中医药与间充质干细胞的多向分化

间充质干细胞

间充质干细胞及来源 间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。间充质干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。 间充质干细胞具有向多种类型细胞分化的能力，可以分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种细胞。这种多向分化的能力给人类多种疾病的治疗提供了重要的原材料。 间充质干细胞来源：间充质干细胞广泛分布于胎儿和成体的骨髓、骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中，其中脐带来源的间充质干细胞质量高、纯净、数量多。 间充质干细胞生物学特性 间充质干细胞具有以下特性： 1）具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。 2）具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。 3）具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。 正是由于间充质干细胞所具备的这些免疫学特性，使其在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。

间充质干细胞的临床应用 1.间充质干细胞在细胞替代治疗中的前景 以组织工程学为手段可望解决的问题几乎涉及人类面临的大多数医学难属，如烧伤、放射损伤等患者的植皮；肌肉、骨及软骨缺损的修补；髋、膝等关节的替换；血管疾病或损伤后的血管替代；糖尿病患者的胰岛植入；心脏病患者的瓣膜替代、房室间隔缺损的修补；癌症患者手术切除后组织或器官的替代；放射损伤及大剂量放疗、化疗后的造血与免疫重建；肝、肾等重要脏器因损伤或功能衰竭的置换；部分遗传缺陷性疾病的治疗等。在不久的将来，某些组织工程产品，如人造皮肤、血管、骨、软骨、肌肉、瓣膜、神经甚至胰岛、肾、肝等组织器官或细胞将相继问世，然后植入患者体内，用以恢复损伤、替代退行性组织器官以及改变遗传缺陷性组织器官的功能。人类也将进入实际应用现代组织工程产品的新时代。 目前，在组织干细胞定向分化领域取得了明显的进展。在体外可以定向诱导一些多能干细胞分化为骨、软骨、肌肉、脂肪、肌腱、神经等多种组织细胞，这些成果很令人鼓舞。造血干细胞的移植已得到广泛开展，通过输注造血干细胞来对恶性血液病患者进行造血重建已取得成功，这为组织干细胞的研究提供了成功的范例。 MSC因其具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，以及取材方便、体内植入后不良反应较弱等优点而备受关注，将成为细胞替代治疗的理想种子细胞。 MSC与生物材料相结合，能够修复骨、软骨、肌腱等各种组织的缺损，这是组织工程中的新领域。 MSC在治疗组织09官退行性疾病方面也展示了前景。随着年龄的增长，机体的组织器官会出现退行性的改变，从而引发一些相关疾病，如肌肉萎缩、肌营养不良、脑萎缩、帕金森病、阿尔茨海默综合征等。而这些组织的再生比较固难，MSC在体内外能够分化为肌肉细胞和神经细胞，为治疗这些退行性疾病带来了希望。 遗传缺陷性疾病发病率也很高，而且治疗难度极大。利用体外分离的MSC或其诱导分化后的细胞来改善遗传缺陷组织的功能，这一治疗途径正在被尝试。 2. 间充质干细胞在基因治疗中的前景 一些干细胞不仅具有多向分化潜能，而且易于外源基因的转染和表达。将体外经过基因修饰的干细胞用于治疗，可以避免转染载体进入受体产生的不良影响。基因修饰的干细胞可以在多个靶位发挥作用。 (1)干细胞潜能的改变——干细胞靶位基因转染以后可以改变干细胞的某些特性。从成人或成年动物分离的干细胞有时会表现出年龄相关性、遗传性或获得性疾病相关性再生能力损伤，基因转录或酶切修饰可以有效地维持、加强或抑制干细胞的分化和增殖能力。 (2)器官系统性能的改善——干细胞子代靶位转入干细胞的基因可以随着干细胞的分化传代而遗传给子代细胞，在基因转导的干细胞重建的器官系统中持续表达，改善重建

