DNA的酶切与连接(一)

实验七DNA的酶切与连接（一）

一、实验目的

1.掌握限制性内切酶的特性和酶切的目的和原理

2.掌握限制性内切酶酶解体系的建立及酶切样品的检测

2.掌握PCR试剂盒回收PCR酶切样品的方法

二、实验原理

1.通过DNA重组技术构建DNA重组子

利用限制性核酸内切酶切割DNA和利用DNA连接酶连接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主细胞进行表达提供了有效的实验材料。

2.酶切

限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为I型、II型和III型三类。DNA重组技术中最常用的是II型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。

II型酶的主要特点是识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。在分子克隆实验中使用最普遍的是那些识别4个或6个碱基对的限制性内切酶。II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：粘性末端和平头末端。

限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，一个酶单位（1Unit）指的是在指定缓冲液中，37度下反应60min，完全酶切1ug的纯DNA所用的酶量。

三、材料、试剂及器具

1.材料与试剂

酶切反应：质粒pGEX-4T-2

EcoRI

Xhol

酶切缓冲液

DNA回收：PCR回收试剂盒

检测：1X TAE电泳缓冲液

Gel Red

琼脂糖

2.仪器

电泳仪，离心机，移液枪，Hema凝胶成像仪

三、实验步骤

1.质粒DNA酶切

①在PCR管中，按照下表加入试剂（单位：ul）

EcoRI1

保温2h进行酶切反应。

③反应结束后，65度保温20min使酶失活。

2.酶切产物的回收

a)将PCR反应产物或其它酶促反应物移入1.5ml离心管中。

b)将PCR反应产物体积的2倍加入DNA binding buffer。（每次加入的DNA

binding buffer最大体积不宜超过200ul）

c)将混合液全部转移到Spin column中。

d)于6000g离心1分钟，并弃去接液管内液体。

e)向Spin colomn内加650ul wash buffer，于12000g离心30~60秒，并弃去接

液管内液体。

f)重复第5步一次。

g)再次于12000g离心1分钟，然后将spin column转移到无菌的1.5ml离心管

中。（如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残夜被彻底清除）。

h)向spin column内加25ul Elution buffer，并于室温静置1分钟。

i)于12000g离心1分钟，1.5ml离心管内溶液中含有目的的DNA片段。

j)提取的DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如不立即使用，请保存于-20度。

3.质粒及质粒酶切样品的电泳检测

a)琼脂糖凝胶的制备：制备1%琼脂糖凝胶（0.3g/30ml）

b)加样：质粒酶切样品4ul+6x的loading buffer1ul

c)恒压电泳：115v电泳大约40分钟。

d)观察：凝胶成像仪器观察电泳结果。

四、思考题

1.影响限制性内切酶活性的因素有哪些？

2.如果一种DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切断，你认为是什么原因？