毛果杨漆酶基因LAC-1的克隆与原核表达研究
Botanical Research 植物学研究, 2016, 5(2), 39-46 Published Online March 2016 in Hans. https://www.sodocs.net/doc/bb27352.html,/journal/br https://www.sodocs.net/doc/bb27352.html,/10.12677/br.2016.52007
文章引用: 李丽红, 撖静宜, 王莹, 曹山, 张强, 蒋璐瑶, 要笑云, 李慧, 陆海. 毛果杨漆酶基因LAC-1的克隆与原核表
Cloning and Prokaryotic Expression of LAC-1 Gene from Populus trichocarpa Torr. & Gray
Lihong Li, Jingyi Han, Ying Wang, Shan Cao, Qiang Zhang, Luyao Jiang, Xiaoyun Yao, Hui Li, Hai Lu
College of Biological Science and Technology, Beijing Forestry University, Beijing
Received: Feb. 20th , 2016; accepted: Mar. 8th , 2016; published: Mar. 15th , 2016
Copyright ? 2016 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.sodocs.net/doc/bb27352.html,/licenses/by/4.0/
Abstract
Objective: Cloning, sequence analysis of the LAC-1 gene from Populus trichocarpa Torr. & Gray, then induced expression and purify of the fusion protein in E. coli after construct prokaryotic expres-sion vector to provide a foundation for studying the function of the target protein. Method: Ac-cording to the principle of homologous cloning, laccase gene from Arabidopsis thaliana was used to blast the database JGI of Populus trichocarpa . The laccase gene was isolated by PCR and trans-formed into E. coli by the individual expression construct pET-30a and expression the recombina-tion protein, then purified by Ni-NTA affinity chromatography. Result: Populus trichocarpa laccase gene was isolated (renamed LAC-1, Genebank: XP_002310245). Seqence analysis revealed that LAC-1 had the key residues of laccase, phylogenetic analysis showed LAC-1 had high homologous with AtLAC4. The results of SDS-PAGE demonstrated that the expressed proteins were consistent with the size of expected protein in the prokaryotic expression system. Conclusion: The LAC-1 genes belonged to the family of laccase and successfully expressed in E. coli . This study will supply theoretical foundation in identifying and functional analysis of members from laccase family. Keywords
Populus trichocarpa , LAC, Gene Clone, Sequence Analysis, Prokaryotic Expression
毛果杨漆酶基因LAC-1的克隆与原核表达研究 李丽红，撖静宜，王 莹，曹 山，张 强，蒋璐瑶，要笑云，李 慧，陆 海
北京林业大学生物科学与技术学院，北京
李丽红等
收稿日期：2016年2月20日；录用日期：2016年3月8日；发布日期：2016年3月15日