间充质干细胞培养方法

间充质干细胞培养方法 1、间充质干细胞MSＣ基本形态 2、干细胞应用与干细胞调控。 3、间充质干细胞MSC生长过程 ４、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境 5、细胞培养板得选择 7、如何维持培养液p Ｈ ６、如何选用细胞培养基? 8、血清与干细胞得培养?9、胎牛血清（F B S )就是否需要灭活?1０、细胞得细菌、真菌污染及排除?１1、细胞培养污染得预防 １2、使用胰蛋白酶时加入 E DTA得目得就是什么 13、胶原酶得种类与选型?1４、胶原酶V S胰酶?1５、干细胞得种类与表面标记 １6、间质干细胞培养原理概述? 17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化?1８、干细胞老化得表现 20、冷冻保护剂作用与选择? 21、细胞冻存指导 19、细胞传代消化过程指导? 与处理? 22、干细胞冷冻与复苏 23、移植细胞得基因修饰?1。间充质干细胞MSＣ基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长.?间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同得突起。可瞧到细胞成螺旋状生长。 ?2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发?２、１内源性调控 展.? 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 （1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?（2）转录因子得调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct ４就是必需得.Ｏcｔ4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FＧＦ—４等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oct４缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LＩF)对培养得小鼠ES 细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得。又如Tｃf/Lｅｆ转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.T ｃｆ/Leｆ就是Wnt 信号通路得中间介质，当与β－Catｅnｉn 形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.? 2、2外源性调控 除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(1）分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖，分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGFβ家族与Wnｔ信号通路.比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多

人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化

中国组织工程研究与临床康复 第14卷 第14期 2010–04–02出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 2, 2010 Vol.14, No.14 P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.sodocs.net/doc/b115414862.html, 2492 1 Biomedicine Research and Development Centre of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 2 Guangzhou (Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 3 Asia-Pacific Stem Cell Research Centre Co., Ltd., Hong Kong 999077, China; 4 Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 5 Department of Bioengineering, Clemson University, Clemson, SC 29634-0905, USA He Shao-qing ★, Studying for master’s degree, Biomedicine Research and Development Centre of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; Guangzhou (Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China heshq106@https://www.sodocs.net/doc/b115414862.html, 人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化**★△○ 何绍清1， 2，罗振宇1， 2，刘秋英1， 2，周向荣△2， 3，邓铭权△2， 3，罗 新4，姚润斯4，高 志5，王一飞○1， 2 Isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and differentiation into adipocytes and osteblasts He Shao-qing 1, 2, Luo Zhen-yu 1, 2, Liu Qiu-ying 1, 2, Zhou Xiang-rong 2, 3, Deng Ming-quan 2, 3, Luo Xin 4, Yao Run-si 4, Gao Zhi 5, Wang Yi-fei 1, 2 Abstract He SQ, Luo ZY, Liu QY, Zhou XR, Deng MQ, Luo X, Yao RS, Gao Z, Wang YF. Isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and differentiation into adipocytes and osteblasts. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(14): 2492-2496. [https://www.sodocs.net/doc/b115414862.html, https://www.sodocs.net/doc/b115414862.html,] 摘要 何绍清，罗振宇，刘秋英，周向荣，邓铭权，罗新，姚润斯，高志，王一飞.人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(14):2492-2496. [https://www.sodocs.net/doc/b115414862.html, https://www.sodocs.net/doc/b115414862.html,] 0 引言 间充质干细胞具有自我更新能力，能分化成为成骨、软骨、肌肉和脂肪细胞等间质组织细胞[1-3]，甚至能分化为心肌、神经胶质和神经细胞[4-6]。近年来因其在组织工程和细胞替代治疗的临床前研究而备受关注。间充质干细胞分布在体内骨髓和其他组织与器官中，如脂肪组织、脐血，甚至外周血也发现有间充质干细胞 [7-10] 。 目前，骨髓间充质干细胞是最常用的种子细胞，但其数量和分化潜能随着年龄的增长显著减少 和降低[11-13]，并且取材时易对供体造成身体伤害。因此，非常有必要寻找新的自体和异体移植的细胞来源。这种新的细胞除了必须具备骨 髓间充质干细胞有更强的增殖力和多向分化潜能的特点外，还必须取材便利，不易造成病毒污染，且不受伦理道德限制等。 脐带由中胚层发育而来，是胎儿时期连接胎儿和母体的索状结构，外由羊膜包被，内有两条动脉和一条静脉及血管周围富含蛋白多糖和黏多糖的组织组成[14]。分娩后的脐带一直都被当废弃物丢弃，近年来因寻求更多来源的成体干细胞而受到关注。自Mitchell 等[15]提出

