基因水平的关联分析方法_罗旭红
全基因组表达谱分析方法(DGE)
全基因组表达谱分析方法（DGE）----基于新一代测序技术的 技术路线 该方法首先从每个mRNA的3’端酶切得到一段21bp的TAG片段（特异性标记该基因）；然后通过高通量测序，得到大量的TAG序列，不同的TAG序列的数量就代表了相应基因的表达量；通过生物信息学分析得到TAG代表的基因、基因表达水平、以及样品间基因表达差异等信息。技术路线如下： 1、样品准备： a) 提供浓度≥300ng/ul、总量≥6ug、OD260/280为1.8~2.2的总RNA样品； 2、样品制备（见图1-1）： a) 类似SAGE技术，通过特异性酶切的方法从每个mRNA的3’末端得到一段21bp 的特异性片段，用来标记该基因，称为TAG； b) 在TAG片段两端连接上用于测序的接头引物； 3、上机测序： a) 通过高通量测序每个样品可以得到至少250万条TAG序列； 4、基本信息分析： a) 对原始数据进行基本处理，得到高质量的TAG序列； b) 通过统计每个TAG序列的数量，得到该TAG标记的基因的表达量； c) 对TAG进行注释，建立TAG和基因的对应关系； d) 基因在正义链和反义链上表达量间的关系； e) 其它统计分析； 5、高级信息分析： a) 基因在样品间差异表达分析； b) 库容量饱和度分析；
c) 其它分析； 测序优势 利用高通量测序进行表达谱研究的优势很明显，具体如下： 1．数字化信号：直接测定每个基因的特异性表达标签序列，通过计数表达标签序列的数目来确定该基因的表达量，大大提高了定量分析的准确度。整体表达差异分布符合正态分布，不会因为不同批次实验引起不必要的误差。 2．可重复性高：不同批次的表达谱度量准确，能够更准确的进行表达差异分析。 3．高灵敏度：对于表达差异不大的基因能够灵敏的检测其表达差异；能够检测出低丰度的表达基因。 4．全基因组分析，高性价比：由于该技术不用事先设计探针，而是直接测序的方式，因此无需了解物种基因信息，可以直接对任何物种进行包括未知基因在内的全基因组表达谱分析，因此性价比很高。 5．高通量测序：已有数据表明，当测序通量达到200万个表达标签时，即可得到样本中接近全部表达基因的表达量数据，而目前每个样本分析可以得到300 万~600万个表达标签。
全基因组关联分析的原理和方法
全基因组关联分析(Genome-wide association study;GWAS)是应用基因组中 数以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide ploymorphism ，SNP)为分子 遗传标记，进行全基因组水平上的对照分析或相关性分析，通过比较发现影响复杂性状的基因变异的一种新策略。 随着基因组学研究以及基因芯片技术的发展，人们已通过GWAS方法发现并鉴定了大量与复杂性状相关联的遗传变异。近年来，这种方法在农业动物重要经济性状主效基因的筛查和鉴定中得到了应用。 全基因组关联方法首先在人类医学领域的研究中得到了极大的重视和应用，尤其是其在复杂疾病研究领域中的应用，使许多重要的复杂疾病的研究取得了突破性进展，因而，全基因组关联分析研究方法的设计原理得到重视。 人类的疾病分为单基因疾病和复杂性疾病。单基因疾病是指由于单个基因的突变导致的疾病，通过家系连锁分析的定位克隆方法，人们已发现了囊性纤维化、亨廷顿病等大量单基因疾病的致病基因，这些单基因的突变改变了相应的编码蛋白氨基酸序列或者产量，从而产生了符合孟德尔遗传方式的疾病表型。复杂性疾病是指由于遗传和环境因素的共同作用引起的疾病。目前已经鉴定出的与人类复杂性疾病相关联的SNP位点有439 个。全基因组关联分析技术的重大革新及其应用，极大地推动了基因组医学的发展。(2005年, Science 杂志首次报道了年龄相关性视网膜黄斑变性GWAS结果,在医学界和遗传学界引起了极大的轰动, 此后一系列GWAS陆续展开。2006 年, 波士顿大学医学院联合哈佛大学等多个研究机构报道了基于佛明翰心脏研究样本关于肥胖的GWAS结果(Herbert 等. 2006);2007 年, Saxena 等多个研究组联合报道了与2 型糖尿病( T2D ) 关联的多个位点, Samani 等则发表了冠心病GWAS结果( Samani 等. 2007); 2008 年, Barrett 等通过GWAS发现了30 个与克罗恩病( Crohns ' disrease) 相关的易感位点; 2009 年, W e is s 等通过GWAS发现了与具有高度遗传性的神经发育疾病——自闭症关联的染色体区域。我国学者则通过对12 000 多名汉族系统性红斑狼疮患者以及健康对照者的GWAS发现了5 个红斑狼疮易感基因, 并确定了4 个新的易感位点( Han 等. 2009) 。截至2009 年10 月, 已经陆续报道了关于人类身高、体重、 血压等主要性状, 以及视网膜黄斑、乳腺癌、前列腺癌、白血病、冠心病、肥胖症、糖尿病、精神分 裂症、风湿性关节炎等几十种威胁人类健康的常见疾病的GWAS结果, 累计发表了近万篇 论文, 确定了一系列疾病发病的致病基因、相关基因、易感区域和SNP变异。) 标记基因的选择： 1)Hap Map是展示人类常见遗传变异的一个图谱, 第1 阶段完成后提供了 4 个人类种族[ Yoruban ,Northern and Western European , and Asian ( Chinese and Japanese) ] 共269 个个体基因组, 超过100 万个SNP( 约1
