCl 100Ml,安上回流装置(使用磨口接头,若用软木塞或橡皮塞时,就必须用锡铂纸包起来),使其慢慢沸腾10H。冷却后加入硫酸锂(LI2SO4·H2O)150g,水50Ml,溴水2~3滴,不用回流装置开口煮沸15Min,以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000Ml,并过滤入棕色瓶中,密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色,倘若仍呈绿色,须再滴加数滴液体溴,继续煮沸15Min)。使用时用标准NAOH溶液滴定,以酚酞作为指示剂,滴定终点由蓝变灰,滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍,使最终浓度相当于1Mol/L H+酸,此为FolIn-酚试剂乙液(FolIn试剂)。 在测定时要注意,因为酚试剂仅在酸性条件下稳定,但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生,所以当加酚试剂时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应,否则会使显色程度减弱。 (2)标准蛋白质溶液的配制称取25mg牛血清白蛋白,溶于100Ml蒸馏水中,使最终浓度为250μg/Ml。 2 标准曲线的绘制 (1)取7支试管,编号后,分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液,用蒸馏水补足1Ml,使每管含蛋白量分别为0μg、25μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg(必要时可做重复)。 (2)在每支试管中用定量加样器加入5Ml甲液,混匀,于30℃下放置10Min。 (3)在每支试管中喷射加入0.5Ml乙液,立即振荡混匀,在30℃下保温30Min。 (4)准确到30Min后,以不加标准蛋白试管中的溶液为空白,在500nM下用1CM光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色,测定光密度值。

福林-酚测定蛋白质

应用生化设计实验论文 学院:漓江学院 专业:生物技术 组员: 吴玉芳 200913007010 陆艺中 200913007009 指导老师:刘晓灿 2011年10月23日 广西师范大学

福林-酚试剂法测定鸡蛋中的酪蛋白含量 吴玉芳,陆艺中 摘要:本实验采用福林-酚试剂分光光度法测定鸡蛋中酪蛋白的含量。试样用PH4.6乙酸钠缓冲液0.2mol/L将酪蛋白从鸡蛋细胞破碎液中分离出来,用体积比为1:1的乙醇、乙醚混合液提取,再用95%乙醇来将酪蛋白粗制品中的脂类杂质除去,在表面皿上摊开除去乙醚后即为酪蛋白纯品。将酩蛋白纯品溶于蒸馏水后,取1ml样液先加入试剂甲,混合后于室温下放置10min,再加入试剂乙,混匀。室温下反应30min,于500nm波长下测定其密度。以牛血清蛋白标准溶液(250ug/ml)为标样,取6支试管将其进行梯度稀释后,各加入5ml试剂甲,混合后于室温下放置10min,再加入试剂乙,混匀。室温下反应30min,于500nm波长下测定其密度,以OD500为纵坐标,蛋白质含量为横坐标,绘制标准曲线,得曲线方程为y=0.2x+0.233。从标准曲线查出1ml样品酪蛋白的含量为2.185mg。计算出每100g鸡蛋中酪蛋白含量为43.70mg,从而对人体营养摄取进行指导。 关键词:酪蛋白、定量测定、福林酚试剂法、深蓝色复合物、标准曲线 福林—酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。此后在生物化学领域得到广泛的应用。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即福林—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。福林—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠,氢氧化钠,硫酸铜及酒石酸钾钠组成。 酪蛋白目前主要作为食品原料或微生物培养基使用,利用蛋白质酶促水解技术制得的酪蛋白磷酸肽具有防止矿物质流失、预防龋齿,防治骨质疏松与佝偻病,促进动物体外受精,调节血压,治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效,尤其是其促进常量元素与微量元素高效吸收的功能特性使其具有“矿物质载体”的美誉,它可以和金属离子,特别是钙离子结合形成可溶性复合物,一方面有效避免了钙在小肠中性或微碱性环境中形成沉淀,另一方面还可在没有VD 参与的条件下使钙被肠壁细胞吸收。[1] 酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零,同种电荷间的排弃作用消失,溶解度很低,利用这一特性,将过滤得到的滤液调到PH4.6,酪蛋白就能从滤液中分离出来。 酪蛋白由于与脂质结合比较牢固,难溶于水,稀盐溶液,稀酸溶液中,因此必须有机溶剂提取,酪蛋白不溶于乙醇,这个性质被利用来从酪蛋白粗制品中将脂类杂质除去。[2] 蛋白质与福林-酚试剂反应,生成深蓝色复合物,蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比,可用分光光度计与500mm波长下进行测定,与标准曲线对照,而确定蛋白质含量。 1 材料与试剂,仪器: 1.1 原材料:市场销售的鸡蛋 1.2 试剂 2.95%乙醇、乙醚,