间充质干细胞培养方法

间充质干细胞培养方法 1. 间充质干细胞MSC基本形态 2. 干细胞应用与干细胞调控。 3. 间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境 5. 细胞培养板的选择 6. 如何选用细胞培养基 7. 如何维持培养液p H 8. 血清与干细胞的培养 9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活 10. 细胞的细菌、真菌污染及排除 11. 细胞培养污染的预防 12. 使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么 13. 胶原酶的种类和选型 14. 胶原酶V S胰酶 15. 干细胞的种类和表面标记 16. 间质干细胞培养原理概述 17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化 18. 干细胞老化的表现和处理 19. 细胞传代消化过程指导 20. 冷冻保护剂作用和选择 21. 细胞冻存指导 22. 干细胞冷冻和复 23. 移植细胞的基因修饰 1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞调控因子的制约。 （1）胞蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。

脐带间充质干细胞培养方法

(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.sodocs.net/doc/b115414862.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.sodocs.net/doc/b115414862.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化

17.1.9间充质干细胞移植治疗系统系性硬皮病

间充质干细胞移植治疗系统系性硬皮病 对一名安省的硬皮病（scleroderma）的患者来说，一个实验性的干细胞治疗方式为其健康状况带来180度的转变。安省圣托马斯（St. Thomas）的49岁居民慕斯卡特（Dan Muscat，图）于2014年患上系统性硬皮病，由于他皮肤胶原增生，导致他全身皮肤变硬变紧。作为一名珠宝商，他的工作也变得困难而痛苦。 他说：我的手卷成一团并且僵硬，我的脸上和脖子上的皮肤都变硬，我无法转动我的脖子，甚至不能转动身躯。步行超过20步几乎变得不可能。」他还失去了开车的能力，因为他的膝盖不能弯曲，无法踩到刹车或者油门。 之前没有任何治疗方法可以阻止这一疾病的发展。他的医生认为他只有几个月的活命时间。导致这种自身免疫性疾病原因不清楚，而疾病最终会袭击肺部和其他内脏。 慕斯卡特开始研究在加拿大、美国和欧洲进行的干细胞治疗测试。他通过加拿大干细胞基金会（Canadian Stem Cell Foundation）找到了艾金斯医生（Dr. Harry Atkins），艾金斯是渥太华医院（Ottawa Hospital）的干细胞治疗专家，他愿意为慕斯卡特治疗。 艾金斯表示，对于合适的病人来说，这一治疗方法确实对改善他们的生活质量有重要影

响。一旦免疫系统能够正常运作并且停止损伤皮肤，皮肤就会自愈。为硬皮病做干细胞移植在加拿大还是很新的事物。其他国家特别是在欧洲对此作出很多研究，而效果令人鼓舞。艾金斯医生曾经为其他自身免疫性疾病做过干细胞移植，例如多发性硬化病、僵硬人综合症、重症肌无力等。 慕斯卡特是加拿大首个运用在美国和欧洲得到测试的治疗方法的病例。该治疗方法从去年6月开始，医生们从慕斯卡特身上获取干细胞。然后使用强效的化疗药物，杀死导致他出现硬皮病的失效免疫系统。经过淨化的干细胞重新植入他身体内，目标是重新启动他的免疫系统，以便能够停止他的疾病。 慕斯卡特说，自从接受治疗以来，身体一天天好起来。他发现从6月以来，他的动作有所改善，紧绷情况已经消失。他逐渐可以恢复使用自己双手，现在又可以开始驾驶他心爱的赛车。 加拿大干细胞基金会的总裁兼首席执行官普莱斯（James Price）表示，对那些目前没有其他治疗方法的多种疾病患者来说，干细胞治疗能够给他们带来希望。普莱斯说，基金会的目标是能够在10年内令新的干细胞治疗方法得到运用。 该基金会指出，有证据显示，干细胞移植可以令其他严重自身免疫性疾病例如多发性硬化病、狼疮、类风湿关节炎等疾病的情况得到持续缓解。干细胞疗法现在也正在被研究用于治疗肌萎缩性侧索硬化、感染性休克、骨关节炎、糖尿病、黄斑变性等疾病。 在慕斯卡特的病情明显缓和之后，加拿大的其他干细胞治疗中心将会考虑为那些符合相关治疗条件的硬皮病患者提供这种治疗方法，为其他遭受这一疾病折磨的病人们带来希望。