摘要
目的：克隆毛果杨漆酶基因LAC-1，对其进行生物信息学分析，并构建原核表达载体在大肠杆菌中进行融合蛋白的诱导表达并纯化目的蛋白，为植物漆酶基因蛋白体外结构与功能的研究提供一定的理论基础。
方法：根据同源克隆的原理，利用已经研究公布的拟南芥中的漆酶基因序列对毛果杨基因组数据库进行同源检索，利用PCR技术克隆毛果杨漆酶基因的序列，构建重组表达载体，转化大肠杆菌BL21并表达重组蛋白，通过Ni-NTA亲和层析进行纯化。结果：克隆获得了毛果杨漆酶基因的序列(命名LAC-1，基因登录号XP_002310245)，序列分析表明LAC-1具有漆酶基因的保守结构域，进化树分析表明该序列与拟南芥的漆酶基因AtLAC4有较高的同源性，利用所构建的原核表达载体，经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测结果表明表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论：LAC-1属于毛果杨基因家族的一员，该漆酶基因可以在体外成功进行原核表达，为毛果杨漆酶基因家族成员的鉴定及后续活性功能的分析提供了一定的理论基础。
关键词
毛果杨，LAC，基因克隆，序列分析，原核表达
1. 引言
【研究意义】漆酶(EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色氧化酶家族，漆酶广泛存在于植物和真菌中[1] [2]。目前有关真菌漆酶的研究与应用已有大量报道，但高等植物中有关漆酶的研究却相对较少。长期以来，植物细胞壁丰富的过氧化物酶被认为是催化木质素单体氧化聚合的首要酶。最近的研究表明，漆酶分泌到植物细胞次生壁，在有氧气存在时，可以催化同样的聚合反应。植物中的漆酶基因家族庞大，毛果杨(Populus trichocarpa Torr. & Gray)作为一种有代表性的模式植物，其基因组测序已经完成，因此，研究并确定毛果杨的中的漆酶基因序列对进一步研究并阐明漆酶基因在植物中的作用与功能具有重要的意义。【前人研究进展】近年来，有关漆酶基因克隆与表达的研究主要集中在真菌漆酶方面，而漆酶的异源表达大多数的研究集中于真核生物毕赤酵母的研究中，Yang J等[3]克隆了白腐真菌中的一个漆酶基因并在毕赤酵母GS115中成功实现异源表达；顾春娟等[4]在毛头鬼伞漆酶的研究中，在欲表达的漆酶氨基酸序列的N端加入10个氨基酸标签后在毕赤酵母KM71中成功表达并测得活性。真菌漆酶原核表达方面的研究相对较少，Salony等[5]首次在大肠杆菌中成功表达了真菌黑蛋巢菌布里尼的漆酶蛋白，随后S?ren Brander等[6]将克劳氏芽孢杆菌的漆酶基因在大肠杆菌BL21中成功进行了表达。【本研究切入点】目前，有关漆酶原核表达的研究只在真菌漆酶中有过研究，而植物漆酶基因的原核表达的研究确鲜见报道。【拟解决的关键问题】以模式植物毛果杨为材料，克隆其漆酶基因，构建原核表达载体，研究植物漆酶基因能否在体外成功进行原核表达，为植物漆酶基因家族成员的鉴定及后续结构功能的研究提供一定的理论基础。
2. 材料与方法
2.2. 实验材料与主要试剂
实验材料毛果杨(Populus trichocarpa Torr. & Gray)无性系取自北京林业大学生物化学与分子生物学
李丽红等
研究室。大肠杆菌(Escherichia coli)JM109及BL21(DE3)由本实验室保存。表达载体pET-30a(+)由本实验室保存。克隆载体PMD-18T，Ex Taq酶购自TaKaRa公司。植物总RNA提取试剂盒，反转录试剂盒，琼脂糖凝胶回收试剂盒与普通质粒小提试剂盒购自北京天根生物公司。T4-DNA连接酶，限制性内切酶Kpn I和Bam H I购自promega公司。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自Sigma公司。
2.2 实验方法
2.2.1. 毛果杨漆酶基因LAC-1的电子克隆与序列分析
根据同源克隆的原理，利用已经研究确定的拟南芥中的漆酶基因AtLAC4序列对毛果杨基因组数据库进行同源检索，找到与AtLAC4同源性较高的毛果杨中的疑似漆酶的基因序列，利用DNAMAN等软件分析LAC-1(基因登录号XP_002310245)的序列，获得分析结果。
2.2.2. 毛果杨漆酶基因LAC-1的进化分析
通过在NCBI网站上进行BLAST比对分析，得到大量毛果杨漆酶基因LAC-1具有相近进化关系的基因序列，这些基因大量存在于不同植物中，如欧亚槭(Acer pseudoplatanus)、白桦树(Betula platyphylla)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、棉花(Gossypium hirsutum)、野生大豆(Glycine soja)、欧洲云杉(Picea abies)、海岸松(Pinus pinaster)、可可树(Theobroma cacao)等。BLAST结果显示，这些相关的基因全部来自漆酶基因家族。然后将这些漆酶基因与LAC-1进行了进化分析，并利用MEGA6.0软件绘制了进化树。
2.2.