随机信号分析习题
随机信号分析习题一 1. 设函数???≤>-=-0 , 0 ,1)(x x e x F x ，试证明)(x F 是某个随机变量ξ的分布函数。并求下列 概率：)1(<ξP ，)21(≤≤ξP 。 2. 设),(Y X 的联合密度函数为 (), 0, 0 (,)0 , other x y XY e x y f x y -+?≥≥=? ?， 求{}10,10<<< 8. 两个随机变量1X ，2X ，已知其联合概率密度为12(,)f x x ,求12X X +的概率密度？ 9. 设X 是零均值，单位方差的高斯随机变量，()y g x =如图，求()y g x =的概率密度 ()Y f y \ 10. 设随机变量W 和Z 是另两个随机变量X 和Y 的函数 22 2 W X Y Z X ?=+?=? 设X ，Y 是相互独立的高斯变量。求随机变量W 和Z 的联合概率密度函数。 11. 设随机变量W 和Z 是另两个随机变量X 和Y 的函数 2() W X Y Z X Y =+?? =+? 已知(,)XY f x y ，求联合概率密度函数(,)WZ f z ω。 12. 设随机变量X 为均匀分布，其概率密度1 ,()0X a x b f x b a ?≤≤? =-???， 其它 （1）求X 的特征函数,()X ?ω。 （2）由()X ?ω，求[]E X 。 13. 用特征函数方法求两个数学期望为0，方差为1，互相独立的高斯随机变量1X 和2X 之和的概率密度。 14. 证明若n X 依均方收敛，即 l.i.m n n X X →∞ =，则n X 必依概率收敛于X 。 15. 设{}n X 和{}n Y (1,2,)n = 为两个二阶矩实随机变量序列，X 和Y 为两个二阶矩实随机变量。若l.i.m n n X X →∞ =，l.i.m n n Y Y →∞ =，求证lim {}{}m n m n E X X E XY →∞→∞ =。 第二篇细胞的遗传物质 第三章基因表达的分析技术 生物性状的表现均是通过基因表达调控实现的。对基因结构与基因表达调控进行研究，是揭示生命本质的必经之路。在基因组研究的过程中，逐步建立起一系列行之有效的技术。针对不同的研究内容，可建立不同的研究路线。 第一节PCR技术 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是一种体外核酸扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便等突出优点。。PCR技术日斟完善，成为分子生物学和分子遗传学研究的最重要的技术。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，并作进一步的分析。 一、实验原理 PCR是根据DNA变性复性的原理，通过特异性引物，完成特异片段扩增。第一，按照欲检测的DNA的5＇和3＇端的碱基顺序各合成一段长约18～24个碱基的寡核苷酸序列作为引物（primer）。引物设计需要根据以下原则：①引物的长度保持在18～24bp之间，引物过短将影响产物的特异性，而引物过长将影响产物的合成效率；②GC含量应保持在45～60%之间；③5＇和3＇端的引物间不能形成互补。第二，将待检测的DNA变性后，加入四种单核苷酸（dNTP）、引物和耐热DNA聚合酶以及缓冲液。通过95℃变性，在进入较低的温度使引物与待扩增的DNA链复性结合，然后在聚合酶的作用下，体系中的脱氧核苷酸与模板DNA链互补配对，不断延伸合成新互补链，最终使一条DNA双链合成为两条双链。通过变性（92～95℃）→复性（40～60℃）→引物延伸（65～72℃）的顺序循环20至40个周期，就可以得到大量的DNA片段。理论上循环20周期可使DNA扩增100余万倍。 随机信号分析常用函数及示例 1、熟悉练习使用下列MATLAB函数，给出各个函数的功能说明和内部参数的意 义，并给出至少一个使用例子和运行结果。 rand()： 函数功能：生成均匀分布的伪随机数 使用方法： r = rand(n) 生成n*n的包含标准均匀分布的随机矩阵，其元素在(0，1)内。 rand(m,n)或rand([m,n]) 生成的m*n随机矩阵。 rand(m,n,p,...)或rand([m,n,p,...]) 生成的m*n*p随机矩数组。 rand () 产生一个随机数。 rand(size(A)) 生成与数组A大小相同的随机数组。 r = rand(..., 'double')或r = rand(..., 'single') 返回指定类型的标准随机数，其中double指随机数为双精度浮点数，single 指随机数为单精度浮点数。 