福林酚法测定葡萄酒总酚的优化研究

福林酚法测定葡萄酒总酚的优化研究 总酚是对葡萄酒品质、营养保健功能进行评判的重要物质,葡萄酒中总酚含量的检测十分必要。本文主要进行了葡萄酒中总酚测定方法的优化研究,在分析得出总酚的最优测定方法——福林酚法后,利用中心组合实验设计(Central Composite Design简称CCD),对两种新型福林酚法进行了从单因素到响应面的优化设计,得到最好的测定条件,然后测定了影响因子对微波快速福林酚法测定总酚的影响,最后对传统福林酚法、简化微量福林酚法、微波快速福林酚法进行了比较研究:1、在单因素试验的基础上,利用CCD试验设计,对简化微量福林酚法测定葡萄酒总酚的条件(福林酚试剂浓度、碳酸钠的质量浓度、显色温度、显色时间)进行了优化,试验得到简化微量福林酚法测定总酚的最优条件组合为:福林酚试剂浓度1.4mol/L,碳酸钠的质量浓度30g/L,,显色温度45℃,显色时间 112min,使总酚测定更加简单、微量。 2、使用变频微波炉,在单因素选定范围基础上,利用CCD试验设计,对微波快速福林酚法测定葡萄酒总酚条件(福林酚试剂浓度、碳酸钠的质量浓度、微波频率、处理时间)进行了优化,试验得到了最佳的测定条件组合:福林酚试剂浓度1.2mol/L,碳酸钠的质量浓度40.00g/L,微波频率60%(总功率900W),显色时间6min,微量、快速测定总酚。对葡萄酒中影响福林酚法测定总酚的影响因子(葡萄糖、蔗糖、果糖、SO2、牛血清蛋白、Fe2+、脯氨酸、VB、异抗坏血酸)配制梯度浓度试剂,模拟葡萄酒样,用微波快速福林酚法进行测定,结果显示各因子对总酚测定均有一定影响,但程度不同,随着影响因子浓度的增大,对总酚测定的影响也增大,影响程度最大的为蛋白质、二价铁离子、维生素B6、异抗坏血酸。 在今后用此方法对总酚进行测定时应考虑到影响因子,在总酚计算结果中减

福林酚法检测多肽含量资料

估计你的福林酚浓度存在问题,导致显色反应不充分。建议在检测前标定你的福林酚。 方法:取福林酚(相当于一元酸)1.0ml,精密移取,加水100ml,加酚酞指示剂数滴,用0.1mol/LNaOH滴定,按滴定体积对福林酚浓度进行换算。 药典方法配制的浓度为2.0mol/L。 https://www.sodocs.net/doc/a518286732.html,/read.php?tid=27269 冻干制剂以甘露醇做骨架测多肽含量,制剂用同浓度甘露醇液做空白测吸光度后,按原方法标准曲线计算即可。https://www.sodocs.net/doc/a518286732.html,/read.php?tid=94272 https://www.sodocs.net/doc/a518286732.html,/read.php?tid=93164 Folin—酚试剂法(Lowry法) 一)实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是:?在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。 Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%),硫酸纳(1%),硝酸纳(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。 进行测定时,加F olin—酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定,但上述还原反应只在pH=10的情况下发生,故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应即能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。 (二)试剂与器材 1.试剂 (1)试剂甲: (A)10克Na2CO3,2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)。溶解于500毫升蒸馏水中。 (B)0.5克硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸馏水中,每次使用前,将50份(A)与1份(B)混合,即为试剂甲。 (2)试剂乙: 在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠(Na2WO4·2H2O),25克钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)