3. 毛果杨漆酶基因LAC-1的克隆及LAC-1-pET30a(+)表达载体的构建
以生长健壮的毛果杨的组培苗的叶片为材料，根据北京天根生物公司的总RNA提取试剂盒的操作流程，提取毛果杨的总RNA。用1%的琼脂糖凝胶对提取的总RNA进行电泳检测。根据北京天根公司反转录试剂盒的操作步骤，以Oligo(dT)18为引物进行反转录得到毛果杨的cDNA序列。设计加入酶切位点的上游引物5’-GGGGTACCATTCTAGGATTCATTCCTTTTC-3’(划线部分为Kpn I的酶切位点)，加入酶切位点的下游引物为5’-CGGGATCCGCAAGGTGGAAGATCCTTAGGA-3’(划线部分为Bam H I的酶切位点)。以cDNA为模板进行PCR扩增目的基因，25 μL的PCR体系包含：2 μL毛果杨cDNA(约100 ng)、上下游引物各1 μL (10 pm/μL)、2.5 μL (2.5 mmol/L)dNTP、2.5 μL 10 × Ex Taq buffer、0.5 μL Ex Taq酶(2.5 U/μL)、14.5 μL ddH2O。PCR条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共进行30个循环，最后72℃延伸10 min后保存于4℃。
PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带，将回收的产物与pMD-18T载体连接后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，将转化产物涂布于含氨苄(100 mg/L)的LB 培养基上后于37℃的培养箱中过夜培养。挑取单菌落扩大培养后，提取质粒进行PCR初步鉴定，将阳性个体送到北京六合华大基因公司进行测序鉴定。
对测序正确的阳性个体进行扩摇后，提取质粒，与质粒pET-30a(+)同时进行限制性内切酶(Kpn I和Bam H I)的双酶切，酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，回收酶切目的条带用T4-DNA连接酶进行连接。连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)后涂布于含卡那霉素(100 mg/L)的LB固体培养基上过夜培养，待长出单菌落后挑取单菌落于含卡那霉素(100 mg/L)的液体LB培养基中扩大培养，提取菌液的质粒后进行双酶切(Kpn I和Bam H I)鉴定，获得LAC-1-pET30a(+)的重组原核表达载体。
2.2.4. 毛果杨LAC-1的原核表达及纯化
将含表达载体LAC-1-pET30a(+)的大肠杆菌BL21(DE3)在含卡那霉素(100 mg/L)的LB固体培养基上划线后于37℃过夜培养到单菌落长出，挑取单菌落于20 mL的含卡那霉素(100 mg/L)的液体LB培养基中过夜培养，取5 mL过夜培养的菌液按1:100的比例扩大培养到500 mL的含卡那霉素(100 mg/L)的液体
李丽红等
LB培养基中培养3 h左右到OD600为0.6左右，加入抽滤灭菌的IPTG(终浓度为0.3 mmol/L)溶液，于28℃、140 rpm的摇床中诱导培养3 h。获得的菌液在4000 rpm的条件下富集菌体，以未加IPTG诱导的转化菌株为空白对照，以12%的SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的诱导表达结果。根据QIAGEN公司的蛋白纯化手册的步骤对目的蛋白进行纯化，以12%的SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的纯化结果。
3. 结果与分析
3.1. 毛果杨漆酶基因LAC-1及其蛋白序列的分析
利用拟南芥漆酶基因AtLAC4对毛果杨基因组数据库同源检索，我们得到同源性较高的毛果杨的的基因LAC-1，对其进行序列分析可知，其基因全长为2198 bp，其中含有6个外显子和5个内含子，其CDS序列全长为1635 bp，编码545个氨基酸，该序列没有信号肽大小约为60 KD。通过其与拟南芥中漆酶基因的氨基酸比对分析可知(图1)，该序列中具有漆酶基因的三个铜离子的保守结合域，其中铜离子结合保守域I中的保守氨基酸为四个H(组氨酸)残基，铜离子结合保守域II中的保守氨基酸为N(天冬氨酸)、L(亮氨酸)、V(缬氨酸)、K(赖氨酸)、P(脯氨酸)、Q(谷氨酰胺)、T(苏氨酸)，以及铜离子结合保守域III的四个保守氨基酸H(组氨酸)、C(半胱氨酸)、H(组氨酸)、L(亮氨酸)。
3.2. 毛果杨漆酶基因LAC-1的进化树分析
从进化树中可以清晰的看到(图2)，同一物种的不同漆酶在进化关系上都有比较大的差异，这充分说明漆酶基因家族中不同的漆酶的功能可能存在比较大的差异。毛果杨的漆酶基因LAC-1与野生大豆(G.