例：r=rand(3,4); 运行结果： r= 0.4235 0.4329 0.7604 0.2091 0.5155 0.2259 0.5298 0.3798 0.3340 0.5798 0.6405 0.7833 randn(): 函数功能：生成正态分布伪随机数 使用方法： r = randn(n) 生成n*n的包含标准正态分布的随机矩阵。 randn(m,n)或randn([m,n]) 生成的m*n随机矩阵。 randn(m,n,p,...)或randn([m,n,p,...]) 生成的m*n*p随机矩数组。 randn () 产生一个随机数。 randn(size(A)) 生成与数组A大小相同的随机数组。 r = randn(..., 'double')或r = randn(..., 'single') 返回指定类型的标准随机数，其中double指随机数为双精度浮点数，single 指随机数为单精度浮点数。 例： 基因表达检测的最终技术目标是能确定所关注的任何组织、细胞的 RNA的绝对表达量。可以先从样本中抽提RNA，再标记RNA， 然后将这些标记物作探针与芯片杂交，就可得出原始样本中不同 RNA的量。然而用于杂交的某个特定基因的RNA的量与在一个 相应杂交反应中的信号强度之间的关系十分复杂，它取决于多种 因素，包括标记方法、杂交条件、目的基因的特征和序列。所以 芯片的方法最好用于检验两个或多个样本中的某种RNA的相对 表达量。样本之间某个基因表达的差异性（包括表达的时间、空 间特性及受干扰时的改变）是基因表达最重要的，而了解RNA 的绝对表达丰度只为进一步的应用或多或少地起一些作用。 基因表达的检测有几种方法。经典的方法（仍然重要）是根据在 细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一 特定基因是否表达。随着大分子分离技术的进步使得特异的基因 产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术的 运用，现在有可能检测．分析任何基因的转录产物。目前有好几 种方法广泛应用于于研究特定RNA分子。这些方法包括原位杂交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打点．S－1核酸酶分 析和RNA酶保护研究。这里描述RT-PCR从RNA水平上检查 基因表达的应用。8 f3 f- |2 L) K) b7 ]- ~- | RT-PCR检测基因表达的问题讨论 关于RT-PCR技术方法的描述参见PCR技术应用进展，在此主要讨论它在应用中的问题。理论上1μL细胞质总RNA对稀有mRNA扩增是足够了（每个细胞有1个或几个拷贝）。1μL差不多相当于50－100，000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含RNA的数量，靶分子的数量通常大于50，000，因此扩增是很容易的。该方法所能检测的最低靶分子的数量可能与通常的DNAPCR相同；例如它能检测出单个RNA分子。当已知量的转录RNA（用T7RNA聚合酶体外合成）经一系列稀释，实验结果表明通过PCR的方法可检测出10个分子或低于10个分子，这是反映其灵敏度的一个实例。用此技术现已从不到1个philadelphia染色体阳性细胞株K562中检测到了白血病特异的MRNA的转录子。因此没必要分离polyA+RNA，RNA/PCR法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需要。 7 H+ F& _* S6 W( a8 p: [, @- d, { 将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应，可简化实验步骤。我们发现整个反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成CDNA，然后PCR缓冲液进行PCR扩增循环。当然，值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一条DNA链的合成。我们对不同的缓冲液用于大片段DNA 合成是否成功还没有进行过严格的研究。 基因组学的研究内容 结构基因组学： 基因定位；基因组作图；测定核苷酸序列 功能基因组学：又称后基因组学（postgenomics基因的识别、鉴定、克隆；基因结构、功能及其相互关系；基因表达调控的研究 蛋白质组学： 鉴定蛋白质的产生过程、结构、功能和相互作用方式 遗传图谱 （genetic map）采用遗传分析的方法将基因或其它dNA序列标定在染色体上构建连锁图。 遗传标记： 有可以识别的标记，才能确定目标的方位及彼此之间的相对位置。 构建遗传图谱 就是寻找基因组不同位置上的特征标记。包括： 形态标记； 细胞学标记； 生化标记；DNA 分子标记 所有的标记都必须具有多态性！所有多态性都是基因突变的结果！ 形态标记： 形态性状：株高、颜色、白化症等，又称表型标记。 数量少，很多突变是致死的，受环境、生育期等因素的影响 控制性状的其实是基因，所以形态标记实质上就是基因标记。 细胞学标记 明确显示遗传多态性的染色体结构特征和数量特征 ：染色体的核型、染色体的带型、染色 体的结构变异、染色体的数目变异。