福林酚法

Folin酚法测定蛋白酶活力 (2009-06-16 18:03:47) 转载 标签: 生物 蛋白酶活力测定 folin酚法 原理 杂谈 分类:专业学习 一、原理 采用福林-酚试剂法。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物),由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等),可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物,在一定pH值和温度条件下,同酶液反应,经一段时间后终止酶促反应,经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液,用Na2CO3碱化,再加入福林-酚试剂显色,蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定,从而计算出蛋白酶的活力。 二、试剂 1) 福林-酚试剂 向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na 2WO 2 ?2H 2 O)、25g钼酸钠及700mL 的去离子水,再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL,充分混合后,接上回流冷凝管,以小火回流10h,结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴液溴,再继续沸腾15min,以驱除过量的溴,冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色,需再重复滴加溴水的步骤),加去离子水定容至1000mL,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中,贮于冰箱中可长期保存备用。此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。 2) 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液 精确称取TCA65.4g,加去离子水定容至1000mL。 3) 0.4mo1/L碳酸钠溶液 精确称取无水碳酸钠42.4g,加去离于水溶解后,定容至1000mL。

蛋白质含量的测定(Folin—酚法)

实验报告 实验名称:蛋白质含量的测定(Folin-酚法)实验日期: 班级:学生姓名: 研究背景与目的:蛋白质是生物最重要的基本组成成份之一, 蛋白质的定量分析方法的研究在国际上一直十分活跃,Folin-酚法是一种灵敏度极高,可快速测定蛋白质含量的方法,广泛地应用于蛋白质含量的测定。 本实验培养掌握使用Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和操作方法,同时熟练722分光光度计的使用和比色法。 实验原理:Folin-试剂是由两部分组成,甲试剂相当于双缩脲试剂,在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜离子结合生成络合物。试剂乙是磷钨酸和磷钼酸的混合液,在碱性条件下极不稳定,易被蛋白质和试剂甲生成的络合物还原,生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应。 根据此试剂与蛋白质的反应以及一定条件下,兰色深度与蛋白的量成正比,可用比色法,使用分光光度计,通过对呈现蓝色的混合物进行浓度测定,再依据比例计算出蛋白质含量。 仪器与试剂:722分光光度计(上海精密科学仪器有限公司) 架盘天平 具塞刻度试管8支15ml 移液器100ul-1000ul和1ml-5ml 容量瓶50ml*1 小烧杯漏斗研钵 Folin酚试剂:试剂甲试剂乙 250ug/ml牛血清白蛋白标准原液 材料:绿豆芽下胚轴 实验步骤: 1.标准曲线的绘制 取6支15ml具塞刻度试管,编号。如下表所列加入相应试剂。 2.样品测定 (1)称取绿豆芽下胚轴1g于研钵中,匀浆。转入50ml容量瓶中,定容。然后过滤,滤液即为样品液。

(2)取具塞刻度试管2支,编号8、9,分别加入滤液1ml,分别加入试剂甲5ml,混匀后放置10分钟,然后各加入试剂乙0.5ml,迅速混匀,室温下放置半小时, 于650nm波长下比色,记录消光值,取其平均值完成计算。 数据整理与计算: 表1 Folin-酚法测蛋白质含量的标准曲线 图1 从标准曲线中查得样品的OD650平均值对应的蛋白质含量X(ug/ml)=71ug/ml,然后按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。 样品中蛋白质含量(%)=X(ug/ml)*样品总体积(ml)*100 样品重(g)*106 将数据X(ug/ml)=71ug/ml代入公式 样品中蛋白质含量(%)=71*50*100/(1*106)=0.355% 结果分析:经过本实验的数据计算,得到绿豆芽中蛋白质含量为0.355%,而网络上查得的绿豆芽中蛋白质含量为2.2%,与实验测得相差一个数量级,但是与其他实验组的同学讨论得知,所测得的含量都与我组所测的数量级相同。分析可知,豆芽的品种不同,生长所需要的条件和时间也不尽相同,所以与网络查得的数据比较价值很小,而与其他组比较可知我组数据相对准确。 参考文献:https://www.sodocs.net/doc/a518286732.html,/view/e4ec35360b4c2e3f572763f6.html 《蛋白质含量的测定》 https://www.sodocs.net/doc/a518286732.html,/life/class/biochemistry/Experimentation/Ex08.doc 《Folin—酚法测定血清蛋白质含量》 https://www.sodocs.net/doc/a518286732.html,/view/499547a6f524ccbff1218488.html《蛋白质含量测定——福林酚法》 https://www.sodocs.net/doc/a518286732.html,/blog/static/2041113420100209343510/《Folin—酚试剂法(Lowry法)》 思考题:

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