骨髓间充质干细胞的分离与培养

骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提要:目的摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果以选用4～24ｈ贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ｍｌ的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4ｄ进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＭＳＣ),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道ＭＳＣ在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1材料与方法 1.1骨髓ＭＳＣ的分离从胸骨无菌抽取约1～2ｍｌ的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ｍｌ,混匀,1200ｒ/ｍｉｎ,离心10ｍｉｎ;弃上清,用0.01ｍｏｌ/Ｌ的ＰＢＳ(ｐＨ7.2)洗2～3次,1200ｒ/ｍｉｎ,各离心10ｍｉｎ;计数,以2×109/ｍｌ种入10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基,青霉素100Ｕ/ｍｌ、链霉素100μｇ/ｍｌ,37℃,5%ＣＯ2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01ｍｏｌ/ＬＰＢＳ(ｐＨ7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基。 1.2不同贴壁时间对ＭＳＣ增殖的影响选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72ｈ的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3不同浓度胎牛血清(ＦＢＳ)对ＭＳＣ生长的影响细胞按4×104/ｍｌ种入96孔培养板中,分别加入以下ＦＢＳ浓度的α ＭＥＭ培养基:0%、1%、 2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48ｈ后,加入20μｌＭＴＴ(5ｍｇ/ｍｌ二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4ｈ;尽量吸掉上清液,加入150μｌ二甲基亚砜,室温振荡10ｍｉｎ,ＨＴ7000ｐｌｕｓ多孔读数仪490ｎｍ处读取Ｄ490值,以培养液作空白对照。 1.4比较不同种植密度对ＭＳＣ生长的影响用含10%ＦＢＳ的α ＭＥＭ培养基;细胞按以下密度(×104/ｍｌ):0.3、0.6、1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48ｈ后,按上述方法测其Ｄ490值。 1.5培养细胞生长曲线细胞按0.5×104/ｍｌ种入24孔培养板,每孔培养液为1ｍｌ,每天取3孔测其Ｄ490值,连续测8ｄ,绘出培养细胞生长曲线。 1.6培养细胞分裂指数曲线按检测细胞生长曲线的细胞密度接种于放有小盖玻片的24孔培养板中,每24ｈ取出3块小玻片,连续8ｄ;用95%酒精固定,ＨＥ染色、封片。对每一时间组细胞进行计数,算出1000个细胞中分裂相细胞的百分比。 1.7ＭＳＣ的形态学观察在倒置显微镜下,直接观察第2、4、8代ＭＳＣ的活体形态;并分别用光镜及透射电镜观察其形态结构。 1.8统计学分析用哈佛统计软件,进行单因素方差分析及均数间的显著性差异检验,用Ｍｉｃｒｏｓｏ

骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一)

骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一) 作者：吴晓林,李冬民,马德茂,张晓田,黄石,宋天保 【关键词】骨髓 【Abstract】AIM:Tostudythedifferentiationcharacteristicsandtheoptimaldosageandtimingforbromodeoxyuridi ne(Brdu)labelingofratbonemarrowderivedmesenchymalstemcells(MSCs)invitro.METHODS:Therat marrowstemcellsisolatedbyusingPercoll(1.073kg/L)wereculturedandproliferated.Thethirdpassage cellswereinducedwithdexamethasome,βglycerophosphate,ascorbicacid2phosphate,IGF1andinsuli n.Onday21,thecellswereanalyzedbyimmunohistochemistryfortypeⅠcollagenandbyhistochemistry foralkalinephosphatase(AKP).ThepurifiedMSCswereincubatedwithBrduatdifferentconcentrations( 5,10and15μmol/L)fordifferenttimeperiods(12，24，48，72and96h),followedbyimmunohistochemistryforBrdutoidentifytheoptimalBrduconcentrationandi ncubationtimeperiod.RESULTS:Afterincubationfor21dforinduceddifferentiationintoosteoblasts,ty peⅠcollagenandAKPwerepositivelyexpressed.Theincubationwith10μmol/LBrdufor72hachievedov er98%ofthelabelingratewithoutproducingobviouscelldamages.CONCLUSION:MSCscanbeinducedt odifferentiateintoosteoblastsundercertainconditionsinvitro.TheoptimalBrdulabelingconcentration andtimeperiodare10μmol/Land72h,respectively. 【Keywords】MSCs;induceddifferentiation;osteoblast;Brdu 【摘要】目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外的诱导分化及5溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记MSCs的可行性.方法：利用密度为1.073kg/L的percoll分离骨髓的单个核细胞，体外培养与扩增MSCs；取生长良好的第3代细胞，用成骨细胞分化培养液培养21d，Ⅰ型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶（AKP）组化染色；分别以浓度为5，10和15μmol/L的Brdu溶液标记MSCs，孵育12，24，48，72和96h后免疫组化检测Brdu，确定最佳标记量和最佳标记时间.结果：诱导分化第21日,AKP染色呈强阳色,Ⅰ型胶原免疫染色呈阳性.10μmol/LBrdu 标记MSCs的效果最好，随着孵育时间的延长，Brdu标记率逐渐增高，标记72h后标记率在90%以上.结论：MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化为成骨细胞，用Brdu标记MSCs的最佳浓度为10μmol/L，最佳时间是72h. 【关键词】骨髓间充质干细胞；诱导分化；成骨细胞；5溴脱氧尿嘧啶核苷 0引言 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞.因MSCs取材方便、对机体的损伤小、具有较强的传代增殖能力和免疫耐受性等特点而受到越来越多的关注.本实验的目的是利用MSCs具有分化潜能的特点，在体外诱导该细胞定向分化为成骨细胞.并用Brdu标记连续传代的MSCs，观察最佳标记时间及标记剂量，从而为追踪Brdu标记的MSCs移植入体内后的存活、生长及分化奠定基础. 1材料和方法 1.1材料健康雄性SD大鼠，体质量55～70g.由西安交通大学医学院实验动物中心提供. 1.2方法 1.2.1大鼠骨髓MSCs的体外分离培养将大鼠引颈处死后置于750mL/L乙醇浸泡约5min，无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨.用PBS冲洗出骨髓细胞，经5mL针管反复吹打制成单细胞悬液，用200目的不锈钢网过滤，收集滤液.在密度为1.073kg/L的percoll（Phamacia）分离液上缓慢加入收集的滤液，2500r/min离心20min，收集滤液与分离液之间的白膜层细胞，用DMEM（Gibco）洗涤两次，1000r/min离心5min.用加有100mL/L胎牛血清（杭州四季青公司）的DMEM重悬细胞，1×108个/L种于两个直径为6cm的培养皿中培养，2d后更换培养液，加入完全培养基.并将吸出的旧培养液分别移入另两个平皿中继续培养，再过2d更换

骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究进展

３７８陕西中医２０１０年第３１卷第３期 药杂志，２００４，３２（３）：１８０—１８２， ［７３金静愉，郁仁存．乳腺癌中西医结合诊治方案口］．中国肿瘤，１９９５，４（５）：７－１０。 ［８］刘胜，吴雪卿，陈前军．４０７乳腺癌术后患者辨证分型规律探析口］．辽宁中医杂志，１９９９，２６（９）：３８７—３８８．［９］唐汉钧，高尚璞，郑勇．中医药治疗乳腺癌术后２８８例临床观察口］．上海中医药大学报，２００２，１６（３）：２３．［１０］刘燕珠，王泳，吴丹红，等．中西医结合治疗乳腺癌６８例［Ｊ］．福建中医药，２０００。３１（３）：３０—３１． ［ｎｌ万华，吴雪卿，陆德铭．扶正祛邪在治疗乳腺癌中的运用［Ｊ］．上海中医药大学学报，２００２，１６（１）：３０—３１．［１２］朱华宇，司徒红林．林毅辨治乳腺癌经验撷菁［Ｊ］．辽宁中医杂志，２００７，３４（４）：３９５—３９６． ［１３３武自力．金静愉治疗乳腺癌经验［Ｊ］．四川中医，２００７，２５（８）５—６． ［１４］刘胜，赵倩，刘佳，等．乳腺癌术后方对乳腺癌术后５年复发转移率的影响［Ｊ１．中西医结合学报，２００８，６（１０）：１０００—１００４． ［１５］刘胜，花勇强，孙平，等．乳移平抗乳腺癌术后复发转移的临床研究［Ｊ］．中西医结合学报，２００７，５（２）：１４７—１４９． ［１６］卓斌．乳康汤治疗３６例乳腺癌术后或放、化疗后的临床观察口］．湖南中医学院学报，１９９５，１５（２）：２３． ［１７］陈英．益气养血、清热解毒治疗乳癌术后４１例［Ｊ］．浙江中医学院学报，１９９９，２３（６）：３０１． ［１８］李增战，陈捷，苗文红，等．鹿仙散结汤治疗晚期乳腺癌３０例［Ｊ］．陕西中医，２００７，２８（５）：５２６—５２７． ［１９］喻伟国，程进明．抗癌汤结合化疗治疗肿瘤术后４８例总结口］．湖南中医杂志，２００３，１９（１）：１１—１３． ［２０］李景鹏，贾英杰．贾英杰治疗乳腺癌术后的经验［Ｊ］．湖北中医杂志，２００７，２９（７）：２３． ［２１］黄智芬，刘俊波，陈强松，等．健脾消积汤联合化疗对晚期乳腺癌患者生活质量及免疫功能的影响［Ｊ］．新中医，２００７，３９（５）：８８—８９． ［２２］樊淳理．中药治疗乳腺癌术后化疗患者４１例［Ｊ］．中医杂志，２００６，４７（３）：２２６． ［２３］张卫红．卞卫和教授治疗乳腺癌经验举隅［Ｊ］．南京中医药大学学报，２００７，２３（２）：１２６－１２８． ［２４１黄梅，杨海燕．益气活血汤改善脾虚挟瘀型乳腺癌患者化疗毒副作用的临床研究口］．湖北中医杂志，２００５，２７（７）：９－１０。 ［２５］周明，吴勇华，刘永达．中西医结合治疗晚期乳腺癌１４例分析口］．中国中西医结合杂志，１９９５，１５（４）：２３７．［２６］罗雪冰．益气祛邪汤治疗乳腺癌术后７６例疗效观察［Ｊ］．华夏医学，２００７，（２）：２４７—２４８． ［２７］沈哗华，宋明志，黄雯霰．中西医结合治疗７１例乳腺癌术后患者的疗效分析［Ｊ］．中西医结合学报，２００３，１（１）：３０－３１． ［２８１向丽萍，欧阳恒，肖毅良．菊藻丸抗乳腺癌术后复发转移的临床观察［Ｊ］．中国临床药理学与治疗学，２００２，７（１）：６３—６４． ［２９］王义程，丁凌，鲁志诚．三苯氧胺加中成药治疗绝经后晚期乳腺癌［Ｊ］．肿瘤研究与临床，１９９６，８（４）：２６５．［３０］ＣｏｈｅｎＩ，ＴａｇｌｉａｆｅｒｒｉＭ，ＴｒｉｐａｔｈｙＤ．ＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ口］．ＳｅｍｉｎＯｎｃ０１．２００２，２９（６）：５６３—５６４． ［３１］ＣｕｉＹ，ＳｈｕＸＯ，ＧａｏＹ，ｅｔａｌ．ＵｓｅｏｆｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙａｎｄａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｍｅｄｉｃｉｎｅｂｙＣｈｉｎｅｓｅｗｏｍｅｎｗｉｔｈｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ口］，ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓＴｒｅａｔ．２００４，８５（３）：２６３—２７０． ［３２］刘叙仪，孟松娘．杨敬贤，等．中药Ｒ３对耐阿霉素人乳腺癌细胞ＭＣＦＴａｄｒ多药耐药的逆转ｉ－Ｊ］．中国肿瘤临床，１９９７，２４（５）：３２５—３３０ ［３３１姜晓峰，甄永苏．大黄素逆转肿瘤细胞多药抗药性的作用［Ｊ］．药学学报，１９９９，３４（３）：１６４—１６７． ［３４］ＷａｎｇＬ．ＹａｎｇＣＨ，ＨｏｒｗｉｔｚＳＢ，ｅｔａｌ．Ｒｅｖｅｒｓａｌｏｆｔｈｅｂｕｍａｎｍｕｒｉｎｅｍｕｌｔｉｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｐｃｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅｗｉｔｈｍｅｇｅｓｔｒｏｌａｃｅｔａｔｅ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ．ＣｈｅｍｏｔｈｅｒｐｈａｒｍＡｃｏｌ，１９９４，３４：９６． ［３５３李忠．临床中医肿瘤学［Ｍ］．辽宁科学技术出版社，２００２，１２４—１２５． （收稿２００９—１２—１０；修回２０１０－０１—２４） 骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究进展’秦安清刘黎青△于娜◇周盛年△▲山东中医药大学基础医学院（济南２５０３５５） 【中图分类号】Ｑ２５【文献标识码】Ａ【文章编号】ｌＯＯＯ一７３６９（２０１０）０３～０３７８—０３ ＊山东省科技攻关课题（ＮＯ：２００７ＧＧｌ０００２０１７）；山东省中医药管理局资助课题（ＮＯ：２００７—００６） △通讯作者：刘黎青周盛年 ▲山东大学齐鲁医院神经内科（济南２０００１２） ◇山东省昌乐县中医院（昌乐２６２４００） 骨髓问充质干细胞（ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）又称骨髓基质干细胞，是骨髓细胞中除去造血干细胞（非粘附细胞）之外的细胞部分，作为成体干细胞之一，具有多项分化潜能，能向骨、软骨、肌肉、神经、角膜上皮细胞等中胚层或外胚层组织细胞分化，是组织工程中重要的种子细胞之一，并且具有取材方便，扩增迅速，可自体移植等特点，因 万方数据