优点：不受环境影响。缺点：数量少、费力、费时、对生物体的生长发育不利 生化标记 又称蛋白质标记 就是利用蛋白质的多态性作为遗传标记。 如：同工酶、贮藏蛋白 优点： 数量较多，受环境影响小 ? 缺点： 受发育时间的影响、有组织特异性、只反映基因编码区的信息 DNA 分子标记： 简称分子标记以 DNA 序列的多态性作为遗传标记 优点： ? 不受时间和环境的限制 ? 遍布整个基因组，数量无限 ? 不影响性状表达 ? 自然存在的变异丰富，多态性好 ? 共显性，能鉴别纯合体和杂合体 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism ， RFLP ） DNA 序列能或不能被某一酶酶切， 基因组测序基础知识 ㈠De Novo测序也叫从头测序，是首次对一个物种的基因组进行测序，用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。 目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种： 1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序； 2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序； 3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序，搭建骨架，再用Illumina Solexa GA IIx 进行深度测序，完成基因组拼接。 采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件，并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究，为后续的相关研究奠定基础。 实验流程： 公司服务内容 1.基本服务：DNA样品检测；测序文库构建；高通量测序；数据基本分析（Base calling，去接头， 去污染）；序列组装达到精细图标准 2.定制服务：基因组注释及功能注释；比较基因组及分子进化分析，数据库搭建；基因组信息展 示平台搭建 1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求？ (1) 对于细菌真菌，样品来源一定要单一菌落无污染，否则会严重影响测序结果的质量。基因组完整无降解(23 kb以上)， OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；每次样品制备需要10 μg样品，如果需要多次制备样品，则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。 (2) 对于植物，样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品，最好为纯合或单倍体。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (3) 对于动物，样品来源应选用肌肉，血等脂肪含量少的部位，同一个体取样，最好为纯合。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (4) 基因组De Novo组装完毕后需要构建BAC或Fosmid文库进行测序验证，用于BAC 或Fosmid文库构建的样品需要保证跟De Novo测序样本同一来源。 2. De Novo有几种测序方式 目前3种测序技术 Roche 454，Solexa和ABI SOLID均有单端测序和双端测序两种方式。在基因组De Novo测序过程中，Roche 454的单端测序读长可以达到400 bp，经常用于基因组骨架的组装，而Solexa和ABI SOLID双端测序可以用于组装scaffolds和填补gap。下面以solexa 为例，对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)进行介绍。Single-read、Paired-end和Mate-pair主要区别在测序文库的构建方法上。 单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flow cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列(图1)。 Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序(图2)。 图1 Single-read文库构建方法图2 Paired-end文库构建方法 随机信号分析 朱华，等北京理工大学出版社2011-07-01 《随机信号分析》是高等学校工科电子类专业基础教材。内容为概率论基础、平稳随机过程、窄带随机过程、随机信号通过线性与非线性系统的理论与分析方法等。在相应的部分增加了离散随机信号的分析。《随即信号分析》的特点侧重在物理概念和分析方法上，对复杂的理论和数学问题着重用与实际的电子工程技术问题相联系的途径及方法去处理。