soja)的laccase-4以及拟南芥的漆酶基因laccase-4具有比较相近的进化关系，最近的研究已经表明拟南芥的漆酶基因laccase-4在拟南芥的木质素合成过程中起到重要的作用，由此我们可以初步推测毛果杨漆酶基因LAC-1可能在毛果杨木质素合成过程发挥重要作用。
3.3. 毛果杨漆酶基因LAC-1的克隆及表达载体的构建
利用毛果杨组培苗的叶片为实验材料进行毛果杨总RNA的提取，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取RNA的质量(如图3(a))，利用反转录后得到的cDNA为模板，通过PCR扩增得到大小约为1.7 Kb的片段(如图3(b))，与杨树基因组数据库中公布的漆酶的基因序列大小基本一致，将该片段回收后与pMD-18T 载体连接转化大肠杆菌JM109，提取质粒进行初步的PCR鉴定，将得到的阳性送去测序，将测序结果与杨树基因组数据库中的序列进行比对，得到正确的LAC-1基因序列。将测序正确的毛果杨LAC-1与pET-30a(+)同时进行双酶切(Kpn I和Bam H I)后连接，获得重组质粒LAC-1-pET30a(+)，然后进行双酶切鉴定(如图3(c))。
3.4. 重组蛋白的诱导表达及纯化
将获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导表达，以未加IPTG诱导的转化菌株为对照，进行12%的SDS-PAGE电泳，从电泳结果可得(图4(a))，在60 KD左右的位置经IPTG诱导后有一条明显的蛋白条带表达，由此可以说明毛果杨漆酶基因LAC-1在大肠杆菌BL21(DE3)中可以实现成功表达，但该表达蛋白以无活性的包涵体形式存在于菌体沉淀中。由于表达载体pET-30a(+)中带有六个组氨酸的标签，因此按照QIAGEN公司的蛋白纯化手册中的包涵体蛋白的纯化通过Ni-NTA亲和层析对包涵体蛋白进行纯化，得到了纯化后的重组蛋白(图4(b))。
4. 讨论
漆酶(EC1.10.3.2)是多铜氧化酶中的一种含铜的糖蛋白氧化酶，按照来源大致可以分为植物漆酶、微
李丽红等
Figure 1. The amino acid sequence alignments of Populus trichocarpa LAC-1 and Arabidopsis thaliana laccases
图1. 毛果杨漆酶LAC-1与拟南芥漆酶的氨基酸序列比对
生物(包括真菌和细菌)漆酶和动物漆酶[7]。日本人吉田于1883年首次在漆树(Toxicodendron vernicif-luum(Stokes)F.A.Barkley)漆液里发现漆酶，随后研究发现某些高等真菌也能分泌这种酶，并且高等真菌分泌的漆酶能够催化降解多种芳香族化合物特别是酚类。与真菌所分泌的漆酶作用恰恰相反，漆酶在植物中主要起到合成木质素的作用。Sterjiades等[8]和Bao等[9]分别从欧亚槭(A. pseudoplatanus)和火炬松(Pinus taeda L.)中分离得到漆酶，并证明其可以在体外催化木质素单体的氧化聚合。Berthet S等[10]通过对拟南芥突变体的研究确定了LAC4和LAC17在拟南芥木质素合成中起重要作用。而木质素是植物细胞
李丽红等
Figure 2. Phylogenetic relationship of LAC-1 protein in Populus trichocarpa
and other plants
图2. 毛果杨漆酶LAC-1蛋白与其它植物蛋白的系统发生分析
(a) (b) (c)
Figure 3. The results of LAC-1 gene cloning and double digestion of recom-
bined vector ((a) electrophoresis of Populus trichocarpa totle RNA, (b) elec-
trophoresis of LAC-1 cloning, (c) double digestion of recombined vector)
图3. 毛果杨漆酶基因LAC-1的克隆及重组载体双酶切鉴定结果((a) 毛果
杨总RNA电泳图，(b) 漆酶基因LAC-1克隆电泳图，(c) 重组载体双酶
切鉴定结果)
(a) (b)
Figure 4. Analysis of induced expression and purified products by SDS-PAGE
图4. 诱导表达及纯化产物的SDS-PAGE分析
李丽红等
壁氧化聚合木质素单体而形成的高聚物。木质素结构稳定，很难在短时间内被降解。在造纸工业中，木质素是严重影响纸浆质量和造成环境污染的重要因素[11]。在畜牧业中，饲草的木质素影响牲畜的消化与营养吸收，木质素含量的高低是饲草优劣的指标之一[12]。降低木质素含量或改变其组分，将有利于更好地利用资源植物。