人类间充质干细胞库建设与管理规范

SZDB/Z 126—2015 I SZDB/Z 深 圳 市 标 准 化 指 导 性 技 术 文 件 人类间充质干细胞库建设与管理规范 2015 - 02 -06发布 2015-03 -01实施 深圳市市场监督管理局 发布 ICS 07.080 C 04 SZDB/Z 126-2015

SZDB/Z 126—2015 II 目次 前言................................................................................. I II 1 范围 (1) 2 规范性引用文件 (1) 3 术语和定义 (1) 4 生命伦理 (4) 5 人类间充质干细胞库建设 (4) 6 机构设置 (5) 7 操作规范 (6) 8 安全管理 (10) 附录A（资料性附录）供者健康信息采集 (16) 附录B（资料性附录）人类间充质干细胞样本编码规则 (17) 附录C（资料性附录）人类间充质干细胞库整体的操作流程 (18) 参考文献 (19)

SZDB/Z 126—2015 III 前言 本指导性技术文件按GB/T 1.1–2009给出的规则起草。 本标准由深圳市经济贸易和信息化委员会归口。 本标准负责起草单位：深圳华大基因研究院。 本标准主要起草人：周欣、张勇、张曦、冀旭、燕舞、林洁璇、张家文、黄海军、彭冬秀、孙长斌、 杨阳、黎苑杰。 本标准为首次发布。

SZDB/Z 126—2015 人类间充质干细胞库建设与管理规范 1 范围 本标准规定了人体来源间充质干细胞库相关的生命伦理、间充质干细胞库建设、机构设置、操作规范和安全管理的基本方法。 本标准适用于人体来源间充质干细胞库的建设与管理规范。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本 适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB/T 1.1-2009 标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写 GB 2894-2008 安全标志及其使用导则 GB/T 5458-2012 液氮生物容器 GB 7000.2-2008 应急照明灯具安全要求 GB/T 12905-2000 条码术语 GB 13690-2009 化学品分类和危险性公示通则 GB 15258 化学品安全标签编写规定 GB/T 17172-1997 417 条码 GB/T 18347-2001 128 条码 GB/T 18883-2002 室内空气质量标准 GB 19489-2008 实验室生物安全通用要求 GB 19652-2005 放电灯（荧光灯除外）安全要求 GB/T 20269-2006 信息安全技术信息系统安全管理要求 GB/T 22278-2008 良好实验室规范原则 GB/T 27025-2008 检测和校准实验室能力的通用要求 GB 50016-2006 建筑设计防火规范 GB 50034-2004 建筑照明设计标准 GB 50052-2009 供配电系统设计规范 GB 50140-2005 建筑灭火器配置设计规范 GB 50346-2012 实验室建筑技术规范 GB 50351-2005 储罐区防火堤设计规范 AQ 3013-2008 危险化学品从业单位安全标准化通用规范 CNAS-CL05-2009 实验室生物安全认可准则 MH/T 1019-2005 民用航空危险品运输文件 WS/T 224-2002 真空采血管及其添加剂 WHO Third Edition 实验室生物安全手册 3 术语和定义 1