《随即信号分析》配套的习题和解题指南将与《随即信号分析》同期出版。《随即信号分析》适用于电子工程系硕士研究生及高年级本科生，也适用于科技工作者参考。 第一章概率论 1.1 概率空间的概念 1.1.1 古典概率 1.1.2 几何概率 1.1.3 统计概率 1.2 条件概率空间 1.2.1 条件概率的定义 1.2.2 全概率公式 1.2.3 贝叶斯公式 1.2.4 独立事件、统计独立 1.3 随机变量及其概率分布函数 1.3.1 随机变量的概念 1.3.2 离散型随机变量及其分布列 1.3.3 连续型随机变量及其密度函数 1.3.4 分布函数及其基本性质 1.4 多维随机变量及其分布函数 1.4.1 二维分布函数及其基本性质 1.4.2 边沿分布 1.4.3 相互独立的随机变量与条件分布 1.5 随机变量函数的分布 1.5.1 一维随机变量函数的分布 1.5.2 二维随机变量函数的分布 1.5.3 二维正态随机变量函数的变换 1.5.4 多维情况 1.5.5 多维正态概率密度的矩阵表示法 1.6 随机变量的数字特征 1.6.1 统计平均值与随机变量的数学期望值 1.6.2 随机变量函数的期望值 1.6.3 条件数学期望 1.6.4 随机变量的各阶矩 1.7 随机变量的特征函数 1.7.1 特征函数的定义 1.7.2 特征函数的性质 全基因组关联分析(GWAS)解决方案 ※ 概述 全基因组关联研究（Genome-wide association study，GWAS）是用来检测全基因组范围的遗传变异与 可观测的性状之间的遗传关联的一种策略。2005年，Science杂志报道了第一篇GWAS研究——年龄相关性黄 斑变性，之后陆续出现了有关冠心病、肥胖、2型糖尿病、甘油三酯、精神分裂症等的研究报道。截至2010年 底，单是在人类上就有1212篇GWAS文章被发表，涉及210个性状。GWAS主要基于共变法的思想，该方法是 人类进行科学思维和实践的最重要工具之一；统计学研究也表明，GWAS很长时期内都将处于蓬勃发展期（如 下图所示）。 基因型数据和表型数据的获得，随着诸多新技术的发展变得日益海量、廉价、快捷、准确和全面：如 Affymetrix和Illumina公司的SNP基因分型芯片已经可以达到2M的标记密度；便携式电子器械将产生海量的表型 数据；新一代测序技术的迅猛发展，将催生更高通量、更多类别的基因型，以及不同类别的高通量表型。基于 此，我们推出GWAS的完整解决方案，协助您一起探索生物奥秘。 ※ 实验技术流程 ※ 基于芯片的GWAS Affymetrix公司针对人类全基因组SNP检测推出多个版本检测芯片，2007年5月份，Affymetrix公司发布了 人全基因组SNP 6.0芯片，包含90多万个用于单核苷酸多态性（SNP）检测探针和更多数量的用于拷贝数变化（CNV）检测的非多态性探针。因此这种芯片可检测超过180万个位点基因组序列变异，即可用于全基因组 SNP分析，又可用于CNV分析，真正实现了一种芯片两种用途，方便研究者挖掘基因组序列变异信息。 Illumina激光共聚焦微珠芯片平台为全世界的科研用户提供了最为先进的SNP（单核苷酸多态性）研究平 台。Illumina的SNP芯片有两类，一类是基于infinium技术的全基因组SNP检测芯片（Infinium? Whole Genome Genotyping），适用于全基因组SNP分型研究及基因拷贝数变化研究，一张芯片检测几十万标签SNP位点，提 供大规模疾病基因扫描(Hap660,1M)。另一类是基于GoldenGate?特定SNP位点检测芯片，根据研究需要挑选SNP位点制作成芯片(48-1536位点)，是复杂疾病基因定位的最佳工具。 罗氏NimbleGen根据人类基因组序列信息设计的2.1M超高密度CGH芯片，可以在1.1Kb分辨率下完成全基 因组检测，可有效检测人基因组中低至约5kb大小的拷贝数变异。 全基因组重测序数据分析 1. 简介(Introduction) 通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排 突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使 得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。我们将在基因组 学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。 实验设计与样本 （1）Case-Control 对照组设计； （2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）； 初级数据分析 1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。 2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基 因组信息对检测到的变异进行注释。 4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需 要3个Paired-End序列的支持。 