自漆酶基因被发现以来，有关其研究一直经久不衰，但漆酶的研究主要集中在高等真菌方面，而关于植物漆酶的研究相对较少。有关植物漆酶的体外表达研究更是鲜见报导。要了解漆酶基因在植物体内的生化功能，必须要从蛋白水平上进行研究。原核表达系统是最常用的表达系统，以大肠杆菌为代表的原核表达系统是外源基因表达的首选[13]，因此原核表达为研究植物漆酶蛋白的表达与功能提供了一条有效的途径。本研究中将克隆得到的毛果杨漆酶基因LAC-1与原核表达载体pET-30a(+)重组后转入大肠杆BL21(DE3)中经IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE电泳检测表明，漆酶基因与组氨酸标签形成融合蛋白后，在原核表达系统中可以进行成功表达，但表达的融合蛋白主要以无活性的包涵体形式存在，这说明毛果杨漆酶基因虽然能在大肠杆菌中实现表达，但由于原核生物表达条件的限制导致表达蛋白并不能正确实现折叠而导致了包涵体蛋白的形成。利用表达融合蛋白上的组氨酸标签，通过Ni-NTA亲和层析对包涵体蛋白进行纯化并获得纯化目的蛋白，而进一步研究该包涵体蛋白的复性以及体外活性与结构功能是本文后续的研究方向，毛果杨漆酶基因LAC-1在体内参与怎样的代谢活动，其是否与毛果杨中木质素合成过程相关都会在以后的深入研究中逐渐揭晓。
5. 结论
毛果杨漆酶基因在合适的条件下可以在原核表达系统中实现成功表达，为植物漆酶基因体外结构与功能的研究提供了基本资料。
基金项目
国家自然科学基金项目(31570582, 30671697, J1103516)。
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木聚糖酶的基因克隆及表达
木聚糖酶的基因克隆及表达 木聚糖酶（xylanase）主要包括β-1，4-木聚糖酶、β-1，4-木聚糖内切酶等，是指能够将木聚糖降解为低聚木糖或单糖的一组酶的总称。木聚糖是植物半纤维素的主要成分，约占植物总糖的1／3，是自然界中除纤维素外含量最丰富的再生生物资源［1］。木聚糖酶在饲料、造纸、食品、医药、能源等领域应用较广。木聚糖酶广泛存于微生物中，目前已从不同来源的微生物中分离得到上百种木聚糖酶。在自然界中，绝大多数野生型木聚糖酶的最适温度为40～60℃，酶活性不高，热稳定性较差［2］。因此，研究者把研究重点放在了利用分子生物学手段对原始菌株的木聚糖酶基因进行克隆上，并对其进行表达，以期获得使用更加方便、特性更加优异的工程菌株。本文对聚糖酶特性等进行了回顾，对其基因克隆和表达作一综述，并对分子生物学技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。1木聚糖酶的研究现状国外对木聚糖酶的研究开始较早，生产技术及应用已趋于成熟。研究者对细菌、真菌和放线菌木聚糖酶的研究更加深入和广泛，早在1992年就已经实现了木聚糖酶的工业化生产。国内对木聚糖酶的研究起步较晚，但发展迅速。20世纪80年代初期，中国科学院微生物所张树政院士首先从海枣曲霉（Aspergillusphoenicis）中纯化得到了木聚糖酶Ⅰ~Ⅳ，并深入研究了活力较高的组分酶Ⅲ的酶学性质。目前，由于从这些野生型菌株中获得的木聚糖酶活性并不高，并且受到酶稳定性和底物特异性等方面的限制［2］，使研究者们将对木聚糖酶的研究重点放在了木聚糖酶基因克隆、表达和重组上，并在分子水平上对木聚糖酶进行改造。木聚糖酶基因克隆和表达的研究进展王丹丹1，2 综述，周晨妍1，付冠华1审校1.新乡医学院生命科学技术学院河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地，河南新乡453003；2.新乡医学院三全学院，河南新乡453003 摘要：半纤维素分解微生物在自然界的物质循环过程中起着重要作用，半纤维素是植物多糖的重要成分之一，而木聚糖则是半纤维素的主要成分。木聚糖酶（xylanase）可催化木聚糖的水解，在各种生物体内均发现木聚糖酶。在过去几十年中，已有上百种木聚糖酶基因被克隆至同源或异源宿主内来表达木聚糖酶，以期改变宿主特性并适于商业应用。本文综述了木聚糖酶基因的克隆和表达，并对基因工程技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。关键词：木聚糖酶；克隆；基因表达2木聚糖酶基因的克隆木聚糖水解酶系是一种复杂的复合酶系统，广泛分布于自然界的真菌和细菌中。已经报道的有细菌、真菌、酵母和放线菌等。在国内外研究最多的还是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。到目前为止，已经有上百种来自细菌和真菌等微生物中的木聚糖酶基因被克隆，并在不同的表达系统中成功表达。从近几年克隆和表达出的木聚糖酶基因主要来自细菌、真菌、酵母和放线菌等，而研究最多的是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。从这些野生菌种克隆出的木聚糖酶基因在不同宿主菌中已成功实现了异源表达。 木聚糖酶基因的表达3.1木聚糖酶基因在原核细胞内的表达木聚糖酶基因在原核细胞内的表达以大肠埃希菌的研究为热点。大肠埃希菌繁殖速度较快，是相对较理想的宿主细胞。将克隆得到的目的基因和原核载体经双酶切，胶回收产物与重组质粒经连接酶连接，转化合适的大肠埃希菌，选择培养基筛选阳性克隆子，并进行诱导表达。多数情况下，大肠埃希菌不但表达出目的蛋白，并且酶活力也有较大提高。见表2。 3.2木聚糖酶基因在真核细胞中的表达大肠埃希菌虽然繁殖速度较快，但由于其为原核生物，细胞外有一层厚厚的细胞壁，必须先破碎细胞壁，才能将目的蛋白释放出来，而真核细胞克服了原核细胞的这个缺点，可将表达的目的蛋白分泌到细胞外,便于分离纯化。能够表达木聚糖酶的真核细胞以酿酒酵母和毕赤酵母为代表，如水稻等真核细胞同样能够表达木聚糖酶，并且酶活也有一定程度的提高