5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。根据测序个体序列与参考基因组序列比对分析结果，检测全基因组水平的结构变异并对检测到的变异进行注释。 概率论基础 1.概率空间、概率（条件概率、全概率公式、贝叶斯公式） 2．随机变量的定义（一维、二维实随机变量） 3.随机变量的描述： ⑴统计特性 一维、二维概率密度函数、一维二维概率分布函数、边缘分布 概率分布函数、概率密度函数的关系 ⑵数字特征 一维数字特征：期望、方差、均方值（定义、物理含义、期望和方差的性质、三者之间的关系） 二维数字特征：相关值、协方差、相关系数（定义、相互关系） ⑶互不相关、统计独立、正交的定义及其相互关系 4.随机变量函数的分布 △雅柯比变换（随机变量函数的变换一维随机变量函数的单值和双值变换、二维随机变量函数的单值变换） 5、高斯随机变量 一维和二维概率密度函数表达式 高斯随机变量的性质 △随机变量的特征函数及基本性质 、 随机信号的时域分析 1、随机信号的定义 从三个方面来理解①随机过程(),X t ζ是,t ζ两个变量的函数②(),X t ζ是随时间t 变化的随机变量③(),X t ζ可看成无穷多维随机矢量在0,t n ?→→∞的推广 2、什么是随机过程的样本函数？什么是过程的状态？随机过程与随机变量、样本函数之间的关系？ 3、随机信号的统计特性分析：概率密度函数和概率分布函数（一维、二维要求掌握） 4、随机信号的数字特征分析（定义、物理含义、相互关系） 一维：期望函数、方差函数、均方值函数。（相互关系） 二维：自相关函数、自协方差函数、互相关函数、互协方差函数（相互关系） 5、严平稳、宽平稳 定义、二者关系、判断宽平稳的条件、平稳的意义、联合平稳定义及判定 6、平稳随机信号自相关函数的性质： 0点值，偶函数，均值，相关值，方差 7、两个随机信号之间的“正交”、“不相关”、“独立”。 （定义、相互关系） 8、高斯随机信号 定义（掌握一维和二维）、高斯随机信号的性质 9、各态历经性 定义、意义、判定条件（时间平均算子、统计平均算子）、平稳性与各态历经性的关系直流分量、直流平均功率、总平均功率、交流平均功率 随机信号的频域分析 1、随机信号是功率信号，不存在傅里叶变换，在频域只研究其功率谱。 功率谱密度的含义，与总平均功率的关系 2、一般随机信号功率谱计算公式与方法 3、平稳随机信号的功率谱密度计算方法 全基因组关联分析（Genome-wide association study,GWAS) 是一种对全基因组范围内的常见遗传变异: 单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism , SNP) 进行总体关联分析的方法, 即在全基因组范围内选择遗传变异进行基因分型, 比较病例和对照间每个变异频率的异差, 计算变异与疾病的关联强度, 选出最相关的变异进行验证并最终确认与疾病相关。 单核苷酸多态性（英语：Single Nucleotide Polymorphism，简称SNP，读作/snip/）指的是由单个核苷酸—A,T,C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。 在后GWAS时代，利用已有的GWAS数据在多个人群间进行meta分析已经成为一种常用的分析手 段，这不仅可以进一步扩大样本量，更重要的是提高了统计效能。GWAS meta分 析已经成功应该用在多种复杂疾病的遗传学研究，发现一批新的易感基因。 全基因组关联水平（P_meta < 5.0×10-8）罕见等位基因（MAF < 5％）， 基因型填补（imputation）：依据已分型位点的基因型对数据缺失位点或未分型位点进行基因型预测的方法。可用于精细定位（fine-mapping），填补已确认的关联位点附近的位点，以便评价相邻SNP位点的关联证据。加快复杂性疾病易感基因的定位。 连锁与连锁不平衡（linkage disequilibrium,LD）: 连锁：如果同一条染色体上2个位点的位置比较近，则这2个位点上的等位基因倾向于一起传递给下一代。 连锁不平衡：又称等位基因关联，是指同一条染色体上，两个等位基因间的非随机相关。即当位于同一条染色体上的两个等位基因同时存在的概率大于人群中因随机分布而同时出现的概率时，就称这两个位点处于LD状态。所谓的连锁不平衡是一种遗传标记的非随机性组合。比如，一个基因有两个位点，一个位点有两种基因型，那么子代应该有2的2次方，即4种基因型。但是发现子代的基因型往往会少于4种，这就是连锁不平衡现象。这是由于两个位点距离较近引起的两个位点上的等位基因经常同时出现在同一染色体上。 万方数据 万方数据 ７０８ 图ｌＭＤＲ基本步骤示意图 划分为不同的分类，也就是图中的单元格。单元格中左侧直方图表示病例，右侧直方图表示对照。 第４步：在ｎ维的每个多因子分类（单元格）中，计算病例数和对照数的比值，若病例数与对照数之比达到或超过某个阈值（例如≥１），则标为高危，反之则为低危。这样就把ｎ维的结构降低到一维两水平。 第５步：多因子分类的集合中包含了ＭＤＲ模型中各因子的组合。