小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性
植物学通报 2005, 22 (3): 313￣319①国家重点基础研究发展规划项目(G1998010100)资助。 ②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zouqi@https://www.sodocs.net/doc/bb27352.html, 收稿日期: 2004-02-17 接受日期: 2004-09-20 责任编辑: 孙冬花 小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性① 张 国 李 滨 邹 琦② (山东农业大学生命科学学院植物系 泰安 271018) 摘要 Rubisco 活化酶是广泛存在于光合生物中调节Rubisco 活性的酶, 我们利用PCR 技术, 从小麦(Triticum aestivum )叶片cDNA 文库中克隆得到Rubisco 活化酶基因cDNA 片段, 该片段长度为850 bp, 编码201个氨基酸。Northern blot 表明, 小麦叶片在暗诱导衰老的条件下, 叶片中活化酶基因表达水平逐渐下降; 同时, 小麦叶片的光合特性、叶绿素含量和Rubisco 活性呈现下降趋势。这些结果表明, 衰老时小麦叶片Rubisco 活化酶基因表达水平下降与光合速率下降密切相关。关键词 Rubisco 活化酶, 小麦, 衰老 Cloning and Expression of Rubisco Activase Gene in Wheat ZHANG Guo LI Bin ZOU Qi ② (Department of Botany, College of Life Science, Shandong Agricultural University , Tai’an 271018) Abstract Rubisco activase is an ubiquitous enzyme for the activation of Rubisco in photosynthetic autotrophs. A cDNA fragment of Rubisco activase gene was cloned from wheat (Triticum aestivum ). Northern blot showed that expression of the gene was down-regu-lated in dark-induced senescence leaves, where photosynthetic rate, chlorophyll content and Rubisco activity also showed obvious decline. The results suggest that the decreased expres-sion level of the gene was related to the decline in photosynthetic rate.Key words Rubisco activase, Wheat, Senescence Rubisco 是光合生物进行光合碳同化关键的双功能酶, 它催化RuBP 的羧化-加氧反应,但效率很低。因为加氧反应除了消耗能量,还损失了羧化反应中固定的25%的有机碳; 同时, 各种磷酸糖类能抑制Rubisco 的活性, 如:底物RuBP 本身就是Rubisco 的强烈抑制剂, 且活化态Rubisco 易于脱氨甲酰化而失活, 这些因素使Rubisco 成为光合速率的限制因子, 因 而也成为提高作物光合效率的研究目标。 Salvucci 等(1985)发现了Rubisco 活化酶(Rubisco activase, RCA), 它能够活化Rubisco,同时具有ATPase 活性; 也有人认为RCA 是一种分子伴侣(Spreitzer and Salvucci, 2002)。植物中Rubisco 的活化状态实际是Rubisco 的失活速率和RCA 活化Rubisco 速率间的平衡状态(Crafts-Brandner and Salvucci, 2000)。人
红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
基因的克隆、表达载体构建与功能验证
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，
移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
一个快速响应干旱的F-box基因的克隆和表达分析
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.sodocs.net/doc/bb27352.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.sodocs.net/doc/bb27352.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.sodocs.net/doc/bb27352.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.sodocs.net/doc/bb27352.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.sodocs.net/doc/bb27352.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发
基因克隆和表达
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.sodocs.net/doc/bb27352.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006
gfp基因的克隆与表达
基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L
目的基因的克隆表达
目的基因的克隆表达 一．PCR 1.原理 DNA在高温时发生解链，温度降低时又可复性成双链。根据DNA的半保留复制原则，通过控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP完成特定基因的体外复制。2. 反应体系 LA Taq DNA聚合酶0.25*6=1.5ul 10* buffer 2.5*6=15 ul dNTP 4*6=24 ul P1 1*6=6 ul P2 1*6=6 ul 模板1*5=5 ul 水15.25*6=92 ul 3. 注意事项：先加多的再加少的；模板最后加；设置阴性对照， 不加模板，加入等量的水 4.反应过程 （1）预变性：94℃,1min (2)变性：90℃,30s (3)退火：45-60℃，45 s （4）延伸:72℃,2min (5)2,3,4,5步循环
（6）72℃,10min （7）16℃，保温 二．琼脂糖凝胶电泳 1.原理：若将一种分子置于电场中，它会以一定的速度向适当的电极移动。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。由于琼脂糖凝胶是一种无反应活性的稳定的支持介质，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小，极性及介质粘度的函数。因此，根据分子大小的不同，构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在凝胶电泳中，加入适量的溴乙啶或Glodview染料，它能对核酸分子进行染色，而不与琼脂糖凝胶相结合，然后将电泳标本放在紫外线下观察，可清晰地检测到发出绿色荧光的DNA谱带位置。 2.具体操作 1.制胶 （1）称量0.25g琼脂糖和25ml缓冲液TBE，混合均匀 （缓冲液TBE的作用：用于稳定体系酸碱度，使溶液两极的PH保持基本不变；是溶液具有一定的导电性，利于DNA的迁移） （2）在微波炉中打化，每20s摇一下 （3）按每10ml培养基加0.5 ul的比例加入Glodview核酸染料，使DNA带上绿色荧光标记
目的基因的克隆与及表达
分子生物学大实验—目的基因的克隆与及 表达 第一节基因操作概述 (2) 一、聚合酶链式反应(PCR) (2) 二、质粒概述 (4) 三、凝胶电泳 (5) 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6) 五、重组质粒的连接 (7) 六、限制性内切酶消化 (7) 七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7) 第二节材料、设备及试剂 (7) 一、材料 (8) 二、设备 (8) 三、试剂： (9) 第三节操作步骤 (10) 一、目的基因的获得： (10) 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11) 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12) 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定
(13) 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE 电泳。 (14) 六、融合蛋白的毒力测定 (16) 第四节本实验的实验报告 (16)
第一节基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA 扩增达106倍。 （一）、PCR反应中的主要成份 1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中