在所有的两因子组合中，选择错分最小的那个ＭＤＲ模型，该两位点模型在所有模型中将具有最小的预测误差。 第６步：通过十重交叉验证评估模型的预测误差，一以及单元格分配时的相对误差。也就是说，模型拟合９／１０的数据（训练样本），其预测误差将通过剩下１／１０的数据（检验样本）来衡量。选择预测误差最小的模型作为最终的模型，取ｌＯ次检验的预测误差平均值，作为模型相对预测误差的无偏估计。由于数据分组的方式对交叉验证的结果影响较大，因此，十重交叉验证过程将重复进行１０次，对ｎ个因子可能的集合将重复进行１０×１０次的交叉验证。 通过十重交叉验证，在一定程度上可以避免因数据转换的偶然性，使Ｉ类错误增大而产生假阳性结果的影响。预测误差是衡量ＭＤＲ模型在独立检验的亚组中预测危险状态的指标，通过十重交叉验证的亚组中每一个的预测误差的平均值来计算。根据交叉验证的预测误差的平均值，选择最佳的Ｔｌ因子模型，并根据不同的因子数重复以上过程。最终筛选出最有可能存在交互作用的基因。 ＭＤＲ的优势在于不需要考虑疾病的遗传模型，它利用计算机运算速度快的优势，对多个基因进行随机组合，按照上述方法找出存在交互作用的基因位点。但当主效应存在时，用ＭＤＲ方法很难得到最终模型，且同样受遗传异质性的影响；它只是一种数据挖掘方法，不是严格意义上的统计方法，还无法判断它的Ｉ类错误和检验功效。 ＭＤＲ分析软件包可在ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｉｓｔａｓｉｓ．ｏｒｇ／ｍｄｒ．ｈｔｍｌ免费下载。 ４基于复合ＬＤ的交互作用分析法 吴学森等Ⅲ’提出基于复合ＬＤ的交互作用的分析法。该方法以病例一对照试验设计为基础，基于ＬＤ计算方法，构建完全有别于以上方法的一种新型基因间交互作用的统计分析方法：（１）用两个位点（基因）单倍型的外显率（只。）与等位基因的边际外显率的乘积（Ｐａ?Ｐ。）的偏差（６．口＝ＰＡ。一只?Ｐ８），分别定义病例组和对照组两个位点交互作用的度量．进而综合两组交互作用度量构造检验交互作用的统计量；（２）对于基因一环境交互作用模型的构建，则将环境（分类型变量）变量视为“虚拟位点”（例如Ｅ＝ｌ表示环境暴露。Ｅ＝０表示即非暴露），则同样依据上述方法构建其模型。４．１基因型数据的联合概率分布及其表达对于基因之间、基因与环境之间的交互作用统计量的构建，无论是二阶或高阶情形，均至少涉及两个变量。在本研究中，均以病例一对照试验设计为基础，个体的基因数据一律用其基因型表示。无论是病例组还是对照组，均设两个位点的等位基因分别为Ａ，ａ；Ｂ，ｂ，则它们的联合基因型分布可表述为表３的形式： 则．配子的ＬＤ系数为：６．。＝％一ＰＡＰ。；非配子的ＬＤ系数为：乳口＝九日一只－匕，其中，Ｐ．ｅ＝尸竺＋ＰＡＢ舳＋碟＋Ｐ竺；ＪＤ∥。＝Ｐ竺＋Ｐ竺＋Ｐ：：＋形：。但是，当计算病例组或对照组的６．。时，需要知道双杂合子的概率Ｐ苫、Ｐ：：。然而。当它们的相未知时，则无法确定其值，只能进行单倍型推断。由于单倍型推断总是存在误差，这给后面构造的检验交互作 用的统计量带来很多不确 万方数据 利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量 METHODS 25, 402–408 (2001) Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitati ve PCR and the 2－△△CT Method Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen?,1 *Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ? Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534 摘要： 现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量P CR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。 关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman 反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。实时定量 P CR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。 绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。 第八章基因组学分析 基因组（Genome）指一个生物体中所有的遗传信息的载体DNA。原核生物基因组与真核生物基因组有着很大的区别，原核生物的基因组比较简单，一般由一条染色体（有些细菌有多条染色体）和若干个质粒组成。除少数细菌外，细菌的染色体一般由一条环状双链DNA组成。染色体高度折叠、盘绕聚集在一起，形成致密的类核(nucleoid)，类核无核膜与胞浆分开，类核的中央部分由RNA和支架蛋白组成，外围是双链闭环的DNA超螺旋（图8-1）。染色体DNA链上与DNA复制、转录有关的信号区域优先与细胞膜结合，连接点的数量随细菌生长状况和不同生活周期而异。这种连接有助于细胞膜对染色体的固定，并在细胞分裂时将染色体均匀的分配到子代细胞中。 图8-1：大肠杆菌染色体DNA的类核结构，中间实心圆为中央类核，四周的为DNA环。 从1995年美国基因组研究所（The Institute for Genomic Research, TIGR）发表第一株细菌——流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae RD）的全基因组序列以来，现已发表了150多株细菌的基因组全序列(表8-1)，其中包括古细菌和真细菌，既有病源微生物也有非病源微生物。这些已完成全基因组测序的细菌很具代表性，有在极端条件下生长的嗜热菌，耐盐菌，耐酸菌；有厌氧菌，兼性厌氧菌和需氧菌；有营养要求不高的大肠杆菌，较难培养的枝原体，只在活细胞内生存的衣原体和立克次体。在未来的几年时间里，还将有更多株原核生物的基因组全序列被测序，预示着原核生物基因组研究将对21世纪的生命科学研究中起着推波助澜的作用。 第一节微生物基因组概述 1、基因组大小 曾经有很多方法用于细菌基因组大小的研究，包括比色法、DNA复性动力学、酶切片段的二维胶电泳，这些方法现在都已经被脉冲场电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE）技术所取代。虽然原核生物的基因组大小相对比真核生物要小，但是最大的原核生物基因组碱基数与最小的真核生物基因组碱基数大小有部分重叠（图8-2）。细菌的基因组大小相差也很大，目前已知完成全基因组序列测定的细菌中，基因组最小的生殖道支原体（Mycopalsma genitalium）只有0.58 Mb，最大的日本慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum USDA 110）有9.11 Mb（表8-1）。 2、编码密度高 与真核生物不同，原核生物基因组的编码序列占基因组总序列的比率很高，达90％左右。如果基因的 高等真核生物的基因组一般具有80 000～100 000个基因，而每一个细胞大约只表达其中的15%［1］。基因在不同细胞间及不同生长阶段的选择性表达决定了生命活动的多样性，如发育与分化、衰老与死亡、内环境稳定、细胞周期调控等。比较细胞间基因表达的差异为我们揭示生命活动的规律提供了依据。 由于真核细胞mRNA 3′端一般含有Poly（A）尾，因此现有的方法基本上都是利用共同引物将不同的mRNA反转录成cDNA，以cDNA为对象研究基因表达的差异。1992年Liang等［2］建立了一种差异显示反转录PCR法（differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR），为检测成批基因表达的差异开辟了新天地。迄今为止已出现了大量应用该技术的研究报道［3，4］。然而，尽管应用DDRT-PCR方法已经取得了不少成果，而且该方法还在不断改进之中，但它仍然存在几个难以解决的问题：(1) 重复率低，至少有20%的差异条带不能被准确重复［5］；(2) 假阳性率可以高达90%［6］；(3) 获得的差异表达序列极少包含编码信息。近年来，针对DDRT-PCR方法的不足，又有几种新的检测差异表达基因的方法出现，现仅就这方面的进展做一简要介绍。 1.基因表达指纹（gene expression fingerprinting，GEF）：GEF技术使用生物素标记的引物Bio-T13合成cDNA第一链，用dGTP对其进行末端加尾，再以富含C的引物引发合成cDNA第二链。用限制性内切酶消化双链cDNA，以交联有抗生物素蛋白的微球捕获cDNA3′端，以T4DNA连接酶连接同前述内切酶相对应的适配子，并以Bio-T13及适配子中的序列作为新的引物进行特异的PCR 扩增，得到大量的特异cDNA片段。适配子末端被32P-dATP标记后，固定于微球上的cDNA片段经过一系列酶切，产生的酶切片段从微球表面释放出来，其中那些含有标记末端的片段经凝胶电泳后构成mRNA指纹图谱。通过分析不同细胞间的指纹图谱就能得到差异表达的序列［7］。GEF技术所需的工作量较DDRT-PCR明显减少，由于用酶切反应替代了条件不严格的PCR反应，其重复性也较好，假阳性率低，并且所获得的片段中包含有一定的编码信息。GEF技术最大的缺点在于电泳技术的局限。由于它的指纹图谱要显示在同一块电泳胶上，经过几轮酶切之后常会得到1 000～2 000条电泳带，而现有的PAGE电泳很少能分辨超过400条带，故只有15%～30%的mRNA能够被辨认出来，因此得基因表达的分析技术
matlab随机信号分析常用函数
基因表达的检测的几种方法
基因组学的研究内容
高通量测序生物信息学分析(内部极品资料,初学者必看)
随机信号分析
全基因组关联分析(GWAS)解决方案
全基因组重测序数据分析
《随机信号分析基础》总复习提
全基因组关联分析
基于全基因组关联分析的基因(环境)交互作用统计学方法进展
利用实时定量PCR和2-△△CT法分析基因相对表达量
基因组学分析
基因表达差异分析方法进展